靶向递送携带HIF-2α siRNA的阳离子脂质体抑制肾透明细胞癌生长

目的:探索靶向缺氧诱导因子-2α(hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α)的阳离子脂质体-siRNA复合物（liposome-siRNA,Lipo-siRNA）是否可以有效干扰HIF-2α的表达并抑制肾透明细胞癌的生长。方法:使用ZetaSizer Nano及电镜鉴定Lipo-siRNA,荧光显微镜观察脂质体介导的siRNA转染786-O细胞的情况,CCK-8检测Lipo-siRNA对786-O细胞的抑制能力,Western blot检测Lipo-siRNA对HIF-2α表达的影响,活体成像检测Lipo-FAM-siRNA的体内转染情况,裸鼠皮下移植瘤模型检测Lipo-siRNA对肿瘤生长的抑制情况。结果:Zata电位、粒径大小及电镜观测结果均表明Lipo-siRNA构建成功;荧光显微镜观察表明脂质体可以有效介导FAM-siRNA对786-O细胞的转染（P＜0.05）;CCK-8实验表明Lipo-siRNA可以显著沉默HIF-2α表达（P＜0.01）并抑制786-O细胞的增殖（P＜0.05）;活体成像结果显示Lipo-siRNA可以显著富集于肿瘤部位（P＜0.001）;裸鼠皮下移植瘤模型显示Lipo-siRNA可以有效降低肿瘤组织中HIF-2α的表达（P＜0.05）,并抑制肿瘤生长（P＜0.05）。结论:携带靶向HIF-2α siRNA的阳离子脂质体可以在裸鼠体内外水平显著干扰HIF-2α的表达,抑制肾透明细胞癌细胞的生长,具有治疗肾透明细胞癌的潜力。     

肺癌患者肿瘤浸润淋巴细胞中IL-17的分布特征及临床意义

目的:探讨肺癌患者肿瘤浸润淋巴细胞中IL-17的分布特征及其临床意义。方法:流式细胞术检测15例肺癌组织和15例配对远癌正常组织中浸润淋巴细胞的IL-17表达水平。结果:肺癌患者肿瘤组织浸润淋巴细胞中IL-17A显著高于远癌正常组织（P＜0.000 1）,肿瘤组织中浸润产生IL-17的CD3+CD4+T细胞（Th17）（P＜0.001）、CD3+CD8+T细胞（Tc17）（P＜0.001）、γδT细胞（γδT17）(P＜0.000 1)均高于远癌正常组织;肺癌患者肿瘤组织浸润Th17和Tc17水平无明显差异（P＞0.05）,而γδT17水平显著高于Th17（P＜0.001）和Tc17（P＜0.000 1）;肿瘤组织中浸润的γδT17表达水平和淋巴结转移相关（P＜0.05）。结论:IL-17和肺癌发生相关,其早期主要来源是肿瘤浸润的γδT细胞;γδT17数量与淋巴结转移有关,提示γδT17细胞可能参与肺癌病程的进展。     

通过溶瘤病毒靶向递送BiTE引发骨肉瘤局部抗肿瘤免疫的实验研究

目的:探索共表达双特异性T细胞接合器（bispecific T cell engager,BiTE)的VSVΔ51溶瘤病毒对骨肉瘤的抗肿瘤活性。方法:将BiTE的全长序列克隆到病毒糖蛋白和聚合酶基因之间产生VSVΔ51/BiTE溶瘤病毒;使用小鼠异源移植瘤模型评估VSVΔ51/BiTE的肿瘤抑制活性;通过免疫组化检测肿瘤组织的T细胞浸润情况;通过流式细胞术检测肿瘤浸润T细胞的激活状态。结果:成功构建VSVΔ51/BiTE溶瘤病毒,并通过Western blot验证其可以表达BiTE;体内抑瘤实验结果显示,VSVΔ51/BiTE较VSVΔ51的肿瘤抑制能力更强（P＜0.000 1）;免疫组化结果表明,VSVΔ51/BiTE治疗后肿瘤浸润T细胞的数量较VSVΔ51治疗组显著增多（P＜0.000 1）;流式检测结果表明,VSVΔ51/BiTE治疗可以有效增强肿瘤浸润T细胞的增殖能力（P＜0.001）,并提高了CD107a的表达水平以及干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）的分泌水平（P＜0.000 1）。结论:溶瘤病毒VSVΔ51/BiTE可以显著抑制小鼠骨肉瘤的生长,同时激活肿瘤部位的抗肿瘤免疫反应,是一种非常有希望的骨肉瘤治疗策略。     

