不同剂量和作用时间地塞米松对大鼠骨密度和成骨细胞作用的研究

目的观察地塞米松(Dex)不同剂量及不同作用时间对大鼠骨量、成骨细胞的影响。方法 120只3月龄SD雌性大鼠,随机分对照组(生理盐水)、小剂量组(地塞米松1 mg/kg)、中剂量组(地塞米松2.5 mg/kg)、高剂量组(地塞米松5 mg/kg),每组30只,2次/周肌内注射,分别干预4 w、9 w、12 w。给药前及干预后采用双能X线骨密度仪测大鼠全身骨密度(BMD),免疫组化法检测骨组织碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原蛋白表达。从新生SD大鼠颅骨体外分离培养成骨细胞,随机分为5组:空白对照组、5×10-8mol/L Dex组、5×10-7mol/L Dex组、5×10-6mol/L Dex组、5×10-5mol/L Dex组,分别培养12h、24 h、48 h后,采用CCK8法检测成骨细胞增殖,采用RT-PCR检测成骨细胞ALP mRNA、I型胶原mRNA表达。结果 (1)干预4 w,不同剂量Dex组大鼠的骨密度与对照组无差异(P0.05)。干预9 w,不同剂量Dex组大鼠的骨密度均低于对照组(P0.05),高剂量组大鼠骨密度低于小剂量组(P0.05);干预12 w,不同剂量Dex组大鼠的骨密度均低于对照组(P0.05),且随着剂量的增加,大鼠的骨密度逐渐降低。(2)干预4 w,ALP、I型胶原蛋白表达与对照组无差异(P0.05);干预9w,中剂量和高剂量组大鼠骨组织I型胶原蛋白表达均低于对照组(P0.05),不同剂量组大鼠骨组织ALP蛋白表达均低于对照组(P0.05);干预12 w,大鼠骨组织ALP、I型胶原蛋白表达均低于对照组(P0.05);随着Dex剂量的增加,大鼠骨组织ALP及I型胶原蛋白表达逐渐降低。(3)体外分离培养成骨细胞干预12 h,5×10-6mol/L Dex和5×10-5mol/L Dex均抑制成骨细胞增殖(P0.05),5×10-5mol/L Dex组成骨细胞的ALP、I型胶原mRNA表达减少(P0.05);干预24 h及48 h,不同浓度Dex均明显抑制成骨细胞增殖(P0.05),ALP、I型胶原mRNA表达明显减少(P0.05),呈剂量和时间依赖性。结论地塞米松可能通过抑制成骨细胞的增殖及骨形成,导致SD大鼠骨密度降低。     

泮托拉唑通过一氧化氮通路促进 BMSCs 增殖及向成骨细胞定向分化

目的探讨质子泵抑制剂泮托拉唑(Pantoprazole)对原代大鼠骨髓间质干细胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)的增殖及向成骨细胞分化的影响机制。方法建立原代大鼠BMSCs体外模型,在无酚红α-MEM培养基(含10%经葡聚糖包被炭末吸附的血清)中加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸、50 mg/L维生素C和10 nmol/L地塞米松,诱导BMSCs向成骨细胞分化。给予不同浓度的泮托拉唑观察其对BMSCs的作用:观测MTT掺入率反映细胞增殖的情况;测定细胞内碱性磷酸酶活性与钙沉积量反映BMSCs向成骨细胞分化的状况;用一氧化氮试剂(Nitric oxide,NO)盒检测一氧化氮释放量。结果泮托拉唑在一定浓度范围内(0.1~10μmol/L)呈剂量依赖性增加原代大鼠BMSCs的MTT掺入率、细胞碱性磷酸酶活性及钙沉积量,并可适度增加一氧化氮释放量。结论泮托拉唑在0.1~10μmol/L剂量范围可通过一氧化氮信号传导通路促进原代BMSCs的增殖及其向成骨细胞的分化。     

股密葆含药血清对高浓度地塞米松干预后成骨细胞增殖分化作用的影响

目的：观察股密葆含药血清对高浓度地塞米松干预后成骨细胞增殖分化的影响.方法：用多次酶消化法分离出生24 h内新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞,P1代细胞进行实验.将不同浓度地塞米松（0、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L）干预成骨细胞,1周后进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色,3周后进行矿化结节染色.根据上述实验结果,进一步选择10-5 mol/L地塞米松干预成骨细胞1周,继而改换空白鼠血清及高、中、低浓度股密葆含药血清培养基,培养1周后进行ALP染色,Western-blot检测Ⅰ型胶原及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）表达,培养2周后进行矿化结节染色.结果：生理浓度地塞米松（10-8 moL/L）可促进成骨细胞ALP的表达及矿化结节产生,而高浓度地塞米松（10-7～10-4 mol/L）可抑制上述结果,股密葆含药血清可逆转高浓度地塞米松对成骨细胞ALP、矿化结节、Ⅰ型胶原及PCNA的抑制作用.结论：高浓度地塞米松可抑制成骨细胞增殖分化,而这种抑制作用可被股密葆含药血清逆转.     

