胰岛分离、纯化制备的改进

目的 探讨大型哺乳动物胰岛机械化大量分离、纯化的方法,为人类胰岛移植物的大量制备摸索创造条件.方法 应用改进的机械化胰岛分离、纯化系统,用HCA和UW液顺序原位灌洗犬胰腺,主副胰管插管,4℃胶原酶-V(1.5 g/L)+胰酶抑制剂pefabloc(0.4 mmol/L)灌注后,Ricordi-Chamber消化罐消化,4℃COBE2991连续密度梯度离心纯化,测定胰岛当量(IEQ)、胰岛纯度及存活率、胰岛素及C-肽的释放量、培养24 h后光镜及电镜观察.结果 胰腺消化时间为(25.0±6.0)min,胰岛外分泌腺包裹率为(9.4±2.4)%,消化后胰岛收获量为(17.2±3.6)×104IEQ/每个胰腺,纯化后胰岛收获量为(8.3±2.0)×104IEQ/每个胰腺,胰岛纯度为(89.7±3.5)%.纯化胰岛体外低糖与高糖刺激下胰岛索分泌量及C-肽的释放量良好,培养24 h后形态结构及功能正常.结论 本实验室改进的胰岛机械分离方法及各设备运行可靠,获得的胰岛形态功能良好,可望用于临床人类胰岛的大量制备.     

不同器官保存液对成人胰岛分离、纯化及功能的影响

目的探讨不同器官保存液保存胰腺对胰岛分离、纯化及功能的影响。方法以成人胰腺为研究对象,分别以高渗枸橼酸钾溶液(HCA液)与威斯康新大学器官保存液(UW液)灌洗、保存胰腺,进行胰岛分离及纯化,比较两组分离、纯化后收获的胰岛数及胰岛当量数(IEQ),并在体外评价其功能。结果两组在胰腺重量、热缺血时间、冷缺血时间没有明显差异的情况下,胰腺分离、纯化后所获得的胰岛数及胰岛当量数的差异无显著性(P>0.05),纯化后的胰岛细胞在体外低糖与高糖刺激下,其胰岛素的分泌量及C肽的释放量的差异也无显著性(P>0.05);两个组胰岛细胞的活率均在85%以上。结论在胰岛移植中,可以使用HCA液作为胰腺保存液。     

猪胰岛的分离与纯化

目的 探索大规模猪胰岛细胞分离纯化的方法.方法 联合器官切取,胶原酶P主胰管灌注,COBE2991细胞分离机及HCA-Ficoil纯化猪胰岛细胞.通过双硫腙(DTZ)染色,倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,胰岛素释放试验检测胰岛细胞的分泌功能.结果 消化后平均每条胰腺可平均获得(275 000±20 895)胰岛细胞当量(IEQ),纯化后平均为(230 350±26 679)IEQ,平均每克胰腺组织可获得(2710±229)IEQ,纯化后胰岛细胞平均纯度为(50.2±1.95)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖(16.7 mmol/L)时胰岛素的释放量为低糖(3.3 mmol/L)时的4.74倍(P≤0.001).结论 成功建立了猪胰岛细胞分离、纯化的方法,纯化的猪胰岛细胞具有良好的生物活性.     

新型胰岛分离液对小鼠胰岛分离效果的研究

目的探讨新型胰岛分离液(IPS液)在小鼠胰岛分离中的分离效率及胰岛保护作用。方法将消化后的小鼠胰腺按体积平均分为两组(IPS组和UW组),分别应用IPS-Optiprep液及UW-Optiprep液进行连续梯度密度离心分离胰岛,比较两组分离液的分离纯化效率和分离后的胰岛活性。将诱导成功的糖尿病小鼠随机分为3组:实验组(n=10),接受采用IPS-Optiprep液分离纯化的胰岛移植;对照组(n=10),接受采用UW-Optiprep液分离纯化的胰岛移植;假性移植组(n=5),仅给予手术但并不进行胰岛移植。分析3组小鼠术后血糖水平以及测实验组和对照组小鼠术后21 d的腹腔葡萄糖耐量试验的血糖水平。比较两种分离液的配制成本。结果与UW组相比,IPS组的IPS-Optiprep液可提供更高的胰岛当量(IEQ)、胰岛纯度、回收率及胰岛完整度。胰岛形态观察可见,IPS组胰岛被膜完整,直径明显大于UW组。UW组纯化后的胰岛活性率高于IPS组[(88±5)%比(84±3)%,P0.01]。与UW-Optiprep液相比,IPS-Optiprep液可获得相当的在体胰岛功能。IPS-Optiprep液可显著降低胰岛分离纯化成本。结论新型胰岛分离液IPS-Optiprep液在胰岛分离提纯中显示出较好的分离效率,增加了胰岛的纯度、完整度与回收率,并显著降低了纯化成本,但对胰岛细胞活性的保护作用稍逊,可能与胰岛的高完整度及IPS-Optiprep液中的内毒素有关。     