共表达BiTE的溶瘤病毒对胶质瘤的抗肿瘤活性研究

目的:探索编码BiTE的溶瘤病毒［分泌双特异性T细胞衔接器的单纯性孢疹病毒（herpes simplex virus-Bi-specific T-cell engagers,HSV-BiTE）］是否可以对胶质瘤产生显著的抗肿瘤活性。方法:荧光显微镜观察及Western blot检测HSV-BiTE对胶质瘤细胞U118的感染能力及BiTE的表达情况;流式细胞术检测HSV-BiTE感染后U118的凋亡情况;小鼠移植瘤模型验证HSV-BiTE的体内抑瘤活性;免疫组化法检测肿瘤组织中Ki67和Cleaved Caspase3(Cl-Cas3)的表达;流式细胞术检测肿瘤浸润T细胞中IFN-γ和Granzyme B的表达情况。结果:HSV-BiTE可以有效感染U118细胞并表达BiTE;感染HSV-BiTE可以显著诱导U118细胞凋亡（P＜0.001）;HSV-BiTE较HSV而言可以有效抑制小鼠体内的肿瘤生长（P＜0.001）;HSV-BiTE治疗的小鼠较HSV治疗组可以降低肿瘤中Ki67的表达（P＜0.01）,同时增加Cl-Cas3的表达（P＜0.01）;HSV-BiTE治疗的小鼠较HSV治疗组可以显著提升肿瘤浸润T细胞中IFN-γ（P＜0.001）和Granzyme B（P＜0.000 1）的表达水平。结论:HSV-BiTE在小鼠皮下移植瘤模型中显著抑制肿瘤生长,同时诱导肿瘤部位的T细胞发挥抗肿瘤功能。这种治疗方法优于未经改造的HSV治疗,支持进一步研究其在胶质瘤中的应用。     

Siglec-15×CD3双特异性抗体通过介导T细胞抗肿瘤免疫抑制结直肠癌细胞生长

目的:探索Siglec-15×CD3双特异性T细胞衔接子（bispecific T-cell engager,BiTE）是否可以在体内外介导T细胞的抗肿瘤免疫反应,抑制结直肠癌细胞的生长。方法:通过Expi293TM表达系统表达32A1-IgG及32A1-BiTE蛋白;ELISA法检测32A1-IgG及32A1-BiTE与靶蛋白的结合;流式细胞术检测结直肠癌细胞系中Siglec-15的表达;LDH法检测32A1-BiTE介导的T细胞对靶细胞的细胞毒性;小鼠移植瘤模型检测32A1-BiTE对肿瘤的抑制能力;免疫组化法检测肿瘤浸润CD3+ T细胞的含量;流式细胞术检测肿瘤浸润CD8+ T细胞分泌GzmB的水平。结果:得到纯度大于95%的32A1-IgG及32A1-BiTE蛋白;32A1-BiTE对 Siglec-15以及CD3均具有较强的结合能力;结直肠癌细胞系SW480、HCT116以及HT-29均高表达Siglec-15;32A1-BiTE可以以剂量依赖的方式介导T细胞对靶细胞的细胞毒性;32A1-BiTE可以有效抑制SW480细胞在小鼠体内的生长（P＜0.000 1）,增加肿瘤浸润CD3+ T细胞的数目（P＜0.000 1）,并显著提高CD8+ T细胞的比例（P＜0.01）以及其分泌GzmB的水平（P＜0.000 1）。结论:32A1-BiTE可以在体内外介导T细胞的抗肿瘤免疫反应,抑制结直肠癌细胞的生长,可能成为一种非常有潜力的结直肠癌治疗药物。     

