p33ING1b增强骨肉瘤细胞U2OS对足叶乙甙的敏感性

背景与目的作为一个新的抑癌基因,ING1与p53有许多相似的生物学功能,如细胞生长抑制、DNA修复、凋亡和化疗敏感性等.本实验目的在于研究p33ING1b对骨肉瘤细胞药物敏感性的影响并探讨其作用机制.方法瞬时转染p33ING1b进入骨肉瘤细胞株U2OS后,用足叶乙甙(etoposide,VP-16)处理24 h,然后采用台盼蓝拒染法计数活细胞数并计算细胞生长抑制率,流式细胞仪、DAPI染色等方法检测细胞凋亡率,Western blot技术检测p53、p21WAF1、MDM2和Bax蛋白的表达.结果台盼蓝染色结果表明,瞬时转染p33ING1b进入骨肉瘤细胞株U2OS后,再用VP-16处理24 h,细胞生长抑制率明显增加[(63.1±5.1)%].流式细胞计数和DAPI染色检测结果表明,细胞凋亡率明显增加(62.7%).Western blot检测结果显示,外源性p33 ING1b高表达明显提高了p53及其下游基因p21WAF1和Bax蛋白的表达水平,转染p33ING1b进入骨肉瘤细胞株U2OS后,再用VP-16处理24 h,p53、p21和Bax蛋白表达增加.在各实验组中,MDM2的蛋白表达没有明显变化.结论p33ING1b能够上调p53蛋白,并上调p53下游因子--p21WAF1和Bax的表达水平,通过p53依赖性凋亡信号通路,提高骨肉瘤细胞U2OS对VP-16的敏感性.     

反义c-myc重组腺病毒的构建及其抗骨肉瘤细胞的作用

背景与目的:c-myc原癌基因在细胞的增殖调节中发挥重要作用,研究表明c-myc在骨肉瘤中常常扩增和过表达,而且具有促进细胞转化和诱导转移的特性。本文构建表达反义c-myc的重组腺病毒,并探讨其对不同p53基因型的骨肉瘤细胞系MG-63(P53缺失型)、U2OS(p53野生型)的影响。方法:应用基因重组技术构建表达反义c-myc的重组腺病毒(Ad-As-c-myc),并在体外转染MG-63、U2OS细胞,采用蛋白免疫印迹(Westernblot)、吖啶橙染色、RT-PCR、流式细胞仪(FCM)等方法检测或观察其对细胞c-mycmRNA表达、瘤细胞体外增殖、凋亡及细胞周期的影响。结果:成功构建Ad-As-c-myc,滴度可达2×109pfu/ml,体外转染MG-63、U2OS细胞后可明显抑制细胞的体外增殖,而且对携带野生型p53的U2OS更敏感。Ad-As-c-myc转染48h后可降低c-mycmRNA表达。吖啶橙染色及FCM检测证实,转染Ad-As-c-myc可诱导骨肉瘤细胞凋亡,细胞周期分析显示转染Ad-As-c-myc的MG-63细胞出现G2/M期阻滞,而U2OS细胞出现G1期阻滞。结论:腺病毒介导反义的c-myc能以p53依赖或非依赖性途径诱导骨肉瘤细胞凋亡,并抑制骨肉瘤细胞的增殖。     

白花丹素对骨肉瘤MG-63细胞迁移的影响及其作用机制

目的 观察白花丹素对骨肉瘤细胞迁移的抑制作用并初步探讨其可能的机制.方法 以2.5 μmol/L、5μmol/L和10 μmol/L浓度白花丹素分别作用于骨肉瘤MG-63细胞,以含0.1％ DMSO完全培养基为对照组.作用24 h后,Transwell法观察骨肉瘤MG-63细胞迁移能力,Real-time PCR检测骨肉瘤MG-63细胞中Ezrin基因mRNA表达情况,Westem blot检测Ezrin蛋白和p-Ezrin的表达情况.结果 Transwell结果显示,作用24h后,各实验组下层小室细胞数明显减少,2.5 μmol/L组、5μmol/L组和10 μmol/L组的细胞迁移率分别为(69.9±4.5)％、(39.3±3.5)％和(26.2±4.1)％,呈浓度依赖性(P＜0.05);Real-time PCR结果显示,骨肉瘤MG-63细胞中Ezrin mRNA表达水平明显下降,呈浓度依赖性(P＜0.05).Western blot结果显示,Ezrin蛋白和p-Ezrin的表达量明显降低,呈浓度依赖性(P＜0.05).结论 白花丹素能够抑制骨肉瘤MG-63细胞迁移,其作用机制可能与抑制骨肉瘤MG-63细胞中Ezrin的表达及活化有关.     

