新型金纳米笼分子探针在光热治疗和放射增敏中的价值研究

目的：探讨靶向金纳米笼（ GNCs）分子探针在小鼠乳腺癌4T1细胞靶向光热治疗和放射增敏价值。方法利用GNCs构建CD44－PEG－GNCs分子探针;通过电感耦合等离子体质谱（ ICP－MS）与电镜（ TEM）来检测4T1细胞对Au的摄取情况;用CCK－8检测该探针对4T1细胞活性影响;近红外激光照射4T1细胞后用CCK－8、Hoechst／PI双染检测GNCs的光热杀伤效果;用6 MV的X线照射4T1细胞并用克隆形成实验和Hoechst／PI双染来检测4T1细胞活性。结果 ICP－MS和TEM显示4T1细胞摄取大量GNCs,其中对CD44－PEG－GNCs摄取量约是PEG－GNCs的3～4倍;细胞毒性实验显示在一定浓度范围内GNCs对4T1细胞活力影响较小,48 h后细胞活力为81．2％;近红外激光照射及X线放射后CCK－8、Hoechst／PI 双染和克隆形成实验结果表明光热治疗联合放射的含 CD44－PEG－GNCs的肿瘤细胞大量凋亡,效果明显优于其他组。结论 GNCs分子探针细胞毒性小,对4T1细胞有较好的主动靶向作用,提示有对肿瘤光热治疗和放射增敏作用。     

免疫金纳米笼子介导热疗诱导人乳腺癌细胞凋亡研究

目的：研究抗体修饰的金纳米笼子对乳腺癌细胞的光热杀伤作用。方法：由银（Ag）立方纳米晶与次氯金酸（HAuCl4）置换反应得到金纳米笼子,经Anti-CK19抗体修饰后制成具有生物靶向性的免疫金纳米笼子。将其链接细胞后,由激光照射,在荧光显微镜下观察免疫金纳米笼子光热杀伤乳腺癌细胞的效果,通过流式细胞仪检测其对乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231和MCF-7/TMA热疗效果的差异,用免疫组化方法检测热疗后细胞内Caspase-9蛋白的表达量,MMT比色法观察其细胞毒性。结果：免疫金纳米笼子可以通过光热作用来杀伤乳腺癌细胞;MCF-7细胞株对照组凋亡率为（0.056±0.007 8）%,实验组为（50.2±4.56）%,MCF-7/TAM细胞株对照组凋亡率为（0.006 3±0.005 4）%,实验组为（52.6±5.07）%,MDA-MB-231细胞株对照组凋亡率为（0.054±0.006 4）%,实验组为（49.0±4.81）%,差异无统计学意义,F=0.84,P=0.456;Caspase-9蛋白在37℃时表达水平为0.06±0.02,41℃表达水平为0.15±0.04,43℃表达水平为0.34±0.04,对照组光照后温度为34℃,表达水平为0.05±0.01,〈43℃时,随着温度的升高Caspase-9的表达量明显升高,F=14.914,P〈0.001;MMT法结果显示,高剂量免疫金纳米笼子可抑制乳腺癌细胞的增殖（F=5.774,P〈0.001）,且存在时间-效应（F=42.378,P〈0.001）和剂量-效应（F=76.440,P〈0.001）关系。结论：免疫金纳米笼子介导的光热疗法可以靶向杀伤乳腺癌细胞,上调Caspase-9的表达,是免疫金纳米笼子介导的热疗诱导乳腺癌细胞凋亡的机制之一。     

