VEGF-C反义寡核苷酸对乳腺癌细胞MDA-MB-435黏附、侵袭能力的影响

目的　探讨 VEGF- C反义寡核苷酸 (antisense oligodeoxynucleotide,ASODN )对人乳腺癌细胞 MDA-MB- 4 35黏附、侵袭能力的影响。方法　以 VEGF- C基因编码区为靶点合成反义寡核苷酸 ,脂质体介导转染。 RT-PCR法检测转染后 VEGF- C m RNA表达水平 ;MTT法检测乳腺癌细胞与细胞外基质黏附 ;利用 Transwell小室 ,检测乳腺癌细胞侵袭人工基底膜能力 ;Western- blot法检测乳腺癌细胞中 MMP- 2蛋白表达。结果　与空白对照及正义序列 (sense oligodeoxynucleotide,SODN)转染组比较 ,ASODN组 VEGF- C m RNA水平下调 ,差异有显著性 (t=5 .6 4 ,5 .4 8,P<0 .0 1) ;对胞外基质黏附率明显降低 (χ2 =7.15 ,7.2 9,P<0 .0 5 ) ,穿透重组基底膜数目显著下降 (t=5 .2 9,5 .17,P<0 .0 1) ;细胞裂解液中 MMP- 2蛋白表达显著下调 (t=7.36 ,7.4 3,P<0 .0 1)。结论　 VEGF- C基因 ASODN脂质体介导转染可明显抑制乳腺癌细胞体外实验中的黏附和侵袭能力 ;下调 MMP- 2的表达可能是其作用途径。     

Survivin反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞 SKOV3的抑制作用

背景与目的:在大多数肿瘤组织中都发现了 survivin的异常高表达,这说明 survivin在肿瘤发生中具有重要作用.本研究探讨 survivin反义寡核苷酸 (survivin ASODN)对人卵巢癌细胞 SKOV3的抑制作用及其机制.方法:脂质体介导 survivin反义寡核苷酸转染 SKOV3,用 MTT法检测细胞抑制率. Western blot法检测相关基因蛋白表达,应用流式细胞术、梯形 DNA片段分析及 DAPI染色光镜观察细胞凋亡情况.激酶活性检测方法测定半胱氨蛋白水解酶 3( caspase-3)活性的变化.结果:脂质体介导 survivin反义寡核苷酸转染后, SKOV3细胞的生长受到明显抑制, 1 000 ng/ml ASODN转染组的细胞抑制率为( 60.30± 2.95)%,明显高于对照组( P< 0.05).凋亡细胞比率由转染前的 0.65%增加至 32.10% ,SKOV3细胞内 survivin基因蛋白表达下调 26.3%, caspase-3活性为 0.998± 0.001,较对照组显著增高( P< 0.01).结论: Survivin ASODN可通过诱导细胞凋亡抑制细胞生长, 具有明显的抗癌作用.     

Survivin反义寡核苷酸对卵巢癌细胞株凋亡和侵袭、迁移的影响

目的:观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人卵巢癌细胞株SKOV3凋亡和侵袭、迁移的影响,探讨其作用的分子机制和临床价值。方法:用脂质体LipofectamineTM2000介导ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力的改变,流式细胞学技术检测细胞凋亡指数及survivin、Smac、VEGF蛋白表达改变,逆转录酶链反应(RT-PCR)检测survivin、Smac/DIABLO、VEGF基因表达改变。结果:脂质体LipofectamineTM2000介导ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,FCM及共聚焦显微镜(SLM510)检测结果显示转染率>95%。用600 nmol/L ASODN转染48 h后,细胞迁移和侵袭能力下降(t=3.47,P<0.05;t=5.72,P<0.01)。细胞凋亡指数(AI)明显增加(t=6.37,P<0.05)。Survivin mRNA和蛋白表达明显下调(t=3.50,P<0.05;t=7.81,P<0.01),Smac mRNA和蛋白表达上调(t=-2.80,P<0.05;t=11.39,P<0.01),VEGF mRNA和蛋白表达明显下调(t=2.54,P<0.05;t=33.84,P<0.01)。结论:ASODN可诱导卵巢癌细胞凋亡,降低卵巢癌细胞侵袭和迁移能力。这些作用是通过下调survivin、VEGF基因,上调Smac基因表达来共同完成的,他们之间的相互作用可能是卵巢癌发生、发展和转移的重要分子机制,survivin可能在其中起关键性作用。针对survivin的基因治疗将成为卵巢癌治疗的重要手段,有重要的临床价值。     

