一种卵巢癌类器官的制备方法建立及鉴定

目的探索卵巢癌类器官模型制备方法。方法选取2019—2020年于广西医科大学附属肿瘤医院初次手术的3例卵巢癌患者原发灶肿瘤组织,解离成细胞悬液后用基质胶Matrigel包被,培养2周形成单个直径超过100μm的球状体后进行消化传代,培养至第2代的球状体用石蜡包埋切片,脱色后进行HE染色和免疫组化,并与原组织对比,进行组织学和细胞学评判。结果构建出1例可传代冻存的卵巢癌类器官,HE染色结果显示类器官与原组织的腺癌结构高度相似,免疫组化结果显示原组织与类器官p53、PAX-8、WT-1和CK7标志物的表达情况基本一致。结论用Matrigel包被并浸润培养液培养的方法可以成功构建与原组织在组织和细胞层面鉴定结果基本一致的卵巢癌类器官。     

Chk1在胶质母细胞瘤中的表达及其与肿瘤生物学行为和预后生存的关联性

目的 研究细胞周期检测点激酶1(Checkpoint kinase 1,Chk1)在胶质母细胞瘤细胞(Glioblastoma,GBM)中的表达及其与GBM细胞增殖、成瘤活性和预后生存的关联性。方法 利用TCGA数据库和脑肿瘤分子数据库(Rembrandt)选择和分析GBM中Chk1的表达,并采用Western blot和Real-time PCR等分子生物学技术检测GBM细胞中Chk1的表达水平;通过慢病毒转染siRNA沉默Chk1的表达以探究其对于GBM细胞增殖和成球能力的影响;同时利用免疫组化染色及Rembrandt数据库对Chk1与GBM患者的预后生存关系进行分析。结果 TCGA和Rembrandt数据库分析结果表明Chk1在GBM组织中呈现高表达,同样Western blot和Real-time PCR检测结果显示Chk1在GBM细胞中呈现高表达;慢病毒转染siRNA特异性沉默Chk1能够显著抑制U87细胞的生长(P＜0.01)和成球能力(P＜0.05);预后生存分析结果显示Chk1低表达GBM患者的临床预后显著优于高表达患者(P＜0.001)。结论 Chk1在GBM细胞中过量表达,表达上调能够促进GBM细胞的生长和增殖,并和GBM患者的不良预后相关。     

ZDHHC12在胶质母细胞瘤中通过YAP1调控肿瘤特性

背景和目的：胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）是目前常见的恶性脑部肿瘤之一,但GBM相关发病机制仍不完全清楚。本研究旨在分析锌指DHHC结构域蛋白（zinc finger DHHC domain-containing protein,ZDHHC）12对Yes相关蛋白1（Yes-associated protein 1,YAP1）的调控,以及ZDHHC12/YAP1轴对GBM肿瘤特性的调控。方法：在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库以及基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression,GTEx）数据库中分析ZDHHC12分别在正常脑组织及GBM中的表达情况,运用蛋白质印迹法（Western blot）以及实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）检测,分析在U87、U251以及人正常星形胶质细胞（NHA）的mRNA表达及蛋白水平。在U87和U251两种GBM细胞系中通过设计的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）敲低ZDHHC12,并验证YAP1蛋白水平的变化。通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）验证内源性及外源性ZDHHC12及YAP1的相互关系。通过细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）实验、细胞平板克隆形成实验、划痕实验分析GBM细胞敲低ZDHHC12后在增殖及迁移能力上发生的改变。检测在敲低ZDHHC12后GBM细胞系中上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）标志物变化。分析ZDHHC12对GBM患者预后的影响。并检测在不同组织样本中ZDHHC12和YAP1蛋白水平。结果：TCGA数据库及GTEx数据库分析结果显示,ZDHHC12在GBM中的表达量明显高于正常脑组织（P<0.01）,GBM细胞系中ZDHHC12的mRNA表达及蛋白水平高于NHA细胞系。U87和U251两组GBM细胞系中ZDHHC12的敲低会引起YAP1蛋白水平的降低。Co-IP实验验证了ZDHHC12及YAP1蛋白的相互关系。敲低ZDHHC12的表达能够显著抑制GBM细胞的增殖和迁移能力,差异有统计学意义（P<0.05）。ZDHHC12的敲低也可以引起EMT相关标志物的改变。YAP1的回复可以逆转敲低ZDHHC12所引起的GBM肿瘤特性变化。TCGA数据库中,ZDHHC12的表达也与GBM患者的预后密切相关。在组织中ZDHHC12的表达也与YAP1表达呈高度正相关。结论：ZDHHC12在GBM中高表达且与YAP1呈正相关,ZDHHC12/YAP1轴可以调控GBM相关肿瘤特性。     