荧光磁性纳米粒子与PSA单链抗体复合探针对前列腺癌的靶向显像和治疗

摘 要 目的: 研究荧光磁性纳米粒子与前列腺癌特异性抗原(prostate cancer specific antigen,PSA)单链抗体片段结合的复合纳米探针作为前列腺癌核磁共振靶向显像剂与治疗剂的可行性。方法：荧光磁性纳米粒子（FMCNPs）与前列腺癌特异性单链抗体片段(ScFv)桥联制备成复合纳米探针（FMCNPsScFv），应用高分辨电镜、荧光光谱仪与磁强度计进行鉴定。将FMCNPsScFv与前列腺癌LNCaP细胞共培养，观察其进入癌细胞的靶向性；采用MTT法评价复合纳米探针的细胞毒性。建立裸鼠前列腺癌细胞移植模型，进行免疫组化和病理学鉴定；荷前列腺癌裸鼠尾静脉注射复合纳米探针，采用荧光成像系统观察纳米探针在裸鼠体内的分布消除过程；利用核磁共振观察复合纳米探针肿瘤靶向显像效果；给予体外磁场照射(100 W功率)30 min,观察肿瘤体积的变化。结果：成功制备复合纳米探针FMCNPsScFv；细胞培养实验显示复合纳米探针能够进入前列腺癌细胞质；在显像浓度范围内复合纳米探针细胞毒性很低，不影响细胞增殖。成功制备裸鼠前列腺癌模型。荧光成像系统显示复合纳米探针快速地在裸鼠各重要器官分布，并逐渐集中于肿瘤部位；核磁共振显示纳米探针在24 h内能够清晰显示前列腺癌图像；体外磁场照射4 d后，注射复合纳米探针的裸鼠肿瘤组织生长显著慢于对照裸鼠的肿瘤组织（P<0.05）。结论：制备的复合纳米探针FMCNPsScFv能有效地靶向前列腺癌组织，可用于前列腺癌的核磁共振成像，也能用于体外磁场作用下的肿瘤治疗。     

人黑素瘤单链抗体-量子点纳米探针的制备及其与黑素瘤细胞特异性结合

目的：制备抗人黑素瘤细胞单链抗体与碲化镉量子点(CdTe guantun dot, CdTe)连接的纳米探针,观察其对恶性黑素瘤细胞的特异性结合效果。方法：将抗人黑素瘤神经节苷脂单链抗体（antihuman melanoma ganglioside single chain variable fragment antibody,GD/ScFvMEL）基因克隆到pET32a（+）载体中,然后在BL21（DE3）细菌中进行诱导表达,采用变性法纯化表达的蛋白,再用改良的透析法复性目的蛋白,SDSPAGE分析表达的GD/ScFvMEL抗体蛋白。制备的GD/ScFvMEL抗体与量子点连接制备成纳米探针GD/ScFvMELQDs,然后与黑素瘤A375细胞株及胃癌MGC803细胞株孵育,观察纳米探针与肿瘤细胞结合的特异性。结果：PCR、双酶切和序列测定证实重组子的拼接完全正确,SDSPADE结果显示,GD/ScFvMEL抗体的表达量达40%。纯化复性后的GD/ScFvMEL抗体连接量子点制备GD/ScFvMELQDs纳米探针,经扫描电镜、X衍射分析、荧光光谱和SDSPAGE分析证实纳米探针的成功制备。GD/ScFvMELQDs纳米探针能特异性结合A375黑素瘤细胞,不与胃癌细胞MGC803细胞结合。结论：成功制备抗人黑素瘤神经节苷脂单链抗体量子点纳米探针,该探针可特异性结合黑素瘤细胞。     

在量子点探针介导下共聚焦显微镜检测肾癌组织HSP70的表达意义

本研究探讨新型纳米荧光材料量子点在免疫荧光分析法中的应用价值。我们分别利用量子点QD605或异硫氰酸荧光素(FITC)作为免疫荧光分析中的标记探针,通过激光扫描共聚焦显微镜观察肾细胞癌组织中HSP70的表达,并比较所得图像之间的成像差异性和成像稳定性。在所有的肾细胞癌组织样本中,量子点QD605标记的图像信号都要比常用的荧光染料FITC标记信号发光强度更高,更有特异性,在激光连续照射1 h下QD605标记的图像未有明显的荧光漂白现象,表现出极佳的发光稳定性。因此以新型荧光材料量子点为标记探针,用免疫荧光分析法检测病理组织切片中的蛋白标记物更有特异性,有潜力代替传统的有机荧光染料应用于生物大分子的荧光标记和光学成像。     