成人胰岛大容量分离技术的改进及胰岛功能检测

目的 通过对人胰岛分离技术的改进以获得大量高活力胰岛并检测其功能,为利用同种异体胰岛移植治疗1型和部分2型糖尿病提供理论依据和技术基础。方法 采用改良的自动分离技术连续分离28例人胰岛,然后用连续性密度样度离心法纯化胰岛。胰岛收获量以国际标准的胰岛当量(islet equivalent,IEQ)表示。胰岛功能的测定分别为体外测定胰岛的胰岛素／DNA比率;静止葡萄糖刺激试验(SGS)及将胰岛移植至糖尿病裸小鼠的体内胰岛功能鉴定并随后进行腹腔糖耐量试验,连续测定移植鼠血糖水平及其体内C肽浓度。结果 28例成人胰腺分离的胰岛收获量为5000～1030000IEQ／胰腺,平均为291635IEQ／胰腺,前13例平均每个胰腺收获49123IEQ,平均每克组织收获846IEQ。平均纯度为87％,随着技术的改进后15例的分离结果则分别为：平均每个胰腺501813IEQ,平均每克组织7003IEQ,平均纯度89％。体外胰岛素刺激试验结果表明分离纯化后的人胰岛有正常功能,将12次分离得到的胰岛分别移植至34只糖尿病裸鼠肾包膜下,其中29只糖尿病裸鼠于12h内血糖恢复正常且糖耐量试验接近正常鼠,血中C肽水平亦接近正常鼠。结论 采用改进的人胰岛分离方法,可以获得大量高活力的具有正常功能的胰岛,为同种异体胰岛移植用于临床奠定了必要的实验基础。     

乌司他丁对犬胰岛的保护作用

目的判定在机械分离纯化犬胰岛过程中,胰腺原位灌洗时应用乌司他丁(UTI)的保护作用,观察胰岛的获取产量。方法将20只犬随机分为两组,每组10只。HC-A组:胰腺经腹主动脉原位灌洗时用冷HC-A液2500ml;HC-A UTI组:胰腺原位灌洗时,HC-A液中加用UTI10000U/kg。两组均经主胰管用4℃胶原酶V控压灌注,在RicordiChamber系统中消化,用Ficoll连续梯度离心纯化。记录消化时间、胰岛外分泌腺包裹率、胰岛纯度、纯化后胰岛在体外用低糖与高糖刺激下胰岛素分泌量、C-肽的释放量及收获的胰岛当量(IEQ),并对纯化后的胰岛进行光镜及电镜观察。结果HC-A UTI组与HC-A组在胰腺消化时间、胰岛外分泌腺包裹率、胰岛纯度、纯化后的胰岛在体外经低糖与高糖刺激下胰岛素分泌量、C-肽的释放量以及胰岛的形态和结构上比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。HC-A组收获胰岛[(3.42±1.47)×104]IEQ,HC-A UTI组收获胰岛[(6.17±2.86)×104]IEQ,两组差异有统计学意义(P<0.05)。结论在犬胰岛分离和纯化过程中,胰腺获取原位灌洗液中加用UTI能保护胰腺组织,增加胰岛产量。     

成人胰岛细胞移植治疗1型糖尿病

目的 探讨新型成人胰岛细胞分离、纯化技术分离的成人胰岛细胞移植治疗1型糖尿病的安全性与有效性.方法 采用全氟化碳液(PFC)和UW液双层冷藏胰腺,Liberase酶消化,COBE 2991型专用胰岛细胞分离机分离及连续密度梯度纯化,获取高纯度与高活性的胰岛细胞.通过上腹部小切口,胃右静脉或脐静脉插管,将经短期培养的胰岛细胞经门静脉移植到11例1型糖尿病患者肝脏内.采用达利珠单抗或阿来佐单抗进行诱导,西罗莫司和他克莫司联用的方案预防排斥反应,术后观察胰岛素使用情况,监测血糖、G-肽与糖化血红蛋白水平以及肝功能、肾功能.结果 45个胰腺中,42个成功分离出胰岛细胞,其数量平均为28.5×104胰岛当量(IEQ)/个,纯度为95.7%,活率为93.2%,胰岛素释放试验刺激指数为2.43.11例1型糖尿病患者共行胰岛细胞移植20次,其中移植1次4例,2次5例,3次2例,每次移植胰岛细胞数平均为11 200 IEQ/kg.术后随访6个月至4年,6例完全撤除胰岛素,2例胰岛素用量较术前减少80%,3例减少50%.术后血糖稳定维持在正常水平,C-肽均超过0.166 nmol/L,糖化血红蛋白基本正常,肝、肾功能正常,未发生与胰岛细胞输注相关的并发症.结论 新型成人胰岛细胞分离、纯化方法可靠,采用该技术分离、纯化的成人胰岛细胞移植治疗1型糖尿病临床效果较好.     

