降钙素基因相关肽通过ERK1/2信号通路对人血管内皮细胞增殖的影响

[目的]探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖的影响,并从ERK1/2信号通路角度初步探讨其可能的机制.[方法]实验分为4组,分别为空白对照组、CGRP组、CGRP+CGRP 8-37组、CGRP+PD98059组.AlarmarBlue法检测各组人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)的增殖变化情况;免疫印迹技术观察CGRP诱导后ERK1/2的磷酸化,及CGRP8-37、PD98059对ERK1/2磷酸化的影响.[结果](1) CGRP可诱导HUVECs细胞增殖,该作用可被CGRP8-37和PD98059阻断;(2) CGRP可时间依赖性地诱导HUVECs细胞ERK1/2的磷酸化,CGRP8-37和PD98059可减弱其作用.[结论]CGRP可诱导HUVECs细胞增殖,ERK1/2信号通路参与其调控机制.     

ERK1/2对高糖环境下足细胞凋亡的作用及来氟米特对其的影响

目的：观察ERK1/2对高糖环境下足细胞凋亡的作用及来氟米特对其的影响。方法：培养的人足细胞分为正常糖组、高渗对照组、高糖组,高糖组按不同刺激时间又分为0.5h、1h、6h、12h、24h5组,应用Western印迹分析法检测各组足细胞ERK1/2信号途径中ERK1/2蛋白活化的变化。足细胞凋亡检测：将足细胞分为高糖对照组、抑制剂组、抑制剂＋来氟米特（A771726）组、A771726组,将以上各组足细胞培养24h后,分别进行ERK1/2信号途径的检测同前及流式细胞仪检测足细胞的凋亡率。结果：高糖组30min可以活化ERK1/2蛋白,6h开始达高峰,持续活化到24h开始降至基础水平。正常糖及高渗对照组未能活化ERK1/2。与高糖组相比,ERK1/2蛋白抑制剂（PD98059）抑制了ERK1/2的磷酸化,使磷酸化的ERK1/2（P-ERK1/2）蛋白表达明显减少（P〈0.01）,从而影响了下游多种核转录因子的活化,影响目的基因的表达而增加了足细胞的凋亡（P〈0.01）。A771726可以增加P-ERK1/2的表达量（P〈0.01）,从而减少足细胞的凋亡（P〈0.05）。而PD98059可以影响A771726的作用,使其对足细胞的保护作用减弱,其凋亡率比高糖组明显增加（P〈0.01）。结论：ERK1/2信号途径参与了来氟米特对足细胞的保护作用。     

ERK1/2激活参与乳化异氟醚后处理的脑保护作用

目的观察细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的激活在8%乳化异氟醚后处理对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤中的作用。方法健康成年雄性SD大鼠48只,随机均分为六组:假手术组(S组)、缺血-再灌注组(IR组)、乳化异氟醚后处理组(EI组)、ERK抑制剂PD98059组(PD组)、乳化异氟醚后处理+PD98059组(EP组)、溶媒DMSO组(D组)。除S组外,均采用大脑中动脉阻闭2h,再灌注24h建立局灶性脑缺血-再灌注模型。缺血2h恢复再灌注即刻,EI组、EP组腹腔注射8%乳化异氟醚10.5ml/kg,其余各组注射生理盐水10.5ml/kg。PD组、EP组和D组于再灌注前30min侧脑室分别注入PD98059和DMSO。再灌注24h时进行神经功能缺陷评分(NDS评分),并观察组织形态学变化及细胞凋亡、p-ERK1/2阳性表达。结果与IR组相比,EI组NDS评分降低,凋亡细胞减少,磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达上调(P<0.05);与EI组相比,EP组NDS评分增高,凋亡细胞显著增加,p-ERK1/2表达下调(P<0.05)。结论 8%乳化异氟醚后处理通过激活ERK1/2信号通路对抗局灶性脑缺血-再灌注损伤。     