量子点-CKl9抗体荧光探针对乳腺癌细胞免疫荧光标记及毒性研究

目的：制备量子点-细胞角蛋白19抗体（cytokeratin,CKl9）荧光探针,利用其光学性质和特异性识别能力对乳腺癌细胞株MDA—MB231进行荧光标记,并探讨其细胞毒性。方法：用水热法合成CdTeS量子点,并将其与CKl9抗体连接。通过直接免疫荧光法,利用合成的量子点-CKl9抗体探针对乳腺癌细胞株MDA—M昏231进行荧光标记,并观察探针在细胞内的分布。分别采用流式细胞术和MTT法,检测探针作用后细胞凋亡情况和增殖变化。结果：量子点-CKl9抗体探针能与抗原特异性结合,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜示,该探针能有效对乳腺癌细胞株MDA-MB-231进行特异性荧光标记,荧光主要位于细胞质和细胞膜,荧光清晰明亮,持续时间长。与对照组相比,量子点-CKl9抗体探针浓度≤2nmol／L时,对照组乳腺癌细胞株MDA_M辟231的凋亡率为（3．763±0．130）％,0．25nmol／L组为（3．760±0．161）％,0．5nmol／L组为（3．827士O．107）％,1nmol／L组为（3．947±0．081）％,2nmol／L组为（4．013±0．055）％。单因素方差分析结果显示,各剂量组与对照组比较,差异无统计学意义,F-3．023,P-0．071。量子点-CKl9抗体探针可抑制乳腺癌细胞MDA—M昏231增殖,F-133．407,P〈0．001;且存在时间-O：应（F-299．142,P〈0．001）和剂量-效应（F-9．105,P〈0．001）关系,随着探针浓度的增加和作用时间的延长,A值逐渐减小,但除了浓度2nmol／L作用48h外,其余各组的抑制率均〈7％。结论：成功制备了量子点-CKl9抗体荧光探针,该探针能有效对乳腺癌细胞株MDA-M昏231进行荧光标记,且具有良好的光学性质和较低的细胞毒性。     

PDA介导的温和光热联合自噬抑制剂杀伤乳腺癌细胞

目的 探究温和光热条件下,抑制自噬是否增强光热治疗的敏感度。方法 采用改良的双乳化法和基于聚多巴胺（polydopamine, PDA）的表面修饰法制备CQ@PLGA@PDA NPs;对其进行基本表征后,CCK-8法检测纳米粒子的细胞毒性;近红外激光照射纳米粒子溶液检测升温效果;CCK-8法和活-死细胞染色检测其光热杀伤肿瘤细胞效果;蛋白质免疫印迹实验检测自噬相关蛋白的表达。 结果 成功制备了CQ@PLGA@PDA NPs,其粒径为253.10±2.39 nm,Zeta电位为-22.57±0.80 mV,粒径均一,分散性好;近红外激光（NIR）辐照纳米粒子溶液10 min后,温度升高至45℃;CQ@PLGA@PDA NPs对细胞无明显毒性,乳腺癌细胞MDA-MB-231和小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3细胞的存活率均在为95%以上;细胞治疗和蛋白质免疫印迹结果表明,温和光热条件下,抑制自噬可以提高光热治疗的敏感度。结论 CQ@PLGA@PDANPs光热性能好,生物安全性高;通过抑制细胞自噬,可以在温和的光热条件下（<50℃）有效杀伤乳腺肿瘤细胞。     

量子点荧光成像在肿瘤诊治应用研究进展

量子点(quantum dot,QD),又名“人造原子”,是一种用原子人工合成的纳米材料,其在紫外光激发下可发出不同波长的荧光.QD直径小、发出的荧光峰窄、荧光亮度持久,具有取代有机染料用于肿瘤诊治的潜能.总结近年QD在荧光成像及肿瘤诊治方面的研究进展.方法 应用PubMed及中国知网(CNKI)数据库检索系统,以“quantum dots,fluorescence imaging,oncotherapy,tumor therapy,量子点,肿瘤治疗,肿诊断,荧光成像”为关键词,检索2005-01-2016-03的相关文献391篇.纳入标准:(1)可用于生物荧光成像的低毒化QD;(2)靶向识别的功能化QD.根据纳入标准最终分析31篇文献.结果 低毒化QD在细胞成像、活体靶向成像、淋巴结成像、活体肿瘤成像、活体肿瘤细胞示踪等荧光成像方面的研究,使正确定位淋巴结、利用QD深成像能力发现极小的肿瘤、乃至彻底切除肿瘤组织成为可能.功能化QD在肿瘤早期诊断和治疗上发挥更大作用,QD的药物靶向和QD介导的光热治疗肿瘤也有很好的临床应用前景.结论 QD在生物荧光成像及肿瘤诊疗中的潜力巨大,具有进一步探索开发利用于临床的价值.     