反基因V-erbB寡核苷酸对卵巢癌细胞株SKOV3的影响

目的 探讨反基因V-erbB寡核苷酸(Oligo)对卵巢癌细胞株SKOV3的影响.方法 将体外合成的经硫代磷酸修饰的反基因V-erbB Oligo作用于SKOV3卵巢癌细胞株,采用流式细胞术检测SKOV3细胞表达、增生指数及凋亡率.结果 终浓度为5 mmol/L反基因V-erbB Oligo对卵巢癌细胞具有显著作用(P＜0.01),癌细胞的p185蛋白表达、细胞增生均受到明显抑制(P＜0.01);细胞凋亡也显著增加.而叠加剂量的药物浓度并无叠加效应.结论 反基因V-erbB寡核苷酸能有效地封闭细胞原癌基因C-erbB的表达,但其剂量具有一定的饱和浓度.     

ATP7B基因反义寡核苷酸对卵巢癌SKOV3ipl细胞顺铂敏感性的影响

目的探讨ATP7B基因反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODNs)片段对卵巢癌SKOV3ip1细胞顺铂敏感性的影响。方法人工合成包含ATP7B mRNA翻译起始位点的ASODNs片段及作为对照的正义寡核苷酸(sense ol-igodeoxynucleotide,SODNs)片段。脂质体lipofectamine2000(LF)将ASODNs及SODNs转染卵巢癌SKOV3ip1细胞后,用RT-PCR法、流式细胞测定法、Western blot及MTT法检测SKOV3ip1细胞转染后,ATP7B基因mRNA、蛋白表达及半数抑制浓度(IC50)的变化。结果SKOV3ipl细胞以及转染ASODNs后,ATP7B与β-actin mRNA的光密度比值分别为0.831±0.06和0.203±0.07(P<0.01)。流式细胞法检测细胞内ATP7B蛋白的荧光强度由转染前的79.42±4.04下降到50.87±5.47(P<0.05)。Western blot检测SKOV3ipl细胞以及转染ASODNs后,ATP7B与actin蛋白的光密度比值分别为2.60±0.44和1.01±0.06(P<0.01)。MTT检测IC50由转染前的(126.63±12.06)μmol/L下降为(80.90±20.09)μmol/L(P<0.01)。而转染SODNs及LF的SKOV3ip1细胞中,上述指标无统计学差异(P>0.05)。结论ATP7B基因反义寡核苷酸能显著抑制卵巢癌SKOV3ip1细胞ATP7B mRNA和蛋白表达,并能增加SKOV3ip1细胞对顺铂的敏感性。     

c-raf-1反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞放射敏感性的影响

目的　探讨癌基因 c- raf- 1的反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞放射敏感性的影响。方法　设立 c- raf- 1正义寡核苷酸组和非处理组 (仅加入等量的脂质体 )作对照 ,用 RT- PCR检测卵巢癌细胞处理前后 c- raf- 1表达水平的变化。用平板克隆形成试验检测人卵巢癌细胞株 SKOV3在脂质体 - c- raf- 1反义寡核苷酸作用前后受 6 0 Coγ射线不同剂量照射后的集落形成率。结果　 c- raf- 1反义寡核苷酸能抑制 c- raf- 1癌基因的表达 ,经脂质体介导的 c- raf- 1反义寡核苷酸作用的卵巢癌细胞经γ射线照射后其集落形成率较转染正义寡核苷酸组及单纯照射组明显下降 (P<0 .0 1) ,而转染 c- raf- 1正义寡核苷酸组的集落形成率与单纯照射组相比无明显差异 (P>0 .0 5 )。结论　 c- raf- 1反义寡核苷酸通过抑制 c- raf- 1的表达降低人卵巢癌细胞株 SKOV 3放射抗拒性。该作用可能与 c- raf- 1反义寡核苷酸抑制了引起细胞辐射抗拒的细胞信号转导途径有关     