siRNA抑制骨肉瘤U2OS细胞系中SIRT6的表达及其生物学作用研究

背景与目的：sirtuin6(SIRT6)蛋白是对人体细胞生长、代谢调控及应激反应等具有重要作用的一种核蛋白,常在细胞核中发挥多种调控作用。但该蛋白在骨肉瘤中的作用还不清楚,本研究通过下调人骨肉瘤U2OS细胞系中SIRT6的表达,观察其对U2OS细胞的作用。方法：设计合成SIRT6的siRNA序列,通过Lipofectamine^TM2000转染U2OS细胞系,通过蛋白质印迹法（Western blot）检测SIRT6蛋白的表达情况,利用流式细胞术检测细胞凋亡,细胞计数试剂盒（cellcounting kit-8,CCK-8）法检测细胞增殖,Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力,CCK-8法分析对紫杉醇的敏感性。结果：成功构建SIRT6 siRNA序列,Western blot检测转染后24、48和72 h的蛋白水平,实验组较对照组明显降低。流式细胞术检测细胞凋亡也显示实验组凋亡增加（P＜0.05）。Transwell法检测结果显示,实验组侵袭与迁移能力较对照组下降（P＜0.05）。CCK-8法检测细胞生长情况,可见经紫杉醇处理后实验组生长较对照组下降明显,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：下调骨肉瘤U2OS细胞中SIRT6的表达可以抑制骨肉瘤细胞侵袭,促进凋亡,并增强骨肉瘤细胞对紫杉醇的化疗敏感性。     

奇果菌素诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡及其机制的研究

目的 研究奇果菌素（grifolin）诱导骨肉瘤U2OS细胞体外生长抑制及诱导凋亡的作用及其机制.方法 应用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法测定奇果菌素对U2OS细胞的生长抑制实验;荧光显微镜下（Hoechst 33258荧光染色）观察细胞核形态学变化;流式细胞仪检测细胞的凋亡率;Western blot法检测Akt、GSK3、FKHRL蛋白表达.结果 奇果菌素的浓度在50μm以上时对骨肉瘤U2OS细胞具有明显的生长抑制作用,呈明显的时间和浓度效应关系;并能诱导细胞发生凋亡,出现凋亡小体,呈典型的凋亡细胞形态;随着药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞的生长抑制率及细胞凋亡率均明显升高,50.0μm的奇果菌素作用U2OS细胞0,6,12,24h后,细胞出现不同程度的亚G1峰,细胞凋亡率分别为1.96%、13.91%、52.6%、63.5%;Western blot法分析表明U2OS细胞经过50.0μm和100μm的奇果菌素作用24h后,U2OS细胞的Akt、FKHRL、GSK3的表达均下调,表示其表达水平及活性显著降低.结论 奇果菌素能够通过诱导人骨肉瘤U2OS细胞发生凋亡而发挥抑制U2OS细胞生长作用,尤其当奇果菌素的浓度＞50.0μm,其对U2OS细胞增生的抑制作用呈剂量和时间依赖性,抑制Akt和GSK3的活性是奇果菌素体外诱导人骨肉瘤U2OS细胞发生凋亡的重要作用机制之一.     