半导体量子点荧光探针在恶性肿瘤中的应用

半导体量子点(或称半导体纳米微晶体)与传统的有机荧光标记物相比,具有独特的光谱特性和良好的光化学稳定性.近年来随着水溶性量子点制备技术、纳米技术和生物技术的飞速发展,基于半导体量子点发展起来的生物亲和性功能化的纳米荧光探针,提供了对体内活细胞或活细胞内多种生物分子"编码"标记后同时进行多通道原位实时动态研究的技术平台.现综述半导体量子点荧光探针的光谱特性及其在活细胞生理条件下用于恶性肿瘤的研究进展和发展前景.     

半导体量子点荧光探针在恶性肿瘤中的应用

半导体量子点（或称半导体纳米微晶体）与传统的有机荧光标记物相比,具有独特的光谱特性和良好的光化学稳定性.近年来随着水溶性量子点制备技术、纳米技术和生物技术的飞速发展,基于半导体量子点发展起来的生物亲和性功能化的纳米荧光探针,提供了对体内活细胞或活细胞内多种生物分子“编码”标记后同时进行多通道原位实时动态研究的技术平台.现综述半导体量子点荧光探针的光谱特性及其在活细胞生理条件下用于恶性肿瘤的研究进展和发展前景.     

Selective laser photo-thermal therapy of epithelial carcinoma using anti-EGFR antibody conjugated gold nanoparticles

Efficient conversion of strongly absorbed light by plasmonic gold nanoparticles to heat energy and their easy bioconjugation suggest their use as selective photothermal agents in molecular cancer cell targeting. Two oral squamous carcinoma cell lines (HSC 313 and HOC 3 Clone 8) and one benign epithelial cell line (HaCaT) were incubated with anti-epithelial growth factor receptor (EGFR) antibody conjugated gold nanoparticles and then exposed to continuous visible argon ion laser at 514nm. It is found that the malignant cells require less than half the laser energy to be killed than the benign cells after incubation with anti-EGFR antibody conjugated Au nanoparticles. No photothermal destruction is observed for all types of cells in the absence of nanoparticles at four times energy required to kill the malignant cells with anti-EGFR/Au conjugates bonded. Au nanoparticles thus offer a novel class of selective photothermal agents using a CW laser at low powers. The potential of using this selective technique in molecularly targeted photothermal therapy in vivo is discussed.     

多巴胺包裹的载药纳米金粒子在骨肉瘤光热治疗和化疗协同治疗中应用的实验研究

目的:探究负载化疗药物阿霉素（doxorubicin,DOX）的聚多巴胺包裹纳米金粒子用于化疗与光热协同治疗在骨肉瘤中的应用效果。方法:分别合成纳米金粒子（Au）、聚多巴胺包裹的纳米金粒子（Au@PDA）及载药后的纳米粒子（Au@PDA@DOX）。利用高倍透射电镜表征其形貌;利用动态光散射仪检测其粒径;利用近红外热成像仪表征其光热转换效能;考察药物的载药率及体外释放情况。体外的抗肿瘤实验中,将骨肉瘤MG-63细胞分为5组:PBS对照组、游离DOX组、Au@PDA+激光组、Au@PDA@DOX组和Au@PDA@DOX+激光组。采用CCK-8法及活死细胞染色检测各实验组对骨肉瘤MG-63细胞的杀伤效果,使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）去检测骨肉瘤对Au@PDA@DOX和Au@PDA的摄取情况,使用荧光倒置显微镜观察各组细胞凋亡情况。结果:成功制备出粒径为（13.3±0.8）nm的纳米金粒子,使用聚多巴胺包裹的纳米金粒子粒径为（185.6±6.0）nm,负载DOX后粒径增大到了（288.0±6.2）nm,载药量为（12.8±0.8）%,在酸性条件下,DOX的释放速度加快;细胞吞噬实验表明MG-63细胞对Au@PDA@DOX纳米粒子的吞噬量高于Au@PDA纳米粒子;单一治疗及光热治疗与化疗协同杀伤MG-63细胞的能力评估结果表明,联合作用的效果大于单一治疗。结论:负载DOX的Au@PDA纳米系统表现出良好的光热效应,能够抑制MG-63细胞的生长。该纳米系统实现了化疗与光热协同作用,可用于骨肉瘤的治疗。     