反义寡核苷酸治疗肿瘤

反义寡核苷酸（ASODN）治疗肿瘤具有特异性高、副作用少的特点，与化疗、放疗和靶向药物结合有协同作用，并已逐渐从实验室走向临床。现综述目前反义寡核苷酸治疗肿瘤所选择的靶点及其疗效。     

反义ODN对人卵巢癌细胞株A2780 FSHR表达的影响

卵巢癌占妇科恶性肿瘤死亡率首位,常规治疗方法为手术和化疗,但生存率较低。大量研究显示,卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)对卵巢癌的发生发展具有明显促进作用^[1]。FSH生理作用的发挥是通过特异性G蛋白偶联受体(Folliclestimulating hormone receptor,FSHR)所介导。近年,FSHR在卵巢中的表达倍受关注。卵巢癌细胞有无FSHR过度表达,恶性与良性肿瘤细胞间FSHR表达差异等问题,目前尚不清楚。     

FAP-1分子对卵巢癌细胞株SKOV3凋亡的影响

目的探讨Fas相关磷酸酯酶-1(FAP-1)对卵巢癌细胞株SKOV3凋亡的影响.方法采用免疫印记法(Western blot)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,检测了经FAP-1反义寡核苷酸(FAP-1ASODN)封闭前后FAP-1蛋白与核酸在卵巢癌细胞株SKOV3中的表达水平;应用四唑盐比色法(MTT法)和流式细胞术(FCM)检测了经抗Fas激活性抗体DX2诱导凋亡后FAP-1分子对SKOV3细胞凋亡行为的影响.结果FAP-1蛋白与mRNA在卵巢癌细胞株SKOV3中均有明显表达.当用DX2以不同时间和不同浓度诱导凋亡后,DX2 FAP-1ASODN组在12、24、48和72 h的细胞抑制率约为DX2组的1～2倍,细胞凋亡率约为后者的2～4倍,差异有显著性(P＜0.05,P＜0.01);在DX2低、中、高3个浓度时,DX2 FAP-1ASODN组的细胞抑制率为(20.94±1.15)%、(34.70±1.24)%、(45.45±2.80)%,DX2组分别为(11.42±0.38)%、(18.33±1.29)%、(28.75±1.81)%,差异有显著性(P＜0.05,P＜0.01);而在DX2组与DX2 FAP-1SODN组间无显著性差异(P＞0.05).结论FAP-1分子在卵巢癌细胞SKOV3中有明显表达,且具有抵抗Fas介导凋亡的功能,而FAP-1ASODN可以明显提高卵巢癌细胞对凋亡的敏感性,可能对卵巢癌的发病与治疗具有重要意义.     

层黏连蛋白受体反义核酸对卵巢癌细胞侵袭能力的影响

目的:研究67 kD层黏连蛋白受体(67kDLN-R)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)对卵巢癌细胞HRA体外侵袭转移能力的影响.方法:采用流式细胞仪、RT-PCR及Transwell小室的方法检测反义核酸对67 kD LN-R基因和蛋白表达影响,及转染前后细胞体外侵袭转移能力变化.结果:67 kD LN-R ASODN可从蛋白质和mRNA水平下调67kDLN-R的表达,且下调作用呈剂量依赖性.与正义组及对照组相比差异有显著性(P＜0.05).体外侵袭实验证实转染后HRA穿透人工基底膜的能力显著降低并呈现剂量依赖性.结论:67kDLN-R ASODN可降卵巢癌细胞体外侵袭转移能力,有望为卵巢癌治疗提供新方向.     