ERK1/2 MAPK通路在TIMP-1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用

目的 探讨细胞外信号调节激酶(ERK1/2)丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路在基质金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用。 方法 将人正义、反义TIMP-1用脂质体法转染大鼠肾小球系膜细胞，并将细胞分为正常对照组、未转染组、空载体组、正义转染组和反义转染组。各组细胞分别用高糖(25 mmol/L)和(或)MEK(ERK1/2通路中的MAPK激酶)特异性抑制剂PD98059(50 μmol/L)刺激24 h。应用透射电镜观察细胞内部结构变化。Western 印迹观察磷酸化(p)的ERK1/2、P90rsk、Bad及总的P90rsk、Bad、Bcl-2蛋白的表达。 结果 加入PD98059后，各组细胞内可见凋亡小体形成、细胞皱缩、核固缩、染色体边集及膜泡样突变等现象，与未转染组比较，以反义转染组最明显，凋亡细胞数目最多；正义转染组细胞形态改变不十分明显，凋亡细胞数目相对较少。此外，加入PD98059后，ERK1/2、P90rsk、Bcl-2及Bad的磷酸化明显减少(P < 0.05)，ERK1/2和P90rsk的磷酸化以正义转染组最明显(P < 0.01)；总P90rsk、总Bad表达量在各组之间无显著差异。 结论 ERK1/2 通路在TIMP-1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡过程中起重要作用。     

MEK/ERK信号通路在吡咯喹啉醌促雪旺细胞增殖中的作用

目的 探讨MEK/ERK信号通路在吡咯喹啉醌促雪旺细胞增殖过程中的作用. 方法 体外培养雪旺细胞,S-100免疫荧光鉴定;Western blot检测MEK下游因子ERK1/2磷酸化激活形式(p-ERK1/2)的表达;MEK抑制剂(PD98059)阻断该通路后检测p-ERK1/2的表达;MTT法检测经PD98059阻断MEK通路后雪旺细胞的增殖情况. 结果 吡咯喹啉醌可激活雪旺细胞内MEK/ERK信号通路,在加入吡咯喹啉醌1 h后p-ERK1/2表达最高;吡咯喹啉醌在1～500 nmol/L范围内可使p-ERK1/2表达增加,1 000 nmol/L时与对照组比较差异无统计学意义,10 000 nmol/L时则表现为抑制作用(P＜0.05);经PD98059阻断MEK通路后p-ERK1/2的上调效应消失(P＜0.05).而且加入PD98059阻断MEK通路后吡咯喹啉醌对雪旺细胞的促增殖效果减弱. 结论 吡咯喹啉醌可激活雪旺细胞MEK/ERK信号通路,且该通路在吡咯喹啉醌促雪旺细胞增殖过程中发挥作用.     

MKP-1/ERK通路参与雌二醇减轻中性粒细胞迁移的机制研究

目的研究雌二醇对f-MLP诱导的体外中性粒细胞活化的影响, 并探讨这种作用与ERK通路及其上游蛋白MKP-1的关系。方法将HL-60诱导分化成类中性粒细胞(dHL-60)。用MTT实验检测不同浓度梯度的E2、f-MLP、PD98059或混合液对dHL-60的影响。通过Transwell实验和超氧化物检测E2、PD98059对f-MLP诱导的dHL-60迁移和超氧化的抑制作用。Western blot检测ERK、p-ERK、MKP-1的表达水平。结果 E2、f-MLP、PD98059单独或联合使用对dHL-60细胞的存活率没有影响。f-MLP能显著诱导中性粒细胞迁移和过度氧化。生理、药理学剂量的E2和PD98059可以有效抑制f-MLP的这种作用。Western blot检测结果显示f-MLP诱导ERK磷酸化, 而E2和PD98059有效抑制f-MLP的这种作用。另外, 雌二醇能有效地增加MKP-1的表达。结论雌二醇可能通过增加MKP-1蛋白降低ERK磷酸化, 从而抑制f-MLP诱导的体外中性粒细胞迁移及超氧化。     

丝裂霉素C诱导成纤维细胞凋亡的作用及其机制

目的 观察丝裂霉素C(MMC)对成纤维细胞诱导凋亡的作用及机制.方法 体外培养成纤维细胞并传至5～8代,分别用含有0～0.3g/L MMC的MEM培养液处理成纤维细胞12h后CCK-8试剂盒检测不同浓度MMC对成纤维细胞的生长抑制效果;以0～0.2g/L MMC处理细胞爬片后用Hoechest33342细胞核染色,荧光显微镜下观察凋亡细胞核形态并用image pro-plus软件计数凋亡细胞;按不加药培养细胞12 h作对照组、0.2g/L.MMC培养细胞12h、P13K/Akt抑制剂LY294002 100 nmol/L与MEK/ERK抑制剂PD98059 100nmol/L分别处理细胞1h后换新鲜培养基培养11h分为4组,提取胞质蛋白,Western blot法检测Caspase-3、p-ERK1/2、p-Akt表达量.结果 MMC对成纤维细胞的抑制率与药物浓度呈正相关性,0.2g/L MMC对细胞活性抑制率达50.21%;Hoeeheat33342细胞核染色随MMC浓度升高出现凋亡细胞核特征的染色质凝聚,边集,呈亮蓝色核的比率逐渐增高,凋亡细胞计数显示0.05、0.1、0.2g/L MMC处理组凋亡率显著高于其他低浓度组,差异有统计学意义(P<0.05).Western blot检测0.2 g/L MMC组、PD98059组、LY294002组C8spase-3表达均显著高于对照组,p-ERK1/2、p-Akt表达均较对照组降低.结论 一定浓度的MMC可诱导成纤维细胞发生凋亡,其效应途径部分是通过降低ERK1/2、Akt的磷酸化水平使胞质内凋亡执行蛋白Caspase-3的表达水平增加,诱导成纤维细胞由正常增生状态转而发生凋亡减少胶原纤维生成,从而抑制瘢痕形成.     

