PTEN、PIK3CA在培美曲塞耐药的胰腺癌细胞株Patu8988中的表达及其意义的初步探讨

目的 探索胰腺癌细胞株Patu8988对培美曲塞产生获得性耐药的机制,分析PTEN、PIK3CA在获得耐药前后mRNA及蛋白水平变化及其对细胞迁移及侵袭能力的影响。方法 通过RT-PCR及Western blot技术分别检测正常胰腺癌细胞株Patu8988及培美曲塞耐药的胰腺癌细胞株Patu8988中PTEN及PIK3CA的mRNA及其蛋白产物表达水平变化。应用迁移及侵袭实验分别检测正常胰腺癌细胞株和耐药的胰腺癌细胞株不同生物学行为。结果 RT-PCR发现与正常胰腺癌细胞株Patu8988相比,培美曲塞耐药的胰腺癌细胞株Patu8988中,PTEN和PIK3CA在mRNA水平表达均显著增高;Western blot发现培美曲塞耐药的胰腺癌细胞株Patu8988中PTEN、PIK3CA在蛋白水平同样表达升高,PTEN和PIK3CA在耐药的胰腺癌细胞株中的表达较正常胰腺癌细胞株分别上升89%和76%;迁移及侵袭实验的结果显示,培美曲塞耐药的胰腺癌细胞株Patu8988迁移及侵袭能力较正常胰腺癌细胞株Patu8988均显著下降(P＜0.05)。结论 PTEN、PIK3CA在对培美曲塞耐药的胰腺癌细胞株Patu8988中表达均异常升高,而同时高表达PTEN和PIK3CA的胰腺癌耐药细胞株的迁移及侵袭能力较正常胰腺癌细胞株显著降低,提示PTEN和PIK3CA共同参与胰腺癌细胞对培美曲塞产生获得性耐药过程,且有可能改变细胞的生物学行为。     

敲低远端上游元件结合蛋白1的表达对胰腺癌细胞侵袭迁移能力的影响

目的:研究敲低远端上游元件结合蛋白1（FUBP1）的表达对胰腺癌细胞增殖和侵袭迁移能力的影响。方法:细胞转染干扰序列siFUBP1降低胰腺癌细胞PaTu8988中FUBP1的表达,FUBP1-nc作为阴性对照。CCK-8实验检测细胞增殖能力,细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞侵袭迁移能力。结果:敲低胰腺癌细胞PaTu8988中FUBP1的表达能明显抑制细胞增殖,细胞侵袭迁移数目减少,降低细胞侵袭迁移能力。结论:敲低FUBP1的表达能显著抑制胰腺癌细胞增殖及侵袭迁移能力。     

高迁移率族蛋白1对人鼻咽癌细胞株C666-1体外迁移及侵袭能力的影响

目的 观察高迁移率族蛋白1（HMGB1）对人鼻咽癌细胞株C666-1体外迁移及侵袭能力的影响,并初步探讨其可能的机制。 方法 用siRNA干扰C666-1细胞株HMGB1基因表达,通过划痕试验及Transwell检测siHMGB1对C666-1细胞株迁移及侵袭能力的影响,通过Western blot检测HMGB1干扰后侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶2/9（MMP2/9）的表达变化。结果 相比对照组,干扰C666-1细胞株HMGB1基因的表达后,C666-1细胞迁移能力明显下降（P<0.001）, 侵袭能力明显减弱（P<0.001）,细胞侵袭相关蛋白MMP2表达水平明显下降（P<0.001）,而MMP9表达未见明显变化。结论 HMGB1促进人鼻咽癌细胞株C666-1体外迁移及侵袭,且其对C666-1侵袭能力的影响可能通过MMP2介导。     