人胎盘部位滋养细胞肿瘤细胞系的建立及其鉴定

背景与目的：胎盘部位滋养细胞肿瘤(placental site trophoblastic tumor,PSTT)是一种特殊类型的妊娠滋养细胞肿瘤。该研究旨在建立人PSTT细胞系,鉴定其基本特性。方法：通过手术切除的PSTT组织标本原代培养,纯化并传代,建立人PSTT细胞系。鉴定方法包括：观察细胞形态,CCK-8法绘制细胞生长曲线,进行染色体核型分析,细胞与肿瘤组织短串重复序列(short tandem repeat,STR)分析,以及免疫组织化学染色。结果：建立稳定传代的人PSTT细胞系PSTT-1。PSTT-1细胞单层贴壁生长,失去接触抑制性,呈多突起的纺锤形结构。体外培养生长良好,每5 d传代1次,目前已传至30余代。染色体核型分析结果为正常女性核型：46,XX。PSTT-1与肿瘤组织STR分析结果高度匹配。PSTT-1细胞表达β-catenin、CD146、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,hCG)、人胎盘生乳素(human placental lactogen,hPL)和Muc4。结论：该研究成功建立人PSTT细胞系PSTT-1,为PSTT的研究提供了体外实验模型。     

肿瘤原位液中肿瘤来源DNA实时监测脑胶质母细胞瘤术后替莫唑胺诱导超突变的临床应用价值

目的:探讨脑肿瘤原位液（tumor in situ fluid,TISF）来源的肿瘤DNA（tumor-derived DNA）测序实时监测脑胶质母细胞瘤（GBM）术后替莫唑胺（temozolomide,TMZ）诱导超突变的临床应用价值。方法:收集2019年3月至2021年6月于我院神经外科接受诊治的21例GBM患者的肿瘤组织标本及术后TMZ辅助治疗期间的TISF标本和CSF标本,共50个样本（4个CSF、19个组织标本、27个TISF）,从TISF和CSF中提取无细胞DNA（cell-free DNA,cfDNA）进行肿瘤来源DNA靶向测序,表征脑胶质母细胞瘤术后基因组景观,并与肿瘤组织标本测序结果对比,鉴定出在术后TMZ辅助化疗期间基因组发生超突变的GBM患者。结果:21例GBM患者平均年龄（53.2±13.5）岁,18例为IDH野生型,3例为IDH突变型,初始MGMT甲基化均阳性。共检测到67个不同基因的785个突变,每个个体平均突变数为15.7,最常见的改变基因为TP53（35%）、NF1（33%）、TSC2（29%）、PTEN（27%）、PTCH1（23%）,最常见的突变类型是错义突变（65%）,其次是多重突变（13%）和移码突变（12%）。与初始肿瘤组织标本测序结果对比,共有2例患者经TISF 肿瘤来源DNA测序检测出在用药期间发生基因组超突变,并证实为TMZ诱导产生的超突变。结论:通过TISF 肿瘤来源DNA在体动态监测,可实时在体表征脑胶质母细胞瘤术后肿瘤基因景观及监测替莫唑胺诱导的超突变,通过基因组分析,早期发现肿瘤耐药,提示临床调整后续治疗方案。     