重楼皂苷Ⅰ通过ERK/P65/DNMT1通路抑制前列腺癌PC3细胞生长的分子机制

目的:研究重楼皂苷Ⅰ(PPⅠ)对去势抵抗性人前列腺癌PC3细胞生长的抑制作用及其分子机制。方法:体外培养PC3细胞,予不同浓度(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4μmol/L)的PPⅠ处理24、48、72 h,另设对照组,MTT法观察PPⅠ对PC3细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western印迹检测PPⅠ对磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)、细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、核转录因子kappa B(NF-κB)/p65以及DNA甲基转移酶1(DNMT1)蛋白表达的影响,并加入ERK1/2抑制剂(PD98059)后检测PPⅠ对NF-κB/p65表达的影响。结果:MTT结果显示,PPⅠ能抑制PC3细胞的体外增殖,与对照组相比,PC3细胞从给药浓度0.4μmol/L(0.85±0.05 vs 1.00±0.00,P0.01)开始明显下降,且呈时间和剂量依赖性。流式细胞术检测显示,PPⅠ能明显诱导PC3细胞早期凋亡,与对照组相比,PC3细胞早期凋亡率从给药浓度0.8μmol/L(13.83±2.97 vs 4.83±0.95)开始明显增加(P均0.01),且呈剂量依赖性;Western印迹显示,PPⅠ以时间依赖性上调p-ERK1/2和ERK1/2蛋白的激活与表达,与对照组相比,给药时间从2 h(1.73±0.17 vs 1.00±0.00,P0.01)开始,p-ERK1/2明显被激活表达,PPⅠ以剂量依赖性下调NF-κB/p65、DNMT1蛋白的表达,与对照组相比,给药浓度分别从1.6μmol/L(0.67±0.11 vs 1.00,P0.01)与1.2μmol/L(0.63±0.06 vs 1.00±0.00,P0.01)开始,NF-κB/p65、DNMT1表达明显下调;抑制ERK1/2磷酸化能逆转重楼皂苷Ⅰ对NF-κB/p65蛋白表达的下调,与PPⅠ组相比,PD98059+PPⅠ组NF-κB/p65蛋白表达(0.86±0.18 vs 0.43±0.09,P0.05)明显上调。结论:PPⅠ可能通过介导ERK1/2通路抑制NF-κB/p65和DNMT1蛋白表达,诱导PC3细胞早期凋亡,进而抑制细胞增殖。     

高糖通过ERK1/2通路对人肾小管上皮细胞脂联素表达的影响

目的通过体外培养人肾小管上皮细胞(human proximal tubular epithelial cells,HK-2),观察高糖对HK-2脂联素(adiponectin,ADPN)表达水平的影响并探讨其可能机制。方法将培养的HK-2细胞分为4组:①低糖对照组(5.6 mmol/L葡萄糖);②PD98059(职K1/2信号传导通路的抑制剂)组(5.6 mmol/L葡萄糖+50μmol/L PD98059);③高糖组(30 mmol/L葡萄糖);④高糖+PD98059组(30 mmol/L葡萄糖+50μmol/L PD98059)。各组分别培养48 h后荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测HK-2细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activator receptor,PPAR-γ)及脂联素mRNA的表达,免疫印迹(Western blotting)法检测各组脂联素蛋白的表达水平。结果 HK-2细胞表达脂联素;PD98059组与低糖对照组相比,PPAR-γmRNA及脂联素的mRNA和蛋白表达的差异均无统计学意义(均P0.05);与低糖对照组相比,高糖组PPAR-γmRNA及脂联素mRNA和蛋白表达均显著降低,差异均有统计学意义(均P0.05);与高糖组相比,高糖+PD98059组PPAR-γmRNA及脂联素mRNA和蛋白表达均显著升高,差异均有统计学意义(均P0.05)。结论高糖可以降低HK-2细胞脂联素mRNA和蛋白的表达;高糖作用于HK-2细胞可能是通过激活ERK1/2信号传导通路降低PPAR-γ的表达,从而影响其脂联素的表达。     