下调MYEOV抑制胰腺癌细胞PaTu8988增殖、迁移、侵袭

目的:研究骨髓瘤过表达基因（MYEOV）对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响,以及对上皮间质转化（EMT）相关蛋白和STAT3信号通路相关蛋白的调控作用。方法:利用UCSC Xena数据库分析MYEOV在胰腺癌及正常组织中的表达水平,利用ICGC数据库分析MYEOV与胰腺癌患者预后的关系。使用慢病毒重组构建稳定低表达MYEOV的胰腺癌PaTu8988细胞系,运用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测胰腺癌细胞系中MYEOV mRNA和蛋白的表达情况,采用CCK-8、划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验分析细胞的增殖、迁移、侵袭能力。利用Western blot方法检测E-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9、STAT3、p-STAT3的表达情况。结果:经生物信息学分析发现,MYEOV在胰腺癌组织中高表达,且与胰腺癌预后不良有关。与对照组比较,下调MYEOV后胰腺癌细胞株PaTu8988的增殖、迁移和侵袭能力降低;与对照组比较,下调MYEOV后胰腺癌PaTu8988细胞系中E-cadherin蛋白表达水平升高,Vimentin、MMP2、MMP9、p-STAT3蛋白表达水平下降。结论:下调MYEOV的表达抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭,其机制可能与抑制EMT过程有关,而STAT3通路蛋白在EMT发生过程中出现改变,提示STAT3通路可能参与了该表型的调控。     

CDC25B1对人胰腺癌细胞株Patu8988的生物学行为的影响

目的 探讨CDC25B1基因在人胰腺癌细胞株Patu8988中的表达情况,并将真核表达重组载体pcDNA-CDC25B1转染至细胞中,观察CDC25B1基因对细胞生物学行为的影响,以了解它在细胞周期及胰腺肿瘤细胞恶性转化方面的作用,为研究胰腺癌的发病机制与治疗提供理论依据.方法 利用Lipolectamine2000将CDC25B1转染至人胰腺癌细胞株Patu8988中,通过RT-PCR和Western blot在mRNA和蛋白水平验证质粒转染成功,通过MTT实验、侵袭实验和细胞周期检测,观察CDC25B1对细胞生物学行为的影响. 结果 RT-PCR发现在胰腺癌细胞株Patu8988和转染空质粒的细胞株中,CDC25B1在mRNA水平表达很弱;转染pcDNA-CDC25B1组中CDC25B1高表达.Western blot发现在胰腺癌细胞株Patu8988中,CDC25B蛋白有少量表达;转染pcDNA-CDC25B1组CDC25B蛋白高表达.MTT实验显示,转染pcDNA-CDC25B1组的细胞生长在72 h受到明显抑制(P<0.05).侵袭实验显示,转染pcDNA-CDC25B1的细胞其穿透Matrigel胶的能力明显增强(P<0.05).流式细胞计量术显示,转染了pcDNA-CDC25B1组中,G1期的细胞明显增多(P<0.05);同时转染了pcDNA-CDC25B1组中,G2期的细胞明显减少,与未处理组比较有统计学意义(P<0.05). 结论 在胰腺癌细胞株Patu8988中的CDC25B1转录水平很弱,存在少量CDC25B蛋白表达.转染的CDC25B1基因提高CDC25B1蛋白的表达,使细胞停滞在G1期,对细胞的生长有抑制作用,但能够增强细胞的侵袭能力;CDC25B1可能不是通过单一的调控细胞周期而实现其对细胞的影响,还存在其它多种途径.     

LPS对宫颈癌细胞HMGB1主动释放及侵袭转移能力的影响

目的探讨脂多糖（LPS）对宫颈癌细胞HMGB1主动释放及侵袭迁移能力的影响。 方法 高糖培养液培养三种细胞系：宫颈癌HeLa细胞系、宫颈癌C33A细胞系和正常宫颈上皮HUCEC细胞系,加LPS前后分别做Western blot检测HMGB1在宫颈癌细胞系（HeLa 和C33A）及正常宫颈上皮HUCEC细胞系细胞内外的表达情况。LPS刺激前后行小室细胞侵袭实验分析检测宫颈癌细胞株的侵袭迁移能力。 结果 100 ng/ml LPS刺激后,三种细胞内HMGB1总蛋白较刺激前均减少,而上清液HMGB1表达增加（P＜0.05）;HeLa及C33A宫颈癌细胞侵袭迁移能力明显增强（P＜0.05）。 结论LPS能刺激宫颈癌细胞HMGB1主动释放从而增强其侵袭迁移能力。     