反义MRP3寡核苷酸对卵巢癌拓普替康耐药性的逆转作用

目的:探讨MRP3反义寡核苷酸对人卵巢癌拓普替康(TPT)耐药株SKOV3/TPT细胞的耐药逆转作用。方法:人工合成MRP3反义寡核苷酸(ASODN)及相应的正义寡核苷酸(SODN)片段,用脂质体(LF)构建成ASODN/LF、SODN/LF,分别转染SKOV3/TPT细胞,用MTT法、流式细胞仪(FCM)及半定量RT-PCR检测体外转染后细胞内TPT的荧光强度、耐药指数及MRP3mRNA表达的改变。结果:将MRP3反义及正义寡核苷酸片段分别转染进SKOV3/TPT细胞后,反义组细胞内TPT的荧光强度及耐药指数明显降低(P<0.05),细胞内MRP3mRNA的表达较未转染细胞下降了60.16%(P<0.05);正义组上述指标无明显变化。结论:转染MRP3ASODN/LF可部分逆转MRP3介导的人卵巢癌细胞对TPT耐药。     

Induction of MicroRNA-9 Mediates Cytotoxicity of Curcumin Against SKOV3 Ovarian Cancer Cells

Background: Curcumin, a phenolic compound extracted from the rhizomes of Curcuma longa, has showncytotoxic effects against a variety of cancers. The aim of this study was to identify potential microRNA (miRNA)mediators of the anticancer effects of curcumin in ovarian cancer cells. Materials and Methods: SKOV3 ovariancancer cells were treated with curcumin (10-60 μM) and miR-9 expression, cell proliferation, and apoptosiswere assessed. The effects of miR-9 depletion on curcumin-mediated growth suppression were also examined.Phosphorylation of Akt and forkhead box protein O1 (FOXO1) was measured in cells with miR-9 overexpressionor curcumin treatment. Results: Curcumin caused a significant and dose-dependent increase of miR-9 expressionin SKOV3 cells, while significantly impeding cell proliferation and stimulating apoptosis. Depletion of miR-9significantly (p<0.05) attenuated the growth-suppressive effects of curcumin on SKOV3 cells, coupled withreduced percentages of apoptotic cells. In contrast, overexpression of miR-9 significantly enhanced the cleavageof caspase-3 and poly(ADP-ribose) polymerase and promoted apoptotic death in SKOV3 cells. Western blotanalysis showed that both miR-9 overexpression and curcumin similarly caused a significant (p<0.05) declinein the phosphorylation of Akt and FOXO1, compared to untreated cells. Conclusions: The present studyprovided evidence that curcumin exerts its cytotoxic effects against SKOV3 ovarian cancer cells largely throughupregulation of miR-9 and subsequent modulation of Akt/FOXO1 axis. Further studies are needed to identifydirect targets of miR-9 that mediate the anticancer effects of curcumin in ovarian cancer cells.     

阿司匹林、扑热息痛和尼美舒利对人卵巢癌细胞株SKOV3的抑制作用

[目的]研究非甾体类药物阿司匹林、扑热息痛和尼美舒利对人卵巢癌细胞株SKOV3的抑制作用及其相关机制.[方法]利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察阿司匹林、扑热息痛和尼美舒利对人卵巢癌细胞株SKOV3的生长抑制作用;免疫组化法检测COX-2在SKOV3细胞中的表达情况以及3种药物对SKOV3细胞中Ki-67,C-erbB-2表达的影响;透射电镜观察3种药物作用SKOV3细胞后形态变化和凋亡情况;流式细胞术检测3种药物对SKOV3细胞周期的影响.[结果]阿司匹林、扑热息痛和尼美舒利对人卵巢癌细胞株SKOV3具有生长抑制作用,并呈时间-剂量依赖性.免疫组化发现COX-2在SKOV3细胞中呈阳性表达,阿司匹林使SKOV3细胞中C-erbB-2蛋白表达下降,尼美舒利使SKOV3细胞核中Ki-67蛋白表达下降,扑热息痛对C-erbB-2和Ki-67蛋白表达无影响.透射电镜可见阿司匹林、扑热息痛和尼美舒利作用后的SKOV3细胞中有凋亡小体和坏死细胞的形成.流式细胞术发现400μmol/L尼美舒利和10-2mol/L阿司匹林使SKOV3细胞停滞在G0/G1期.[结论]非甾体类药物,特别是COX-2抑制剂尼美舒利可望作为预防性化疗药物应用于卵巢癌的治疗.     