地塞米松对兔髓核细胞增殖及增殖细胞核抗原表达的影响

目的 观察地塞米松对兔椎间盘髓核细胞增殖的影响,以及对髓核细胞表达增殖细胞核抗原(PCNA)的影响.方法 无菌条件下取兔椎间盘,常规分离消化髓核细胞进行培养;传代培养第2代髓核细胞7 d,随机分为4组,实验组给予l～100 nmol/L地塞米松进行培养,对照组给与等量磷酸盐缓冲液(PBS),培养5 d后收集细胞.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测地塞米松对兔髓核细胞内PCNA mRNA表达的影响;并提取蛋白用Western blot方法检测PCNA蛋白表达.结果 RT-PCR及Western blot检测结果表明,1～100 nmol/L地塞米松可增加兔髓核细胞内PCNA的表达,当地塞米松浓度为100 nmol/L时效果最显著,分别增加了0.42和1.37倍,差异有统计学意义(P<0.05).结论 地塞米松可以促进兔椎间盘髓核细胞的增殖,并可使兔髓核细胞内PCNA的表达增高.     

低密度脂蛋白和氧化低密度脂蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的通路研究

目的探讨低密度脂蛋白（LDL）和氧化（OX）LDL是否可诱导人肾小管上皮细胞转分化及其可能机制。方法体外培养的第2代肾小管上皮细胞随机分为（1）阴性对照组；（2）LDL（50mg／ml）组；（3）oxLDL（50mg／ml）组；（4）LDL（50mg／m1）＋PD98059（5μmol／L）组；（5）oxLDL（50mg／ml）＋PD98059（5μmol／L）组。应用形态学、免疫荧光、Western印迹观察LDL和oxLDL刺激小管细胞角蛋白（cytokerafin）、E-钙粘糖蛋白（cadhefin）、α-SMA和波形蛋白（vimenfin）表达的改变、Ⅰ型胶原产生的改变，及其与ERK1／2MAPK通路活化的关系。结果OXLDL较LDL有更强的致小管上皮细胞转分化的作用，与对照组相比。细胞中上皮细胞标记cytokeratin和E-cadherin表达减少，间充质细胞标记α-SMA和vimentin明显增加，Ⅰ型胶原产生增多（P〈0．05）。LDL和oxLDL刺激组细胞中ERK1／2MAPK和GSK-3β磷酸化活化较对照组明显增强（P〈0．05）；β-catenin发生细胞核内转移。MAPK抑制剂PD98059可抑制GSK-3β的磷酸活化，并几乎完全阻断oxLDL诱导的肾小管上皮细胞转分化，但对LDL诱导的小管上皮细胞转分化只有部分阻断作用。结论本研究首次在体外观察到（1）oxLDL可诱导肾小管细胞上皮细胞转分化和Ⅰ型胶原的产生，作用明显强于LDL；（2）ERK1／2MAPK、GSK-3β和β-catenin组成一条信号通路调节LDL和oxLDL诱导的小管上皮细胞转分化。     

丝裂酶原活化蛋白激酶激酶1/2抑制对家兔关节软骨保护作用的研究

目的评价丝裂酶原活化蛋白激酶（mitogen—activated protein kinase，MAPK）信号转导通路中MAPK激酶1／2（MEKI／2）在骨关节炎发病过程中的作用。方法新西兰家兔30只，制作OA模型，随机分成3组，每组10只。从造模术后第4天开始，第1组和第2组分别注射100μmol／L和40μmol／L的PD98059，第3组注射PBS液体作为安慰剂对照组，每周2次。另取10只家兔，正常关节内注射PBS液体作为正常对照组。8周后处死动物，进行股骨髁关节软骨退变的大体评分。用Western Blot印记杂交法测定软骨组织中ERK1／2以及磷酸化ERK1／2的表达。用实时定量PCR方法测定基质金属蛋白酶-1／13（MMp-1／13）的mRNA表达水平。结果与使用PBS的安慰剂对照组相比，使用PD98059的关节软骨破坏明显减轻。磷酸化的ERK1／2在100μmol／LPD98059干预组明显低于40μmol／L干预组和安慰剂对照组。而MMP-1／13的mRNA表达在不同浓度的干预组均低于安慰剂对照组。结论MAPK信号转导通路参与了骨关节炎关节软骨破坏的病理过程。MEK1／2选择性阻滞剂PD98059可以在关节炎动物活体内有效抑制关节炎软骨破坏的程度，该作用可能与其有效抑制ERK1／2的磷酸化激活有关。     