miR-144对胰腺癌SW1990细胞增殖、迁移、侵袭及PI3K通路的影响

探讨miR-144对胰腺癌SW1990细胞增殖、迁移、侵袭及磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）通路的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测人正常胰腺上皮细胞系HPDE与胰腺癌SW1990细胞中miR-144表达水平。将miR-144阴性对照质粒、miR-144 mimic质粒分别转染至SW1990细胞,分别命名为阴性转染组、miR-144过表达组,未经处理的细胞命名为空白对照组。采用RT-qPCR法检测各组miR-144表达水平;CCK-8法检测细胞增殖情况;平板细胞克隆形成实验检测菌落形成;Transwell检测细胞迁移及侵袭能力;Western blot法检测PI3K通路中PI3K及其磷酸化蛋白（p-PI3K）、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（Akt）及其磷酸化蛋白（p-Akt）的表达水平。结果 SW1990细胞中miR-144的表达水平显著低于HPDE细胞（P<0.05）;miR-144过表达组中miR-144表达水平显著高于空白对照组和阴性转染组（P<0.05）、细胞增殖率、菌落形成、迁移及侵袭数量和p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平均显著低于空白对照组、阴性转染组（均P<0.05）。结论 miR-144在胰腺癌细胞SW1990中呈低表达,上调miR-144表达水平有效抑制胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭,其机制可能与PI3K通路抑制有关。     

低氧诱导因子HIF-1α调控CX3CR1在胰腺癌细胞中的表达

  目的  以胰腺癌细胞株Patu8988为研究对象, 通过过表达和干扰低氧诱导因子(HIF-1α), 观察CX3CR1表达水平的变化, 并探讨CX3CR1在胰腺癌中的调控机制。  方法  分别构建pcDNA3.1-HIF-1α过表达质粒和HIF-1α-siRNA, 转染胰腺癌细胞株Patu8988, 经Western blot、半定量PCR检测CX3CR1的表达情况。采用染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)、荧光素酶技术探查HIF-1α与CX3CR1启动子区的结合情况。  结果  Patu8988转染pcDNA3.1-HIF-1α后CX3CR1的表达增加, 敲除HIF-1α后CX3CR1的表达减少。HIF-1α与CX3CR1启动子区的低氧反应元件直接结合, 并上调CX3CR1启动子的活性(P < 0.01)。  结论  HIF-1α调控CX3CR1在胰腺癌细胞中的表达。      

PRSS2重组胰蛋白酶诱导上皮间质转化促进胰腺癌细胞转移

目的：探讨丝氨酸蛋白酶 2（serine protease 2，PRSS2）重组胰蛋白酶对胰腺癌转移的影响。方法：利用GEPIA数据库分析 PRSS2 基因表达与胰腺癌患者预后关系。镜下观察 PRSS2 重组胰蛋白酶对胰腺癌 Panc-1 细胞株细胞形态的影响，Western blot 检测上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）分子学标志物的表 达，Transwell 实验检测癌细胞迁移及侵袭能力。结果：GEPIA 数据库分析结果显示，PRSS2 高表达患者总生存期显著低于 PRSS2 低表达患者，PRSS2 基因表达与胰腺癌患者预后呈明显负相关。100 ng/mL PRSS2 重组胰蛋白酶诱导 Panc-1 细胞由多边形变为梭形；E-cad 蛋白表达下调（t = 27.969，P < 0.001），N-cad 蛋白表达上调（t = 33.163，P < 0.001）；细胞迁移、侵袭能力增强（t = 21.774，P < 0.001；t = 21.547，P < 0.001）。结论：PRSS2 重组胰蛋白酶可诱导胰腺癌细胞发生 EMT，促进胰腺癌迁移及侵袭。PRSS2 胰蛋白酶可能是诱发胰腺癌转移的重要因素，为胰腺癌的早期干预提供理论依据。     