人胃癌CD90+干细胞可能影响胃癌的转移和患者的预后

目的： 分离并鉴定人胃癌细胞系SNU-5中的肿瘤干细胞,探讨人胃癌CD90+干细胞对胃癌转移和预后的影响。 方法： 无血清悬浮培养及PKH26染色确定SNU-5细胞系中是否存在肿瘤干细胞,流式细胞术分析SNU-5亲本及球体细胞中肿瘤干细胞标志物的表达,分选CD90+SNU-5细胞并进行体外生物学特征研究及SCID鼠致瘤实验。收集肿瘤医院腹部外科95例胃癌患者肿瘤病理标本,免疫组化方法检测胃癌组织中CD90的表达。 结果： SNU-5细胞无血清悬浮培养11 d后形成的细胞球体中存在单个PKH26阳性细胞。无血清悬浮培养可将CD90+SNU-5细胞富集6.1倍,且CD90可在球体细胞中与标示干细胞的PKH26共染。CD90+SNU-5细胞较CD90- SNU-5细胞和亲本SNU-5细胞具有更高的自我更新能力\[成球率（7.7±1.1）% vs (1.3±0.4)%、(1.8±0.3)%,均P<0.01\]和侵袭能力\[侵袭细胞数(283.3±30.2) vs (48.0±7.5)、(156.7±72)个,均P<0.01\]。CD90+SNU-5细胞在重症联合免疫缺陷（severe combined immune deficency,SCID）小鼠皮下接种2×102个细胞6周即可致瘤（1/6）,而接种2×104个CD90- SNU-5细胞10周才能致瘤（1/6）。95例胃癌患者组织中CD90的表达与胃癌的远处转移显著相关（P<0.01）,且CD90阳性胃癌患者的生存期明显短于CD90阴性的患者（P<0.01）。 结论： 人胃癌细胞系SNU-5中存在具有更强自我更新及侵袭能力的CD90+干细胞,人胃癌组织中CD90+干细胞数量与肿瘤的转移与患者生存期明显相关。     

21例原发性食管小细胞癌的诊断与治疗

目的：探讨原发性食管小细胞癌的临床特点、治疗及预后。方法：回顾分析21例原发性食管小细胞癌患者的临床资料,分析不同治疗方法的治疗效果,并对21例原发性食管小细胞癌患者肿瘤组织进行常规病理学检查及神经元特异性烯醇化酶（NSE）和嗜铬素A（CgA）免疫组织化学染色。结果：1年生存率60.0％,2年生存率25.0％,3年生存率15.0％。中位生存期169个月。21例原发性食管小细胞癌患者组织中NSE和CgA染色呈阳性,其中2例小细胞癌病变中有鳞癌灶性病变。结论：原发性食管小细胞癌应采用以化疗占主要地位的综合治疗,局限期以手术联合化疗,广泛期以放疗联合化疗为宜。NSE和CgA在食管小细胞癌诊断中具有一定作用。     

一种肿瘤类器官制备的改良方法及其初步的应用研究

目的:构建肿瘤类器官(patient derived organoids,PDO)平台,比较传统方法与改良方法之间的模型成功率。方法:建立经典肿瘤PDO模型,改良机械粉碎程度、消化时间、消化温度等条件后建立PDO模型,通过HE染色评价PDO与原始肿瘤标本的差异。结果:成功建立59例肿瘤PDO,涵盖17个肿瘤类型;HE染色结果显示,病人来源的PDO从形态、增殖性表达等方面与亲本高度相似。优化后的方法PDO细胞提取率明显提高、并且生长状况良好。结论:PDO保持了与亲本相似的特性,改良后的方法,其PDO模型成功率要显著高于传统方法。     

非小细胞肺癌患者血浆EGFR突变表达检测及其临床意义

目的：检测非小细胞肺癌患者血浆表皮生长因子受体（ EGFR）基因突变表达情况，探讨其临床意义。方法采用荧光定量PCR法检测90例非小细胞肺癌患者组织及血浆EGFR的基因突变表达情况，分析两者的一致性，并分析血浆EGFR与患者预后的关系。结果非小细胞肺癌患者的血浆与肿瘤组织中EGFR突变表达是一致的，血浆EGFR突变表达与非小细胞肺癌的病理类型、肿瘤大小及淋巴结转移有关，但血浆EGFR突变表达与非小细胞肺癌患者的疾病进展时间、生存时间无关。结论非小细胞肺癌患者血浆EGFR的检测有可能替代肿瘤组织中EGFR的检测，为无法取得肿瘤组织或取得肿瘤组织困难的患者提供一种更快捷、简便的替代检测方法，但血浆EGFR尚不能确立为独立的预后指标。     

