PRL-3表达载体构建及其对结直肠癌细胞生长的影响

目的:构建PRL-3过表达载体,研究其对结直肠癌细胞系SW620生长的影响。方法:提取Hela细胞总RNA并反转为cDNA,以cDNA为模板通过PCR反应扩增PRL-3基因,将扩增产物克隆至表达载体pcDNA3.1,通过转染让SW620细胞过表达PRL-3,空载体组和空白组作为阴性对照。qPCR、Western blot实验用来检测PRL-3在SW620细胞的表达水平,CCK-8实验、平板克隆形成实验用来检测SW620细胞的增殖状况,流式细胞术用来检测SW620细胞的周期分布。结果:成功构建了PRL-3过表达载体。与空载体组和空白组相比,PRL-3过表达载体转染结直肠癌细胞系SW620后,qPCR检测PRL-3表达水平上调数倍。CCK-8实验表明过表达PRL-3能够促进SW620细胞增殖。平板克隆形成实验表明上调PRL-3能够增强SW620细胞增殖能力。流式细胞术结果表明过表达PRL-3能够加快SW620细胞周期进程。结论:PRL-3能够促进结直肠癌细胞系SW620生长,为结直肠癌早期诊断和靶向治疗提供实验依据。     

HSP90β干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在骨肉瘤细胞Saos-2中的表达

目的:获得热休克蛋白90β(HSP90β)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并检测其在人骨肉瘤细胞株Saos-2中的表达水平。方法:设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒构建HSP90β干扰和过表达载体,酶切电泳、测序技术鉴定载体构建是否成功。重组病毒转染H1299细胞,以嘌呤霉素筛选稳定转染的Saos-2细胞,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为干扰NC组（NEG-shRNA）、干扰组（shRNA-HSP90β）、过表达NC对照组（NEG-pEZ）及过表达组（pEZ-HSP90β）。通过qRT-PCR 与Western blotting 分别从mRNA 和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果:插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。病毒包装成功后,嘌呤霉素最小致死浓度1 μg/ml,感染复数200,感染人Saos-2的感染效率达80%,其中shRNA-HSP90β组干扰效率为86.35%,pEZ-HSP90β组的mRNA相对表达量增加2.8倍。进一步研究发现,shRNA-HSP90β组较NEG-shRNA组中HSP90β蛋白表达明显降低,pEZ-HSP90β组较NEG-pEZ组HSP90β蛋白表达增加。结论:HSP90β基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在Saos-2中稳定表达。     

骨肉瘤细胞凋亡相关基因的表达及其临床意义

目的 探讨反映骨肉瘤预后的蛋白标记物。方法 对骨肉瘤石蜡组织作免疫组化和Tunel染色,研究p53 c-myc和bcl-2基因的表达与肿瘤细胞凋亡指数(Al)的关系,及其与病理类型和患者颅后的关系。结果 p53、c-myc和bcl-2的表达水平与细胞凋亡指数呈负相关,与病理类型无相关关性。p53、c-myc、bcl-2和细胞凋亡指数与患者远期生存密切相关。结论 p53、c-myc和bcl-2的表达水平以及细胞凋亡指数可作为判断骨肉瘤恶性程度和预后的指标,可指导临床进行治疗。     

哺乳动物细胞CDK2系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）在哺乳动物细胞的表达载体,为研究CDK2的功能和修饰提供实验材料。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增CDK2编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK2片段分别亚克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;最后,将获得的表达载体PEGFP/CDK2转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行初步的CDK2表达分析。结果：RT-PCR扩增获得约900 bp的目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析,显示重组片段是人CDK2基因序列;CDK2片段分别亚克隆入上述4种载体后获得相应表达载体;运用构建的PEGFP/CDK2表达载体,在NIH3T3细胞中表达出CDK2蛋白。结论：成功构建了CDK2的哺乳动物细胞系列表达载体,并在NIH3T3细胞中成功表达目的蛋白。     