MEK抑制剂显著增强EGFR CAR-T细胞对口腔鳞癌的抗肿瘤活性

目的:构建靶向表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）的二代嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）-T细胞,以探索MEK抑制剂联合EGFR CAR-T细胞是否可以对口腔鳞癌产生显著的抗肿瘤活性。方法:免疫组化法检测口腔鳞癌患者癌和癌旁组织中EGFR的表达;流式细胞术检测口腔鳞癌细胞系中EGFR的表达;慢病毒感染法构建EGFR CAR-T细胞;生物发光法检测EGFR CAR-T细胞联合MEKi对靶细胞的杀伤活性;流式细胞术检测共孵育后效靶细胞的占比情况;活体成像监测小鼠肿瘤的生长;免疫组化法检测小鼠肿瘤组织中CD3的表达;ELISA法检测肿瘤组织中IFN-γ和GrmB的含量。结果:人口腔鳞癌组织较癌旁组织EGFR显著高表达,大部分口腔鳞癌细胞系高表达EGFR。联合MEKi在短时间的共孵育中并不能显著增强EGFR CAR-T细胞对肿瘤细胞系的杀伤活性,但在较长时间的共孵育后,联合MEKi显著增强EGFR CAR-T细胞的增殖（P＜0.01）和对肿瘤细胞的细胞毒性（P＜0.001）。体内实验也表明,联合MEKi较单独使用EGFR CAR-T细胞而言对肿瘤抑制能力更强（P＜0.01）,肿瘤组织中CD3+T细胞的浸润更多（P＜0.001）,肿瘤部位细胞因子IFN-γ（P＜0.001）和GrmB（P＜0.001）的含量也更高。结论:联合MEKi可以在体内外条件下显著增强EGFR CAR-T细胞的抗肿瘤活性,有望成为针对口腔鳞癌的潜在治疗策略。     

直肠癌血管生成参数及临床病理参数与动态增强磁共振血流灌注参数的相关性

目的:分析动态增强磁共振血流灌注成像（dynamic contrast-enhanced magnetic resonance image,DCE-MRI）参数与直肠癌血管生成参数及临床病理参数的相关性。方法:随机选取2016年2月至2019年1月在我院手术后病理确诊的直肠癌患者58例，术前行DCE-MRI，对肿瘤横断面兴趣区定量检测Ktrans、Ke、Ve和iAUC，术后病理采用Western blot检测血管内皮细胞生长因子（vasular endothelial growth factor,VEGF）表达，免疫组化法检测微血管密度（microvascular density,MVD），评价Ktrans、Ke、Ve和iAUC在直肠癌临床病理参数［病理分期（T1、T2、T3、T4）、淋巴结转移（阴性vs阳性）、远处转移（阴性vs阳性）、血管浸润（阴性vs阳性）、神经浸润（阴性vs阳性）］中的差异。Pearson Rank相关性方法分析Ktrans、Ke、Ve和iAUC与直肠癌血管生成相关参数VEGF及MVD的相关性。结果:Ktrans及Kep在不同T分期直肠癌中差异有统计学意义（P＜0.001、P＜0.001），组间比较，Ktrans在T4期高于T3、T2及T1期（P<0.001、P<0.001、P<0.001），Kep在T4期高于T3、T2及T1期（P<0.01、P<0.001、P<0.001）。Ktrans及Kep在淋巴结转移（阴性vs阳性）、远处转移（阴性vs阳性）、血管浸润（阴性vs阳性）、神经浸润（阴性vs阳性）差异无统计学意义（P均＞0.05）。Pearson Rank相关性分析显示，Ktrans及Kep随着VEGF、MVD水平升高而升高，二者为正相关(P<0.000 1、P<0.000 1)；Ve和iAUC与VEGF、MVD水平无相关性(P>0.05、P>0.05)。结论:DCE-MRI参数Ktrans及Kep可对直肠癌血管生成参数及临床病理T分期进行评估，可以作为术前肿瘤生物学行为的预测参数。     