K-ras和IGF-IR反义寡核苷酸联合转染对人胰腺癌Patu8988细胞增殖和凋亡的影响

背景与目的:已有研究表明K-ras基因点突变及胰岛素样生长因子Ⅰ受体(insulin-like growth factor receptor type1,IGF-IR)过表达在胰腺癌的发生发展过程中起着重要作用,针对K-ras mRNA和IGF-IR mRNA的反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)均可抑制胰腺癌细胞的增殖。本研究旨在探讨针对K-ras基因12密码子点突变的硫代反义寡核苷酸(K-ras ASODN)联合IGF-IR硫代反义寡核苷酸(IGF-IR ASODN)对人胰腺癌Patu8988细胞体内外增殖和凋亡的影响。方法:顺序特异引物聚合酶链反应(polymerase chain reaction using special sequence primers,PCR-SSP)法和基因测序检测Patu8988细胞K-ras点突变形式,根据点突变形式设计并合成K-ras ASODN。K-ras ASODN和IGF-IR ASODN分别单独和联合作用Patu8988细胞后,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、克隆形成实验及透射电镜观察其对Patu8988细胞增殖及形态结构的影响;流式细胞术(FCM)检测K-ras和IGF-IR蛋白表达和细胞凋亡;RT-PCR检测K-ras和IGF-IR mRNA表达水平;以Patu8988细胞建立裸鼠人胰腺癌模型,观察K-ras ASODN与IGF-IR ASODN联合应用在体内的抗肿瘤效果。结果:PCR-SSP法和基因测序检测表明Patu8988细胞存在K-ras基因第12密码子点突变,其突变方式为GGT→GTT。2～32mg/L的K-ras ASODN和2～32mg/L的IGF-IR ASODN单独应用均能一定程度抑制Patu8988细胞增殖、诱导细胞凋亡,两者联合应用较单独应用抑制作用更为显著(P<0.01)。体内实验表明,K-ras ASODN与IGF-IR ASODN联合应用较单独应用能更有效地抑制BALB/c裸鼠胰腺癌的生长(P<0.01)。结论:K-ras ASODN和IGF-IF ASODN两种反义寡核苷酸对人胰腺癌Patu8988细胞增殖的抑制具有协同作用,其机制可能是联合下调K-ras、IGF-IR蛋白及K-ras、IGF-IR mRNA表达水平。     

敲低PRPF19对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨敲低PRPF19之后对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法利用GEPIA等数据库分析PRPF19在胰腺癌及其正常组织中的表达差异;通过Western blot和qRT-PCR检测胰腺癌细胞中PRPF19蛋白和mRNA的表达水平;小干扰RNA(siRNA)技术沉默胰腺癌细胞中PRPF19的表达,并通过Western blot和qRT-PCR验证其敲低效率;CCK-8、克隆形成以及Transwell实验检测敲低PRPF19对胰腺癌细胞增殖、克隆形成以及迁移和侵袭能力的影响。结果GEPIA分析显示,与正常胰腺组织相比,PRPF19在胰腺癌组织中高表达;与正常胰腺细胞相比,PRPF19在MIA PaCa-2、PANC-1等多种胰腺癌细胞系中高表达(P<0.05);与对照组相比,敲低PRPF19后,胰腺癌细胞的增殖速率明显下降,克隆形成数量、细胞迁移和侵袭数量均减少(P<0.05)。结论敲低PRPF19可抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,PRPF19可能作为胰腺癌的一个癌基因发挥重要作用。     

靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2可抑制胰腺癌细胞BxPC-3体外迁移和侵袭

目的:探讨靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2 (homo sapiens eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2,EEF1A2)对胰腺癌BxPC-3细胞体外迁移和侵袭的影响及其可能的分子机制.方法:应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测4种胰腺癌细胞株中EEF1A2的mRNA和蛋白表达水平.将EEF1A2-小干扰RNA (smallinterference RNA,siRNA)和阴性对照siRNA转染到BxPC-3细胞中,随后采用RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测EEF1A2的mRNA及蛋白表达,应用体外划痕和Transwell侵袭实验分别检测BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法检测转染前后细胞中p -Akt和总Akt蛋白的表达变化.结果:4种胰腺癌细胞株中除SW1990细胞呈EEF1A2低表达外,BxPC-3、Patu8988和Panc-1细胞均呈EEF1A2高表达.EEF1A2-siRNA转染BxPC-3细胞48 h后,EEF1A2 mRNA及蛋白表达水平较阴性对照siRNA转染的细胞和空白对照细胞明显降低(P＜0.01).EEF1A2-siRNA转染组BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力明显低于阴性转染对照组和空白对照组(P＜0.05).EEF1A2-siRNA转染组细胞中Akt的磷酸化水平明显低于对照组细胞(P＜0.05),而总Akt蛋白表达水平未显著改变(P＞0.05).结论:siRNA干扰下调EEF1A2基因表达可明显抑制胰腺癌BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭,其机制可能与EEF1A2调控Akt信号通路有关.     

HMGB1/TLR4通路参与Fibulin-5对肺癌细胞增殖和转移的抑制作用

背景与目的：Fibulin-5在肺癌组织中低表达,具有抑癌作用。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)在肺癌中高表达,能够促进肿瘤的侵袭转移。该研究旨在探讨Fibulin-5抑制肺癌细胞增殖和转移的分子机制。方法：该研究首先检测了肺上皮细胞和肺癌细胞中Fibulin-5和HMGB1的表达,然后利用转染试剂将Fibulin-5过表达质粒和HMGB1的siRNA转染人A549细胞。实现Fibulin-5过表达和HMGB1低表达后,采用MTT实验检测细胞增殖情况,Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测A549细胞中HMGB1 mRNA表达变化,采用酶联免疫吸附剂测定实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELisa)检测HMGB1蛋白的分泌;采用蛋白［质］印迹法(Western blot)检测HMGB1、cyclin D1、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和TLR4/NF-κB通路相关蛋白的表达变化。结果：在肺癌细胞A549中,Fibulin-5低表达,HMGB1高表达。过表达Fibulin-5和低表达HMGB1后,HMGB1、cyclin D1、MMP2、MMP7和MMP9的表达均明显降低,A549细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显减弱(P<0.05);此外,过表达Fibulin-5下调了TLR4、MyD88、p-p65的表达,上调了IκBα的表达(P<0.05)。结论：Fibulin-5可能是通过抑制HMGB1的表达以及其下游的TLR4/NF-κB通路,抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移的过程。     

结直肠癌组织中NEK2的表达及其对HCT116细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

目的 探讨中心体相关激酶2（NEK2）在结直肠癌组织中的表达及对结直肠癌细胞HCT116增殖、侵袭及迁移的影响。方法 构建针对NEK2的小干扰RNA（si-NEK2）,脂质体法转染HCT116细胞。CCK8实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell小室实验检测敲低NEK2表达后细胞增殖、周期分布、侵袭和迁移能力的改变。Western blot检测敲低NEK2表达后相关蛋白表达水平的改变。结果 NEK2在结直肠癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织（65.0% vs. 35.0%, χ²=14.593, P<0.01）,其表达水平与结直肠癌TNM分期、淋巴结转移和远处转移显著相关（均P<0.05）;NEK2蛋白及mRNA在结直肠癌细胞中的表达水平显著高于正常结直肠黏膜细胞（P<0.01）。敲低NEK2表达后,HCT116细胞出现明显的G₀/G₁期阻滞,细胞的增殖、侵袭及迁移能力均显著降低（P<0.01）,E-cadherin表达含量升高,N-cadherin、CDK4和cyclin D1表达含量降低。结论 NEK2在结直肠癌组织中高表达并与临床病理特征相关,下调NEK2表达可有效抑制人结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。提示NEK2在结直肠癌的发生发展过程中发挥着重要的作用,可作为潜在的治疗靶点。