蟾毒灵诱导骨肉瘤U-2OS和U-2OS/MTX300细胞系的凋亡

目的 研究蟾毒灵对人骨肉瘤细胞株的增殖抑制和诱导凋亡作用.方法 以不同浓度的蟾毒灵分别作用于骨肉瘤细胞U-2OS和甲氨蝶呤(MTX)耐药骨肉瘤细胞U-2OS/MTX300.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期,DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA ladder凋亡条带,Western blot法检测凋亡相关蛋白p53、bax和bcl-2的表达.结果 蟾毒灵能明显抑制骨肉瘤细胞的增殖,其对U-2OS和U-2OS/MTX300细胞的IC50值分别为(8.49±2.1)ng/ml和(10.19±1.7)ng/ml(P＞0.05).蟾毒灵处理U2OS和U-2OS/MTX300细胞48 h后,细胞均出现明显的染色质凝集,有典型的凋亡小体产生.同时,蟾毒灵能诱导骨肉瘤细胞凋亡,其作用机制是通过阻滞细胞周期于G2/M期、上调p53、bax表达和下调bcl-2的表达来实现.结论 蟾毒灵能显著抑制人骨肉瘤细胞U-2OS和U-2OS/MTX300的生长,并诱导细胞凋亡,其抗骨肉瘤作用不受MTX耐药的影响.     

p53核输入功能在鼠双微体2调节的p53蛋白降解和泛素化中的作用

目的研究p53核输入功能在鼠双微体2(murine double minute2,MDM2)调节的p53降解与泛素化中的作用。方法由直接点突变的方法构建质粒,将决定p53-GFP核位置信号(NLS)的两个部分5个基本氨基酸(赖氨酸和精氨酸)单一替换为丙氨酸,构建了p53-NLS突变型053KRKKK-GFP,并且经DNA序列确定。用DNA克隆技术将p53KRKKK与pEGF-Nuc融合,构建了p53KRKKK-NLS-GFP,然后分别转染U2OS细胞,在荧光显微镜下直接观察活细胞的蛋白表达部位;同时用间接免疫荧光染色、Western blot和泛素化分析的方法,观察p53KRKKK与MDM2野生型或MDM2-NLS突变型共转染U2OS细胞时的蛋白表达部位、降解和泛素化现象。结果p53KRKKK-GFP蛋白表达完全在细胞浆,并且不能被野生型和NLS突变型的MDM2降解,但是可以被泛素化。p53KRKKK-NLS-GFP可以使p53蛋白表达重新回到细胞核,此时能被MDM2野生型和NLS突变型降解和泛素化。p53野生型和NLS突变型均可被MDM2野生型和NLS突变型泛素化,当p53KRKKK和MDM2-NLS同时表达在细胞浆时,p53蛋白出现了更高效率的泛素化,但不能被降解。结论p53核输入对由MDM2调节的p53降解是必须的;MDM2调节的p53泛素化可以出现在细胞浆,而且效率更高。     

下调Skp2表达抑制骨肉瘤U2OS细胞恶性表型的实验

 目的 通过使用小干扰RNA（siRNA）降低骨肉瘤中S期激酶相关蛋白2（Skp2）的表达，探讨Skp2对骨肉瘤恶性生物学行为的影响及其分子机制。方法 转染Skp2 siRNA敲低骨肉瘤U2OS细胞中Skp2的表达。通过RT-qPCR和Western blot法检测细胞内Skp2的mRNA和蛋白表达水平，确定Skp2 siRNA的沉默效率。MTT法检测细胞增殖情况，PI单染及Annexin V/PI双染后用流式细胞仪检测对骨肉瘤细胞周期及凋亡的影响。Transwell实验和钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein-AM）染色检测细胞的迁移和侵袭。Western blot检测细胞内Skp2的下游基因p21、p27、p-Akt及E-cadherin的表达变化。结果 转染Skp2 siRNA在U2OS细胞中获得较高的敲除效率。Skp2表达下调抑制了骨肉瘤细胞的增殖，并且使细胞生长阻滞在G0/G1期，细胞的凋亡率明显增加。抑制Skp2后U2OS细胞的侵袭和迁移能力明显降低。U2OS细胞Skp2敲低后其下游调控分子p21、p27及E-cadherin的表达显著升高，而p-Akt的表达则明显减弱。结论 Skp2在骨肉瘤细胞中发挥癌基因的作用，通过调控其信号通路中p21、p27、p-Akt及E-cadherin的表达影响细胞生长、周期、凋亡、侵袭和迁移能力等恶性生物学行为。     