miR-513a-5p慢病毒载体的构建及其对人骨肉瘤细胞放疗敏感性的影响

目的:构建miR-513a-5p慢病毒过表达载体,转染人骨肉瘤细胞株,观察miR-513a-5p对人骨肉瘤细胞放疗敏感性的影响。方法:PCR法扩增人miR-513a-5p基因,克隆入pLentis-CMV-GFP-MCS-PGK-PURO载体获得重组质粒pLentis-miR513a,双酶切鉴定并测序后将正确的重组质粒和对照质粒转染293FT细胞制备慢病毒,分别转染骨肉瘤HOS和U2OS细胞,qRT-PCR法及荧光显微镜鉴定转染结果。克隆形成实验、MTT法检测miR-513a-5p高表达HOS和U2OS细胞在X射线照射下细胞存活情况。结果:双酶切及测序结果确定成功构建miR-513a-5p慢病毒载体pLentis-miR513a。qRT-PCR结果提示,转染骨肉瘤细胞株后miR-513a-5p表达显著升高。克隆形成实验结果显示miR-513a-5p高表达后骨肉瘤细胞在X射线照射下细胞增殖减慢。MTT结果提示miR-513a-5p高表达骨肉瘤细胞经X射线照射后细胞存活减少。结论:成功构建了miR-513a-5p慢病毒载体,建立了高效稳定表达miR-513a-5p的骨肉瘤细胞株,高表达miR-513a-5p能显著增加X射线照射后骨肉瘤细胞的放疗敏感性。     

TSLC1基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

Objective： To construct the eukaryotic expression vector for human TSLC1 gene, and to express TSLC1 in HepG2 cells for investigating its effect on HepG2 cell growth. Methods： Full length of TSLC1 cDNA was amplified from RNA of normal human liver by RT-PCR, and cloned into pCI-neo expression vector. The recombinant plasmid pCI-TSLC1 was identified with restriction enzyme and sequenced, and then was stably transfected into HepG2 cells with lipofectamine 2000. The positive clones were examined by western-blotting and immunofluorescence, cell growth was analyzed with MTT assay. Results： The eukaryotic expression vector pCI-TSLC1 was successfully constructed and the stable cell line highly expressing TSLC1 protein was obtained. The growth of TSLCl-transfected cells was significantly suppressed in vitro. Conclusion： The HepG2 stable cell line could highly express TSLC1 protein, which provided a basis for further exploring the roles of TSLC1 in hepatocellular carcinoma.     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2     

miR-215抑制骨肉瘤细胞生长及其分子机制

目的:研究miR-215对骨肉瘤细胞143B生长的影响及其分子机制。方法:通过转染miR-215 agomir稳定升高143B细胞内miR-215表达水平，CCK-8实验、平板克隆形成实验以及流式细胞术检测143B细胞的增殖状况以及周期分布。利用生物信息学分析miR-215潜在的靶基因，并通过双荧光素酶报告基因实验、qPCR实验、Western blot实验验证miR-215靶基因。结果:在143B细胞内将miR-215表达水平上调数倍。CCK-8实验、平板克隆形成实验表明miR-215能够抑制143B细胞生长，流式细胞术实验表明miR-215能够延缓143B细胞周期进程。生物信息学、qPCR实验和Western blot实验表明转化生长因子β受体1（transforming growth factor β receptor 1，TGFβR1）是miR-215潜在的靶基因。结论:miR-215能够抑制骨肉瘤细胞生长，并且该抑制作用可能通过miR-215靶向抑制TGFβR1实现，为骨肉瘤早期诊断和靶向治疗提供了理论依据。     