乳腺癌患者髓系来源抑制性细胞的鉴定与免疫作用研究

目的:探讨乳腺癌患者体内一群髓系来源抑制性细胞(MDSCs)的表型特点及它对淋巴细胞的抑制作用.方法:收集20例乳腺癌患者外周血及肿瘤组织,10例体检正常健康者外周血,通过流式和免疫组织化学染色技术检测MDSCs的表型特点及比例.采用免疫磁珠技术分选乳腺癌患者肿瘤中的MDSCs,通过瑞氏染色观察细胞形态,分别利用MTT法、流式细胞术和ELISA法检测其对自体淋巴细胞增殖、凋亡和细胞因子分泌的影响.结果:流式细胞仪检测结果显示乳腺癌患者肿瘤组织及外周血中有一群具有髓系前体细胞形态的MDSCs,表面标志为CD45+ CD13+CD33+CD14-CD15-.实验结果显示肿瘤组织来源的MDSCs显著抑制自体淋巴细胞增殖,促进其调亡,并显著抑制其分泌IFN-γ,促进TGF-β、IL-10释放.结论:乳腺癌患者肿瘤组织中存在一群具有独特表型特点的MDSCs,不仅抑制自体淋巴细胞增殖和因子分泌,同时促进细胞凋亡.     

Role of Wnt5a in the proliferation of human glioblastoma cells

Wnt5a operates as either a tumor suppressor or a tumor stimulator, according to tumor type. The functions of Wnt5a in human glioblastoma (GBM) have yet to be determined. We initially evaluated the expression of Wnt5a in human glioma. The results of immunohistochemical analyses have revealed that Wnt5a expression was higher in human GBM than in normal brain tissue and low-grade astrocytoma. In order to assess the role of Wnt5a on proliferation in human glioblastoma cells, we employed U87MG and GBM-05, a newly established GBM cell line. GBM-05 was established from a patient diagnosed with GBM. GBM-05 cells were shown to express Nestin, but did not express GFAP and Map2ab. GBM-05 cells formed infiltrating brain tumors after being intracerebrally transplanted into nude mice, and xenotransplanted GBM-05 cells were observed to differentiate into neuronal and astrocyte lineages. Wnt5a expression in the xenotransplanted tumors was higher than that detected in the surrounding brain tissues. The overexpression of Wnt5a increased the proliferation of GBM-05 and U87MG in vitro. By way of contrast, the downregulation of Wnt5a expression as the result of RNA interference reduced proliferation from GBM-05 and U87MG cells in vitro, and reduced tumorigenicity in vivo. Our data indicate that Wnt5a signaling is an important regulator in the proliferation of human glioma cells.     

成人脂肪间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的从成人皮下脂肪组织提取具有连续传代和分化潜能的间充质干细胞,为进一步实验研究提供应用基础。方法采用机械分离—胶原酶消化法分离剖宫产患者皮下脂肪组织,所得细胞培养,传代,用差速贴壁法提纯所得细胞。取第4代细胞进行诱导分化,使其分化成脂肪细胞。取第6代细胞进行流式细胞术检测表面抗原CD13,免疫细胞化学法检测表面抗原CD90。结果成人皮下脂肪中含有长梭形细胞,此种细胞在体外能稳定传代且能被诱导分化成脂肪细胞,与空白对照相比,表面抗原CD13和CD90均呈阳性。结论此种方法能从成人皮下脂肪中分离出具有间充质干细胞性质的细胞,为进一步实验研究提供了有效方法和基础材料。     

人原发胶质母细胞瘤组织中NF-κB、TP53及MGMT甲基化与MGMT蛋白表达的相关性研究

背景与目的：胶质瘤化疗敏感性与一些分子表达相关。本研究检测和分析原发性胶质母细胞瘤（glioblastoma multifolille,GBM）患者肿瘤组织中核因子κB（NF-κB）、突变型P53（TP53）及O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶｜（O^6-methylguanine—DNA methyltransferase,MGMT）基因启动子区甲基化与MGMT蛋白表达的相关性．以探讨调控MGMT蛋白表达的作用机制。方法：采用甲基化特异性PCR方法（methylation specific PCR,MSP）检测我院收治的120例原发性GBM患者肿瘤组织标本MGMT基因启动子区甲基化：采用免疫组化方法检测NF—κB、TP53、MGMT蛋白表达情况。采用SPSS17．0软件及Spearman相关系数分析方法进行统计学分析。结果：免疫组化表明NF—κB、TP53表达与MGMT表达呈正相关（r=0．244,r=0．271,P均〈0．05）,NF—κB与TP53表达亦呈正相关r=-0．329,P〈0．05）。MSP结果显示MGMT基因启动子区甲基化率与MGMT蛋白表达强度无相关性。结论：转录因子NF—κB与TP53对原发性GBM肿瘤组织中MGMT蛋白表达可能存在正调控作用,而MGMT基因启动子区甲基化率与MGMT蛋白表达强度无相关性。     