Breast cancer expresses functional NMDA receptors

We demonstrate here that functional NMDAR1 and NMDAR2 receptors are expressed by Mcf-7 and SKBR3 breast cancer cell lines, and possibly by most or all high-grade breast tumors, and that these receptors are important for the growth of human breast cancer xenografts in mice. RT-PCR demonstrated mRNA for both NMDAR1 and NMDAR2 receptors are expressed in both Mcf-7 and SKBR3 cell lines, and these messages likely have sequences identical to those reported for human mRNAs. Proteins of the expected respective sizes 120 and 170 kD are generated from these mRNAs by the tumor cells. Cell growth was found to be significantly (P < 0.0001) impaired down to 10% of normal growth by the irreversible NMDAR1 antagonists MK-801 and memantine with IC 50s ranging from 600 to >800 μM and from 200 to 300 μM for the two lines. Paradoxically, memantine with a lower binding affinity had the greater influence of the two inhibitors on cell viability. Immunohistochemical examination of high-grade invasive ductal and lobular breast cancer with our polyclonal antibodies against a peptide (-Met-Ser-Ile-Tyr-Ser-Asp-Lys-Ser-Ile-His-) in the extracellular domain of the NMDAR1 receptor gave specific positive staining for the receptor in all 10 cases examined. Positive staining was chiefly concentrated at the membranes of these tumor tissues. No staining with these antibodies was found for normal breast and kidney tissues. When Mcf-7 cells were grown as tumor xenografts in nu/nu mice, the growth of these tumors was completely arrested by daily treatments with MK-801 over 5 days. All of these data point to active NMDAR receptors being expressed by most breast cancers, and having an important influence on their survival.     

基于金纳米结构材料的肿瘤诊疗一体化研究进展

由于表面等离子体共振效应,金纳米材料显示出独特的尺寸和形状依赖的光学和光热性质,在肿瘤诊断成像、光热治疗、药物输运方面具有广阔的应用前景。利用金纳米材料本身的光学性质,可进行暗场成像和光学相干断层扫描及双光子成像等。金纳米材料还可以作为载体,载带各种荧光分子和药物,实现成像、化疗、光动力治疗等多种功能。通过近红外激光激发,金纳米材料的光子-电子和电子-电子之间相互作用产生热量,可以用于肿瘤的光热治疗、促进药物的释放以及光声造影。基于金纳米材料的热疗和化疗联用也被证明有助于提高肿瘤的治疗效果。可见,金纳米材料能将多种功能整合到一个体系中,实现肿瘤诊疗的一体化,为发展按需给药和个性化药物提供了新思路。本文介绍了几种典型的金纳米颗粒,包括金纳米壳、金纳米棒、中空金纳米球、金纳米笼和金纳米星,用于肿瘤诊疗一体化方面的研究进展,并讨论了存在的主要问题。      

Adenovirus-mediated tBid overexpression results in therapeutic effects on p53-resistant hepatocellular carcinoma