VEGF-C和VEGF-R3在乳腺癌中的表达及与淋巴结转移的关系

目的探讨VEGF-C及其受体VEGF-R3在乳腺导管癌中的表达及与淋巴结转移等临床病理指标的相关性。方法采用免疫组化方法,检测60例乳腺导管癌及邻近正常组织中VEGF-C和VEGF-R3表达,并将表达结果与淋巴结转移情况及临床病理特征进行统计学分析。结果乳腺导管癌中分别有78%和83%的VEGF-C、VEGF-R3阳性表达,而癌旁及正常乳腺组织散在性弱表达或无表达。VEGF-C在淋巴结转移组表达评分中位数为6,而在非淋巴结转移组评分中位数为1,差异有极显著性(P<0.01)。VEGF-R3在乳腺癌淋巴结转移组与淋巴结非转移组表达评分中位数分别为6.0、2.0,差异亦有极显著性(P<0.01)。结论VEGF-C与VEGF-R3在乳腺癌的侵袭进展及区域淋巴结转移方面可能起重要作用。     

c-raf-1反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞受照后Ki-67表达的影响

[目的]探讨癌基因c-raf-1的反义寡核苷酸埘人卵巢癌细胞受照后Ki-67表达的影响。[方法]设立c-raf-1正义寡核苷酸组和非处理组（仅加入等量的脂质伴)作对照，用RT-PCR检测卵巢癌细胞处理前后c-raf-1表达水平的变化，用免疫组化技术检测人卵巢癌细胞株SKOV3在脂质体-c-raf-1反义寡核苷酸作用前后受^60Coγ射线照射后细胞Ki-67的表达情况。[结果]c-raf-1反义寡核苷酸能抑制c-raf-1癌基因的表达，经脂质体介导的c-raf-1反义寡核苷酸作用的卵巢癌细胞经γ射线照射后其Ki-67表达较转染正义寡核苷酸组及单纯照射组明显下调，而转染c-raf-1正义寡核苷酸组和单纯照射组相比无明显差异。[结论]c-raf-1反义寡核苷酸通过抑制c-raf-1的表达降低人卵巢癌细胞株SKOV3受照射后的增殖能力。该作刚可能与c-raf-1反义寡核苷酸抑制了引起肿瘤细胞辐射抗拒的细胞信号传导途径有关。     

二氢青蒿素对卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用

目的 研究二氢青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡。方法 用MTT法检测DHA对SKOV3细胞的增殖抑制作用,流式细胞仪（FCM）测其凋亡率,反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测Bcl-2、Bax的表达。结果 双氢青蒿素对卵巢癌SKOV3细胞有明显的增殖抑制效应,呈明显的时间-剂量依赖性。DHA处理SKOV3细胞后,24、28、72 h的IC50值分别为117、35.677、23.382 μmol/L。二氢青蒿素可以抑制SKOV3细胞增殖,促进其凋亡,下调Bcl-2基因的表达,增加Bax基因的表达,并有时间、浓度依赖性。结论 二氢青蒿素对人卵巢癌SKOV3细胞有体外抑制作用, 可能通过下调Bcl-2、增加Bax基因的表达来促进细胞的凋亡。     

c-jun反义核酸消除人体卵巢癌细胞的抗药性研究

目的:c-jun反义核酸消除人体卵巢癌细胞抗药性探讨.方法:采用c-jun反义核酸处理抗药型人体卵巢癌细胞,观察c-jun,γ-GCS以及GSH在两种细胞内的表达水平.结果:c-jun反义核酸可抑制c-jun基因的表达并降低谷胱苷肽合成的关键酶γ-GCS的mRNA表达量,使抗药型细胞内GSH含量降低大约75%.ATT分析结果也表明,经c-jun反义核酸处理后,抗药型细胞对顺铂的IC_(50)从40μmol/L降低到1.0μmol/L,对敏感型细胞无明显影响(0.2μmol/L).结论:c-jun反义核酸可特异地抑制抗药型细胞内c-jun基因的表达并间接抑制γ-GCS的表达,最终抑制GSH的合成,从而消除卵巢癌细胞的抗药性.     

BRMS1shRNA表达载体的构建及对卵巢癌细胞转移的影响

目的 探讨乳腺癌转移抑制基因1( BRMS1)表达抑制对人卵巢癌细胞转移能力的影响及机制.方法 构建靶向BRMS1基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-BRMS1,并转染人卵巢癌OVCAR3细胞,经G418筛选获得稳定转染株.采用实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测...