纳米金辅助递送PD-L1 siRNA在口腔鳞癌中的抗肿瘤活性的实验研究

目的:探讨纳米金递送的PD-L1 siRNA是否可以增强淋巴细胞对口腔鳞癌HSC-4细胞的抑制作用。方法:通过一步反应得到纳米金颗粒，并与PD-L1 siRNA形成纳米金-siRNA复合物，将游离的siRNA与纳米金-siRNA复合物分别与HSC-4细胞共孵育，qPCR和Western blot检测PD-L1的敲减情况，ELISA检测共孵育的T细胞的细胞因子IL-2分泌情况，并通过建立小鼠移植瘤检测抗肿瘤活性。结果:实验成功得到了纳米金-siRNA复合物，并可以有效敲低HSC-4细胞中PD-L1的表达；在T细胞与肿瘤细胞共孵育后，纳米金-siRNA较游离的siRNA相比，可以显著增强细胞因子IL-2的分泌；体内实验表明，相对于游离的siRNA，纳米金-siRNA可以更好的靶向肿瘤组织，增强T细胞对HSC-4肿瘤的抑制能力。结论:纳米金递送的PD-L1 siRNA系统，可以增强PD-L1 siRNA在肿瘤中的聚集能力，有效降低口腔鳞癌中PD-L1的表达，从而增强T细胞对口腔鳞癌的抗肿瘤活性。表明这种纳米金-PD-L1-siRNA复合物将可能成为一种很有前途的口腔鳞癌的治疗策略。     

华卟啉钠介导的光动力疗法对裸鼠人舌鳞癌移植瘤杀伤作用的实验研究

目的:探讨华卟啉钠（sinoporphyrin sodium，DVDMS）介导的光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）对舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）移植瘤治疗的疗效，为今后的临床治疗方案提供理论依据。方法:通过采用BALB/c-nu裸鼠体内移植瘤实验评估DVDMS-PDT对舌鳞癌的杀伤作用。治疗后定期测量小鼠体重、肿瘤体积，计算抑瘤率、生命延长率以评估杀伤作用；通过TUNEL分析和抗Bax、Bcl-2抗体的免疫组织化学法检测细胞凋亡情况。结果:本实验显示，各处理组肿瘤体积均小于对照组，DVDMS-PDT组肿瘤体积减小最明显（P＜0.01）；DVDMS-PDT组抑瘤率为53.57%，抑瘤效果明显优于其他组（P＜0.000 1）；DVDMS-PDT组生命延长率为61.51%，生存期最长（P＜0.05）；DVDMS-PDT组Bax蛋白表达明显上调、Bcl-2蛋白表达明显下降（P＜0.000 1）；DVDMS-PDT组TUNEL分析绿色荧光亮点最多（P＜0.000 1）。结论:DVDMS-PDT对舌鳞癌移植瘤具有明显的杀伤作用，可促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。     

Ki-67抗原及细胞周期素D1在初发和复发性膀胱移行细胞癌中表达的研究

 目的 探讨Ki-67抗原、细胞周期素D1（CyclinD1）在初发和复发性膀胱移行细胞癌组织中的表达及其临床意义。方法 收集47例膀胱移行细胞癌组织（膀胱移行细胞癌组），所有标本均经病理证实。肿瘤分期按UICC及TNM标准分为：浅表性肿瘤Tis ~ T1期14例，浸润性肿瘤T2 ~ T4期33例；肿瘤病理分级按WHO标准分为G1期21例，G2期22例，G3期4例；其中14例为复发；收集13份正常膀胱黏膜组织作对照组。采用免疫组织化学SP法检测组织中Ki-67抗原、CyclinD1的表达。结果 膀胱移行细胞癌组Ki-67抗原阳性率为87.23 ％，对照组为15.38 ％，两组比较差异有统计学意义（P＜0.001）；Ki-67抗原表达与肿瘤分级分期相关（P＜0.001）；复发病例Ki-67抗原表达明显高于初发病例（P＜0.05）。膀胱移行细胞癌组CyclinD1阳性率为91.48 ％，对照组为7.69 ％，差异有统计学意义（P＜0.001）；CyclinD1表达与肿瘤分级呈负相关（r =-0.384，P＜0.01），同分期、复发未见相关性。结论 Ki-67抗原、CyclinD1能较准确地评估膀胱移行细胞癌的生物学行为。     