骨肉瘤外泌体miR-21通过调控PI3K/AKT通路促进骨肉瘤细胞侵袭及血管生成北大核心

目的:探讨骨肉瘤外泌体miR-21对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响以及对血管生成的作用机制。方法:qRT-PCR法检测人正常骨细胞hFOB1.19与人骨肉瘤细胞系U2OS、Saos-2和MG-63中miR-21的表达,并确定表达水平高的作为本研究细胞系。通过差速离心提取细胞外泌体,并采用透射电镜和Western blot鉴定该外泌体;通过免疫荧光染色检测外泌体能否进入人血管内皮细胞(human vascular endothelial cells,HUVEC)发挥作用;利用脂质体2000分别转染Control、miR-21-inhibitor以及miR-21-mimic,通过Transwell实验检测外泌体miR-21对U2OS细胞侵袭能力的影响,并进一步采用Western blot检测miR-21对血管相关蛋白VEGF、HIF-1α以及PI3K/AKT通路蛋白的影响。结果:人骨肉瘤细胞系Saos-2、MG-63和U2OS中miR-21均呈高表达。透射电镜观察到,外泌体呈圆形或椭圆形泡状结构,且其特征蛋白CD9、CD63和CD81蛋白在外泌体中较U2OS细胞中表达高。免疫荧光结果显示,U2OS外泌体能成功进入HUVEC细胞中发挥作用。Transwell实验结果表明,外泌体miR-21可以促进骨肉瘤细胞侵袭。Western blot结果表明,与Control组相比,miR-21-mimic组血管生成蛋白VEGF和HIF-1α表达水平显著上升,PI3K/AKT通路蛋白表达水平亦显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:U2OS外泌体miR-21可以促进骨肉瘤细胞侵袭和血管生成,其作用机制可能与miR-21进入细胞激活PI3K/AKT信号通路有关。     

蟾酥水提取物抗骨肉瘤作用的体外研究

目的　探讨蟾酥水提取物对骨肉瘤细胞系U2 OS的生长抑制和诱导凋亡作用 ,及其作用的机制。方法　应用MTT法 ,测定蟾酥水提取物对U2 OS细胞株活性的影响 ,检测其抑制骨肉瘤细胞的时间效应和剂量效应 ;应用形态学观察、FCM ,测定蟾酥水提取物对U2 OS细胞的凋亡作用 ,并进行细胞周期的分析。结果　蟾酥水提取物对U2 OS细胞具有生长抑制及诱导凋亡作用 ,且呈时间依赖和剂量依赖。表现为细胞G0 /G1期阻滞、出现明显的凋亡峰 ;有核碎裂、染色体凝集 ,对U2 OS细胞的IC5 0值为 97 96±8 2 3 μg/ml(P <0 0 5 )。结论　蟾酥水提物对骨肉瘤U2 OS细胞株的增殖有凋亡和抑制作用     

RNA干扰沉默mdm2治疗骨肉瘤的实验研究

目的 观察靶向mdm2的小干扰RNA(siRNA)对骨肉瘤生长的影响.方法 构建PGCsilencerTM-mdm2 siRNA,转染至骨肉瘤细胞U2OS.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测siRNA对mdm2的沉默效果,采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测siRNA对细胞增殖的影响,应用流式细胞术检测诱导细胞凋亡的情况.通过裸鼠移植瘤模型观察siRNA对骨肉瘤体内治疗效果.结果 成功构建simdm2质粒.在转染simdm2的U20S细胞中,simdm2-1组和simdm2-2组的mdm2 mRNA表达量分别下降至空白对照组的35.6%和42.1%(P<0.05),mdm2蛋白表达分别降低至空白对照组的34.0%和47.2%(P<0.05),而且增殖能力显著降低,发生明显凋亡,simdm2-1组和simdm2-2组的细胞凋亡率分别为29.9%和20.9%.阴性对照组和空白对照组的差异无统计学意义.裸鼠移植瘤实验结果显示,simdm2转染组的肿瘤受到抑制,而且mdm2基因和蛋白表达明显下调.结论 simdm2能有效的抑制骨肉瘤生长,并抑制mdm2基因和蛋白的表达.     