Evaluation of Perienhancing Area in Differentiation between Glioblastoma and Solitary Brain Metastasis

Purpose: Accurate differential diagnosis between glioblastoma and brain metastasis is important. We aimed to differentiate these tumors by evaluation of the perienhancing area. Materials and Methods: Thirty patients with glioblastoma and solitary brain metastasis were included. The diameters of perienhancing and enhancing areas were measured, and the percentage of enhancing area was calculated. We measured Apparent diffusion coefficient (ADC) of perienhancing and enhancing areas. Intratumoral necrotic areas were measured. Results: The enhancing area of glioblastoma was 56.61% and metastasis was 42.55% (p = 0.08). The ADC values of the perienhancing part of GBM was 0.7 and metastasis was 0.79 (p = 0.052). The ADC value of the enhancing part of the GBM was 0.82 and metastasis was 0.8 (p-value = 0.72).  The intratumoral necrotic area of glioblastoma (152.25 mm3) was higher than in metastasis (0 mm3) (p-value = 0.003) with a cutoff area of 11.8 mm2. Conclusion: The ADC values of the perienhancing area were lower in glioblastoma with a near-significant p-value. Other perienhancing parameters demonstrated no significant difference between both tumors. The intratumoral necrotic area of glioblastoma is larger than metastasis.     

Comprehensive analysis of microRNA expression profile in malignant glioma tissues

Malignant gliomas represent the most devastating group of brain tumors in adults, among which glioblastoma multiforme (GBM) exhibits the highest malignancy rate. Despite combined modality treatment, GBM recurs and is invariably fatal. A further insight into the molecular background of gliomagenesis is required to improve patient outcomes. The primary aim of this study was to gain broad information on the miRNA expression pattern in malignant gliomas, mainly GBM. We investigated the global miRNA profile of malignant glioma tissues with miRNA microarrays, deep sequencing and meta‐analysis. We selected miRNAs that were most frequently deregulated in glioblastoma tissues, as well as in peritumoral areas, in comparison with normal human brain. We identified candidate miRNAs associated with the progression from glioma grade III to glioma grade IV. The meta‐analysis of miRNA profiling studies in GBM tissues summarizes the past and recent advances in the investigation of the miRNA signature in GBM versus noncancerous human brain and provides a comprehensive overview. We propose a list of 35 miRNAs whose expression is most frequently deregulated in GBM patients and of 30 miRNA candidates recognized as novel GBM biomarkers.     

长链非编码RNA在胶质母细胞瘤中异常表达研究

背景与目的：近来研究表明,长链非编码RNA在胶质瘤的发生与发展中发挥重要作用。本研究旨在通过基因芯片分析lncRNAs在胶质母细胞瘤（GBM）和正常脑组织中的表达概况,比较lncRNA差异表达与组织之间的表达谱差异。方法：应用基因芯片技术检测lncRNAs在GBM和正常脑组织的表达谱差异．并筛选出差异表达lncRNA进行分析。结果：lncRNA芯片的数据：原发性胶质母细胞瘤与正常脑组织中LncRNA表达上调3倍基因2032个,LncRNA表达下调3倍基因2036个（P〈0．01）。其中21个lncRNAs上调30倍以上．7个lncRNAs下调超过30倍（P〈0．01）。结论：利用lncRNA基因芯片较大规模地对胶质瘤中的lncRNAs差异表达进行探讨．对lncRNA在其中的功能及潜在的基因治疗功能具有十分重要的意义：差异表达的lncRNAs包括一些抑癌及促癌lncRNA,其在胶质母细胞瘤的发展中扮演重要的角色．通过它们的目标基因在GBM的复发和恶性进展中发挥作用．