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignancies worldwide with a very high mortality. Because the success of the conventional therapies is limited, gene therapy may represent an alternative for HCC management. Our earlier study has shown that Bid plays a role in the development of HCC. The aim of our study is to evaluate the possibility of using truncated Bid (tBid) as a novel therapy for HCC treatment. Two HCC cell lines, Hep3B and PLC/PRF/5, were used in the experiment. Hep3B was a p53-resistant while PLC/PRF/5 a p53-sensitive. A recombinant adenovirus-Ad/AFPtBid, which contained a tBid gene driven by an alpha-fetoprotein (AFP) promoter, was constructed. Both Hep3B and PLC/PRF/5 cells infected with Ad/AFPtBid showed a significant decrease in cell viability. The decrease in cell viability by Ad/AFPtBid resulted from apoptosis of HCC cells, evident by enhanced activity of caspases and increased release of cytochrome c. In vivo experiment was performed by the intratumor injection of Ad/AFPtBid in nude mice inoculated with Hep3B. Ad/AFPtBid injection significantly inhibited tumor growth, and tumor tissues showed a marked increase in TUNEL-positive cells. Our experiment also demonstrated that Ad/AFPtBid only targeted AFP-producing cells but not those non-AFP producing cells. In conclusion, these results indicate that the introduction of Ad/AFPtBid can not only significantly but specifically kill HCC cells that produce AFP. The cell death induced by Ad/AFPtBid in HCC cells is via an apoptotic pathway that can be independent of p53 status.     

siRNA沉默HepG-2细胞B7-H3对细胞行为学影响的研究

目的:探讨siRNA方法沉默HepG-2细胞中B7-H3基因表达对细胞周期、增殖及迁移能力的影响.方法:设计合成针对B7-H3基因的siRNA及无关干涉siRNA序列,并分别构建干涉载体pSilencer4.1-CMV neo/B7-H3及无关干涉载体pSilencer4.1-CMV neo/NC;采用脂质体LipofectamineTM 2000转染对数生长期肝癌细胞HepG-2,经G418筛选后获得相应细胞模型;利用RT-PCR和Western blot方法分别检测空白对照组(WT)、无关干涉组(si-NC)和B7-H3干涉组(si-B7-H3)细胞中B7-H3 mRNA及蛋白表达水平;利用CCK-8细胞增殖实验及克隆形成实验评价各组细胞增殖情况;利用碘化丙锭(PI)染色流式细胞术检测各组细胞周期分布情况;利用细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力.结果:成功构建了pSilencer4.1-CMV neo/B7-H3干涉载体.RT-PCR及Western blot结果显示,B7-H3干涉组较空白对照组、无关干涉组mRNA及蛋白水平明显下降;CCK-8增殖、克隆形成实验、细胞划痕实验及流式结果表明B7-H3干涉组增殖受到明显抑制,克隆较小且克隆数减少,细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞迁移能力受抑制.结论:利用siRNA靶向干涉B7-H3表达可抑制HepG-2细胞增殖并诱导细胞周期阻滞,降低细胞迁移能力,实验结果为开发针对B7-H3靶点的肝癌免疫治疗提供了初步实验及理论基础.     

AFP启动子与胸苷激酶基因治疗肝癌的实验研究

目的：探讨AFP启动子与胸苷激酶疗法对肝癌的作用。方法：采用含tk基因与潮霉素磷酸转移酶hy基因融合基因的真核表达载体及仅含潮霉素磷酸转移酶hy的空载体,以脂质体为介导,将这两种质粒分别转染肝癌细胞系HEPG2。潮霉素B药物敏感实验筛选HEPG2,不同浓度丙氧鸟苷分别作用于HEPG2,HEPG2-AFP—hytk及HEPG2-hy。结果：潮霉素B药物敏感实验筛选HEPG2,12天时HEPG2全部死亡的最低浓度为60μg／ml,30μmol／L丙氧鸟苷可最大限度杀死HEPG2-AFP—hytk。杀伤效应随时间而增强,作用24小时后开始出现毒性作用,至96小时死亡率〉80％。仅含有18％的HEPG2-AFP—hytk就可使周围20％的HEPG2细胞死亡,总死亡率为38％。结论：60μg／ml潮霉素是筛选HEPG2－AFP—hytk及HEPG2－hy阳性克隆的最佳剂量。30μmol／L丙氧鸟苷是作用于HEPG2－AFP—hytk的最佳剂量。HSV—tk／GCV系统大于18％HEPG2-AFP—hytk开始具有旁观者效应,可提高疗效。