外泌体携带的miR-142-3p通过靶向COX-2抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭

目的:探讨骨肉瘤组织中miR-142-3p是否可以通过靶向COX-2来抑制肿瘤细胞增殖和侵袭能力,并且验证携带miR-142-3p的外泌体是否可以抑制骨肉瘤细胞生长。方法:检测骨肉瘤癌组织及癌旁组织中miR-142-3p和COX-2 mRNA的表达。用双荧光素酶报告基因实验验证miR-142-3p与COX-2 3' UTR的靶向关系。构建过表达miR-142-3p及COX-2细胞系,检测细胞的增殖及侵袭能力。用携带miR-142-3p的外泌体处理肿瘤细胞,检测细胞的增殖及侵袭能力。对携带miR-142-3p的外泌体进行体内抑瘤实验。结果:较癌旁组织而言,miR-142-3p在癌组织中显著低表达（P＜0.05）,而COX-2在癌组织中显著高表达（P＜0.05）,且COX-2是miR-142-3p的靶标。过表达miR-142-3p的细胞增殖及侵袭能力降低（P＜0.001）。体外增殖实验及小鼠体内移植瘤模型表明,携带miR-142-3p的外泌体可以在小鼠体内外抑制骨肉瘤细胞的增殖（P＜0.001）。结论:携带miR-142-3p的外泌体可通过抑制COX-2的表达来抑制骨肉瘤细胞的生长,因此,携带miR-142-3p的外泌体可能发展成为一种治疗骨肉瘤的潜在策略。     

广泛期小细胞肺癌一线化疗肿瘤缓解深度与生存期的相关性

目的:分析广泛期小细胞肺癌一线化疗后肿瘤缓解深度与患者生存期的相关性。方法:回顾性分析符合入组条件的50例初治广泛期小细胞肺癌患者的临床资料。通过Spearman秩相关检验评价广泛期小细胞肺癌化疗后肿瘤缓解深度与生存期的相关性，应用Log-rank检验比较不同肿瘤缓解深度对生存期的影响，应用COX比例回归模型进行多因素分析。结果:Spearman秩相关分析显示肿瘤缓解深度与PFS及OS均呈中等程度相关。不同缓解深度患者的生存期存在统计学差异。体重减少（P＜0.000 1）、缓解深度（P＜0.001）为无进展生存期的独立影响因素；体重减少（P＜0.000 1）、体力状态（P=0.001 2）、缓解深度（P＜0.001）、化疗周期（P=0.000 2）、二线治疗（P=0.006 7）为总生存期的独立预后因素。结论:广泛期小细胞肺癌一线化疗后肿瘤缓解深度对患者生存期有一定的预测价值。     

CUL4A促进人胃癌细胞增殖、侵袭和转移的机制

目的:探讨CUL4A基因在胃癌增殖、侵袭和转移中的机制。方法:siRNA干扰胃癌SCG-7901细胞中CUL4A基因的表达;CCK-8法检测各组细胞的增殖情况;Transwell小室观察各组细胞的侵袭能力;Annexin-V-FITC/PI法检测各组细胞的凋亡情况,分析CUL4A对细胞凋亡的影响;Real time-PCR分析上皮间质转化（EMT）相关基因的表达情况。结果:siRNA有效干扰了胃癌SCG-7901细胞中CUL4A基因的表达（P＜0.05）;干扰CUL4A基因有效抑制了胃癌细胞的增殖（P＜0.05）;Transwell小室结果显示,干扰CUL4A基因阻碍了SCG-7901细胞的侵袭能力（P＜0.05）;细胞凋亡结果显示,干扰CUL4A基因促进了细胞的凋亡（P＜0.05）;Real time-PCR结果显示,干扰CUL4A基因后Snail mRNA和ZEB1 mRNA的表达降低（P＜0.05）,E-cadherin mRNA的表达升高（P＜0.05）。结论:CUL4A基因促进胃癌细胞的增殖,抑制凋亡和侵袭,且影响了EMT相关基因的表达。