大鼠胰岛的分离纯化方法改进与功能鉴定

目的 通过改进胰腺消化和分离的技术条件,提高成年大鼠胰岛分离纯化产率和质量. 方法 用胶原酶Ⅺ液灌注消化成年SD大鼠胰腺,对胰岛分离纯化方法加以改进:以 4 种比重的 Euro- Ficoll (F1∶D=1.132,F2∶D=1.108,F4∶D=1.069) 和 Hank's 液(F5∶D=1.023) 不连续密度梯度离心,以离心半径 15 cm,2 000 r/min 于4℃缓慢升降离心 20 min,收集位于F1 和 F2界面的胰岛.双硫腙特异染色法鉴定胰岛纯度;二醋酸酯荧光素/碘化丙啶染色法计算胰岛成活率;放射免疫分析法检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌量,计算刺激指数.将胰岛当量(islets equivalent quantity,IEQ) 为 1000 的胰岛移植于同品系糖尿病大鼠肾包膜下,9d 内隔日观察动物血糖的变化,评价胰岛功能.比较分离条件优化前后收获胰岛的产率和质量. 结果 改进纯化方法后每只大鼠胰岛收获量为(920±122) IEQ,胰岛纯度> 90%,胰岛细胞成活率为 91%±2%.胰岛细胞功能良好,在低糖和高糖刺激后培养液中胰岛素浓度分别为(18.25±0.32) mU/L 和(36.70±3.57)mU/L,刺激指数为 2.01±0.15.1000 IEQ 胰岛移植于糖尿病大鼠肾包膜下,观察期内可维持动物血糖水平正常. 结论 改进后的胶原酶灌注消化和不连续梯度离心方法提高了胰岛的产率,保证了胰岛的高纯度及高成活率.     

成人胰岛细胞的分离

目的　探讨成人胰岛细胞的分离及胰腺冷缺血时间与胰岛细胞活率的关系。方法　采取胰、肾联合切取 ,经腹主动脉插管 ,用自制的灌注器以高渗枸橼酸盐嘌呤溶液 (HC A液 ) 15 0 0～2 0 0 0ml进行原位灌洗。将肾与胰腺、十二肠、脾分离 ,采用胶原酶P消化胰腺 ,分离并纯化胰岛细胞 ,以双硫腙及丫腚橙染色 ,测定所得到的胰岛细胞的纯度及活率。结果　胰腺的冷缺血时间为 2 .5～ 8h ,温缺血时间为 0～ 3min。胰岛收获量为 (2 .38± 0 .6 7)× 10 3 IEQ/g ,纯化后胰岛细胞的活率为 19%～ 83% ,冷保存指数 (或输注指数 )为 9.8～ 6 6 .4。胰岛细胞的活率与胰腺的冷缺血时间呈负相关 ,冷保存指数和胰岛细胞活率呈负相关。结论　以高渗枸橼酸盐嘌呤溶液灌洗、胶原酶P消化胰腺所得到的胰岛细胞活率高 ,但胰腺的冷缺血时间不宜超过 5h。     

影响成人高质量胰岛分离的关键因素分析

目的探讨在胰岛分离过程中影响胰岛分离数量和活性的关键因素,以期进一步提高胰岛移植效果。方法通过分组观察以下因素对胰岛分离效果的影响:(1)胰腺重量和所用酶的量的比例;(2)胰腺消化过程中的震荡频率和幅度;(3)DNaseI 对胰岛分离的影响;(4)胰腺消化后的残余组织量与进行纯化的次数的关系;(5)消化下来的组织在 UW 液中放置的时间.结果当胰腺重量<70g,给予分散酶0.25g;胰腺重量70～120g,给予分散酶0.5g;胰腺重量>120 g,给予分散酶0.75g;消化10min 后震荡频率为100次/min,垂直幅度2～3 cm;向稀释液中加入 DNaseI;一次纯化过程加入消化胰腺组织最大量不超过20g;将纯化前的胰岛在 UW 液中放置30 min,获得纯化后胰岛数在(4459.28±704.51)～(5018.46±952.36)IEQ/g 胰腺组织,胰岛收获率在(79.06±12.53)%～(86.03±16.12)%,胰岛素刺激指数在(5.21±1.55)～(6.91±2.03),均高于对照组。结论消除上述关键影响因素的负面影响,可以明显提高胰岛分离数量和活性。