绿原酸对人胶质瘤细胞U251的抗肿瘤活性及其促凋亡机制

 目的 研究绿原酸对人胶质瘤细胞U251细胞株增殖、凋亡的作用及其机制。方法 培养人胶质瘤U251细胞，不同浓度绿原酸处理细胞48 h后，CCK-8法检测细胞生长抑制率，观察细胞形态学变化；Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡，RT-PCR及Western blot检测p53、Livin、Bcl-2、Bax mRNA和蛋白的表达，Western blot检测Caspase-3蛋白的表达。结果 不同浓度绿原酸干预U251细胞48 h后显著抑制细胞的增殖活性，促进细胞凋亡，并且能够上调p53和Bax基因，下调Livin、Bcl-2 mRNA和蛋白的表达，促进Caspase-3蛋白的表达。结论 绿原酸可能是通过上调p53和Bax的表达，下调Livin和Bcl-2的表达，激活Caspase-3蛋白，最终诱导U251细胞凋亡。     

异甜菊醇对骨肉瘤细胞U-2OS生长的影响

背景与目的：骨肉瘤恶性程度高、发展迅速、易转移且致残致死率高;其常用化疗药物的长期应用不良反应较大,存在着一定的局限性。异甜菊醇具有四环二萜结构,是很多抗癌药的合成起始剂,但其自身的抗癌活性鲜有报道。该研究旨在考察异甜菊醇对骨肉瘤细胞U-2OS生长的影响,并初步探讨其作用机制。方法：通过MTT实验检测异甜菊醇对U-2OS细胞生长的影响;分别通过Hoechst 33342和PI染色分析细胞状态,检测细胞活性氧和细胞膜电位;用流式细胞术分析异甜菊醇处理细胞后细胞周期;通过蛋白[质]印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的差异表达。结果：异甜菊醇对骨肉瘤细胞U-2OS的抑制呈现出时间和剂量依赖性;染色和流式细胞术实验显示,异甜菊醇对骨肉瘤细胞U-2OS作用24 h观察到细胞S期周期阻滞,48 h时观察到细胞凋亡;随着药物浓度升高活性氧显著增多,细胞膜电位逐渐降低,促凋亡相关蛋白Bax的表达上调,抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达下调。结论：异甜菊醇对人骨肉瘤U-2OS细胞有抑制生长作用,其作用机制可能与上调Bax及下调Bcl-2等凋亡相关蛋白的表达有关。     

Effects of Kruppel-like factor 6 on osteosarcoma cell biological behavior

Kruppel-like factor 6 (KLF6) is a tumor suppressor gene frequently downregulated in a number of human cancers, including osteosarcoma. However, the role of KLF6 in osteosarcoma remains unclear. This study was aimed at investigating the effects of KLF6 on osteosarcoma cell biological behavior. First, the expression of KLF6 in osteosarcoma cell lines (MG63, SaOS-2, U2OS, and HOS) and a human osteoblastic cell line (hFOB1.19) was detected by Western blotting. Results showed that KLF6 displayed a significant downregulation in osteosarcoma cell lines (MG63, SaOS-2, U2OS, and HOS) compared with human osteoblastic cell line (hFOB1.19). To investigate the role of KLF6 in osteosarcoma cell proliferation, apoptosis, and invasion, we generated human osteosarcoma MG63 cells in which KLF6 was either overexpressed or depleted. The MG63 cell viability, cycle, apoptosis, and invasive ability were analyzed by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide staining, propidium iodide (PI) staining, Annexin-V-FITC/PI double staining, and Transwell invasion experiment, respectively. Results showed that the viability, proliferation, and invasive abilities were suppressed, and the apoptosis was enhanced in MG63 cells with overexpression of KLF6. The viability, proliferation, and invasive abilities were improved, and the apoptosis was inhibited in MG63 cells with knockdown of KLF6. At the same time, these molecules, including p21, bcl-2, and MMP-9, associated with the events about cell cycle, apoptosis, and invasion, were detected. Results showed that the expressions of bcl-2 and MMP-9 were downregulated, and the expressions of p21 were upregulated in the MG-63 cells with overexpression of KLF6. Taken together, our results suggested that KLF6 could inhibit proliferation and invasion, and facilitate apoptosis of osteosarcoma cells, which might be a potential target for the treatment of osteosarcoma.