RI基因真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞生长的影响

目的通过构建核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor, RI)基因的真核表达载体——pLNCX-ri, 并转染C6神经胶质瘤细胞,探讨RI抑制肿瘤生长的作用机制.方法用Nde I / Xho从已构建的pET-ri上切下1.4 kb的RI基因片段,再构建到pLNCX上,获得真核表达载体(pLNCX-ri),采用Lipofect AMINE辅助转染大鼠C6神经胶质瘤细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,用Western blotting 检测RI基因的表达水平.将转染阳性的C6神经胶质瘤细胞接种于大鼠皮下,观察肿瘤的生长情况.结果在转染的C6神经胶质瘤细胞中,RI基因的表达量明显高于未转染的C6神经胶质瘤细胞,转染阳性的C6神经胶质瘤细胞在大鼠体内的成瘤潜伏期23±5.7天(对照组14±3.5天),瘤组织重量转染组1.35±0.43g比对照组2.40±0.61g(P＜0.01)明显下降,瘤组织的血管密度转染组27.2±4.31比对照组47±6.54(P＜0.01)明显减少.结论RI基因的转染对肿瘤的生长有明显抑制作用,其作用机制可能是抑制肿瘤组织血管的形成.     

Rap2b基因真核表达载体构建及其对NIH3T3细胞P38通路的影响

目的构建pcDNA3.1-Rap2b真核表达载体,以外源基因Rap2b转染NIH3T3细胞,以了解该基因对NIH3T3细胞AKT、ERK、JNK和P38信号转导通路的影响,为探讨该基因在人肺癌发生中的作用提供实验依据。方法构建人Rap2b真核表达载体pcDNA3.1-Rap2b并稳定转染NIH3T3细胞,利用Western blot方法对转染的细胞进行AKT、ERK、JNK和P38磷酸化蛋白及总蛋白表达水平检测。结果转染pcDNA3.1-Rap2b质粒的细胞与转染空质粒pcDNA3.1的细胞相比,其AKT、ERK、JNK磷酸化蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）,而P38磷酸化蛋白表达水平明显上调（P＜0.05 ）。结论Rap2b基因外源性高表达可能对P38通路有活化作用,对JNK、ERK、AKT通路无活化作用。     

骨肉瘤患者血清血管内皮生长因子及血管生成素-2的表达

目的:研究骨肉瘤患者血清血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素-2（Ang-2）表达的动态变化,为临床相关诊治提供参考。方法:回顾性分析铜川市人民医院和榆林市第一医院于2016年1月至2018年1月期间收治的骨肉瘤患者40例作为观察组,同期选取两院参加健康体检的50例健康个体作为对照组。采用酶联免疫吸附法（ELISA法）对比两组患者VEGF、Ang-2含量,并比较肿瘤TNM不同分期、不同肿瘤直径及是否出现肺内转移患者上述指标含量变化。结果:两组间相比,观察组患者血清VEGF、Ang-2含量均高于对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）;不同分期相比,Ⅲ期患者血清VEGF、Ang-2含量均高于Ⅱb期,而Ⅱb期患者高于Ⅱa期,差异均有统计学意义（P＜0.05）;不同肿瘤直径及转移相比,肿瘤直径≥5 cm患者血清VEGF、Ang－2水平高于肿瘤直径＜5 cm者,且出现肺内转移患者血清VEGF、Ang-2水平高于无肺内转移者,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论:骨肉瘤患者血清VEGF、Ang-2含量增高,且随着肿瘤分期增加而升高,且与肿瘤直径及转移呈正相关,可为临床诊治提供重要参考。     