细胞外信号调节蛋白激酶介导醛固酮诱导的肾小球系膜细胞增殖

Objective To determine the role of extracellular signal-regulated kinases (ERK1/2) in aldosterone-induced rat mesangial cells (RMCs) proliferation. Methods RMCs were obtained from intact glomeruli of 4- to 6-week-old Sprague-Dawley rats and characterized according to published methods. RMCs between passages 5 and passages 10 were used. Protein levels of mineralocorticoid receptor(MR) in RMCs were analyzed by Western blotting. The cells were divided into the following groups: control group, PD98059(10 ?滋mol/L) group, eplerenone (1 ?滋mol/L) group, aldosterone (100 nmol/L) group, aldosterone (100 nmol/L) ＋PD98059 (10 ?滋mol/L) group, aldosterone(100 nmol/L)＋eplerenone (1 ?滋mol/L) group. ERK1/2 activity was measured by Western blotting. Cell proliferation of RMCs was evaluated by [3H]-thymidine uptake measurements. Results MR protein expression in RMCs was confirmed by Western blotting. Aldosterone activated ERK1/2, and the maximal ERK1/2 activation induced by aldosterone was at a concentration of 100 nmol/L. Aldosterone (100 nmol/L)-induced activation of ERK1/2 peaked at 10 minutes (P<0.05). Pretreatment with a selective MR antagonist eplerenone (1 ?滋mol/L) significantly attenuated aldosterone-induced ERK1/2 phosphorylation. Aldosterone (100 nmol/L) treatment for 30 hours increased [3H]-thymidine incorporation of RMCs (135%±8% of controls, P<0.05). Cellular proliferation induced by aldosterone could be prevented by pretreatment with eplerenone or an ERK (MEK) inhibitor PD988059. Conclusion Aldosterone induces RMCs proliferation through MR and ERK1/2 activation, which may contribute to the pathogenesis of glomerular mesangial injury.     

降钙素基因相关肽/细胞外调节激酶信号通路对人MG-63细胞增殖的实验研究

目的 研究外源性降钙素基因相关肽(CGRP)对人MG-63细胞增殖的影响及其可能涉及的信号通路.方法 采用甲基噻唑基四唑(MTT)法和细胞计数法观察对比不同浓度外源性CGRP及其受体拮抗剂CGRP8-37与细胞外调解激酶(ERK)抑制剂PD98059对体外培养的人MG-63细胞增殖的影响.根据不同分组将体外培养的人MG-63细胞用CGRP、CGRP8-37及PD98059作用24 h后,通过免疫细胞化学方法观察细胞骨保护蛋白(OPG)、护骨素配体(RANKL)、ERK表达强度的变化.结果 不同浓度CGRP均可促进MG-63细胞的增殖,促进作用随浓度增高而增强,CGRP8-37、PD98059可减弱此作用,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).CGRP呈剂量依赖性的上调成骨细胞OPG和ERK的表达,同时下调RANKL的表达,CGRP-37和PD98059可减弱此作用,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 CGRP可通过ERK信号通路改变OPG/RANKL的比值来调控成骨细胞增殖.

Abstract：

Objective To explore the effect of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on proliferation and differentiation of MG-63 cells through extracellular signal-regulated kinase (ERK) pathway in vitro. Methods To study the effects of ERK inhibitor PD98059 and CGRP inhibitor CGRP8-37, 2 groups of MG-63 cells were treated with PD98059 and CGRP8-37 for one hour prior to serum treatment. The other 4 groups were cultured with serum of different doses (high, middle, low and blank). Proliferation and apoptosis of MG-63 cells were observed by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method and cell-counting.Expressions of osteoprotegerin (OPG), receptor activator of nuclear factor kappaβ ligand (RANKL) and ERK were observed through immunocytochemical and image analysis. Results MTT showed that CGRP promoted proliferation of MG-63 cells and expressions of OPG and ERK but not expression of RANKL The effect was dose-dependent, and significantly inhibited by either CGRP 8-37 or PD98059 (P <0.05) . Conclusion CGRP can stimulate proliferation of MG-63 cells via CGRP receptor and ERK pathway to regulate the ratio of OPG/RANKL.