长链非编码RNA FOXD2-AS1在骨肉瘤细胞中的表达及功能

目的:探讨长链非编码RNA FOXD2-AS1在骨肉瘤细胞中的表达谱及其功能。方法:前期对5对组织（骨肉瘤组织和正常组织）进行转录组学测序筛选出差异表达的lncRNAs,并筛选出上调变化的具有研究意义的前五位lncRNAs。通过荧光定量PCR进一步在骨肉瘤组织及正常组织内验证lncRNA FOXD2-AS1差异表达这一趋势,利用siRNA技术干扰其表达,筛选出干扰lncRNA FOXD2-AS1效率最高的两条siRNAs,CCK-8法及流式细胞术检测敲减lncRNA后细胞增殖及凋亡是否发生变化。结果:转录组学测序筛选出上调变化明显的前5位lncRNAs,并进一步通过实时荧光定量PCR显示lncRNA FOXD2-AS1在骨肉瘤组织内高表达,CCK-8法及流式细胞术结果显示该高表达的lncRNA FOXD2-AS1促进骨肉瘤细胞增殖,且抑制骨肉瘤细胞的凋亡。结论:骨肉瘤与正常组织相比,存在明显的高表达lncRNAs,且高表达的lncRNA FOXD2-AS1促进骨肉瘤的增殖并抑制其凋亡,在骨肉瘤进展中发挥至关重要的作用。     

肝细胞生长因子cDNA真核表达载体的构建

目的：构建肝细胞生长因子cDNA真核表达载体。方法：提取大鼠胎肝总RNA,利用RT—PCR技术扩增出肝细胞生长因子cDNA,连接于载体pMDl8-T质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果。结果：成功构建肝细胞生长因子cDNA真核表达载体。结论：为进一步研究HGF与肝癌的关系提供了实验基础。     

肝细胞生长因子cDNA真核表达载体的构建

目的:构建肝细胞生长因子cDNA真核表达载体。方法:提取大鼠胎肝总RNA,利用RT-PCR技术扩增出肝细胞生长因子cDNA,连接于载体pMD18-T质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果。结果:成功构建肝细胞生长因子cDNA真核表达载体。结论:为进一步研究HGF与肝癌的关系提供了实验基础。     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

核转运蛋白KPNA2 与肿瘤关系的研究进展

KPNA2 作为核转运蛋白家族成员之一,通过核浆运输功能调节多种蛋白的核转位,而参与细胞分化、增殖凋亡、转录调节、免疫反应和病毒感染等多种生命活动。近年来研究表明KPNA2 在多种肿瘤组织中表达上调,并且KPNA2 的异常表达与患者预后差相关,提示KPNA2 在肿瘤形成和进展过程中扮演重要角色。经细胞学研究证实,KPNA2 亦参与细胞的恶性转化。因此,本文对KPNA2 的功能及在肿瘤中的研究进展进行综述。      

骨肉瘤患者血清中miRNA-448的表达水平及临床意义

目的:探讨骨肉瘤患者血清中miRNA-448 的作用及意义。方法:采用qRT-PCR检测健康志愿者和骨肉瘤患者外周血miRNA-448的表达。microRNA靶基因数据库预测miRNA-448与Bcl-2基因可能的作用位点。qRT-PCR及Western blot实验分析miRNA-448对Bcl-2的靶向抑制作用。CCK8法检测对照组、miRNA-448 mimics转染组、miRNA-448 mimics和Bcl-2转染组中R-1059-D增殖情况。结果:骨肉瘤患者血清中miRNA-448表达水平明显低于健康志愿者（P＜0.05）,复发型骨肉瘤患者血清中miRNA-448表达水平明显低于原发型骨肉瘤患者（P＜0.05）,miRNA-448在血清中的表达水平与骨肉瘤病变及恶性程度呈负相关（P＜0.05）。microRNA靶基因数据库预测潜在的miRNA-448靶基因为Bcl-2,miRNA-448通过结合Bcl-2的3'-UTR进而抑制Bcl-2的表达。miRNA-448可以抑制R-1059-D的增殖,而这种抑制效果可以被Bcl-2回补。ROC曲线分析显示,血清中miRNA-448表达水平可以有效区分骨肉瘤患者和健康对照组。结论:miRNA-448通过抑制Bcl-2表达促进细胞凋亡,在骨肉瘤的病理过程中起着关键作用。miRNA-448可作为一种抑癌基因成为诊断骨肉瘤的生物标志物。