11β羟化类固醇脱氢酶1与成骨细胞分化之间相互关系的研究

目的 通过体外地塞米松刺激原代大鼠成骨细胞分化,观察11β羟化类固醇脱氢酶1（11β-HSD1）在成骨细胞分化中的变化以及相关成骨基因的表达情况,探讨11β-HSD1与成骨细胞分化之间关系以及可能的作用机制.方法 采用酶消化法获得大鼠成骨细胞,建立地塞米松（Dex）药物刺激模型（Dex组1×10-8 mol/L和正常对照组）,分别于培养0、2、4、6、8、10 d抽提RNA行RT-PCR和蛋白行Western Blot,检测成骨细胞相关基因和11β-HSD1的表达情况.结果 11β-HSD1在正常成骨细胞中随着培养表达逐渐升高,在Dex刺激组中成骨细胞分化指标ALP、COLⅠ较对照组明显升高,伴有11β-HSD1 mRNA和蛋白水平的下调.结论 在成骨分化过程中,11β-HSD1表达下降,与分化呈逆相关.11β-HSD1可能通过自分泌的方式参与调节成骨细胞的分化.     

orexin-1受体抑制剂通过Wnt通路促进骨髓间充质干 细胞的成骨分化

目的研究Wnt/β-catenin信号通路对orexin-1受体抑制剂介导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响。方法(1)分离提取SD大鼠股骨、胫骨的BMSCs,用流式细胞仪进行细胞表型鉴定;(2)实验分组:对照组、10-5mol/L、10-6mol/L质量浓度的orexin-1受体抑制剂溶液,于成骨诱导第5天免疫印迹法和实时荧光定量PCR法观察Wnt/β-catenin信号通路关键靶点蛋白Dickkopf-1、Gsk3β、β-catenin以及基因Gsk3β、β-catenin mRNA表达,以观察Wnt信号通路对orexin-1受体抑制剂诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。结果 10~(-5)mol/L、10~(-6)mol/L的orexin-1受体抑制剂处理BMSCs5天后,Dickkopf-1、β-catenin和GSK3β蛋白表达升高,β-catenin和GSK3βmRNA表达升高。结论 orexin-1受体抑制剂促进大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞方向分化的作用可能与调控Wnt/β-catenin信号通路有关。     

脱氢表雄酮对离体大鼠成骨细胞代谢和一些细胞因子的影响

目的 研究脱氢表雄酮(DHEA)促进成骨细胞(OB)增殖的作用和机制.方法 体外分离培养大鼠OB,取传一代细胞,分别给予10-5、10-7、10-9,mmol/L DHEA培养72 h,以10-8mmol/L雌二醇(estradiol,E2)为阳性对照,另设空白对照组.以细胞形态学和碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定.应用光镜、四唑盐(MTT)法检测细胞的生长和增殖.茜素红染色观察成骨细胞矿化结节形成功能;同时双抗体夹心ABC-ELISA法测定不同浓度DHEA培养液中对VEGF、OPG、TGF-β、IL-1β和GM-CSF浓度的影响.结果 不同浓度DHEA组OB增殖能力均有上升,其中以10-7mmol/L DHEA组最显著(P＜0.01),其作用和E2相似(P＞0.05);不同浓度DHEA组ALP的活性均升高,亦以10-7 mmol/L DHEA组最显著(P＜0.01),10-7、10-9mmol/L DHEA的作用和E2和相似(P＞0.05);10-9mmol/L DHEA组单位细胞数的ALP活性高于空白对照组(P＜0.05).不同浓度DHEA组矿化面积及矿化面积比均有显著增加(P＜0.01),其作用和E2相似.在低浓度DHEA组的培养中对OPG、TGF-β1、VEGF的反应呈上升趋势与对照组有显著差别与0B增殖能力呈正相关;在高浓度DHEA组的培养中对IL-1β、GM-CSF的反应呈下降趋势与对照组有显著差别与OB增殖能力呈负相关.结论 DHEA能够促进大鼠OB生长和增殖,其作用可能与刺激OPG、TGF-β、VEGF;抑制IL-1β,GM-CSF途径有关.     

牛膝活性成分β-蜕皮甾酮通过Akt信号干预地塞米松诱导的骨细胞凋亡

目的探讨牛膝活性成分β-蜕皮甾酮对地塞米松诱导MLO-Y4骨样细胞凋亡的抑制作用及其可能的作用机制。方法 10μmol/L地塞米松(dexamethasone,Dex)作用于MLO-Y4骨样细胞,以PI3K/Akt抑制剂LY294002为对照,β-蜕皮甾酮(β-Ecdysone,β-Ecd)干预,分为6组:①正常组;②10μmol/L Dex模型组;③10μmol/L Dex+10μmol/Lβ-Ecd组;④10μmol/L Dex+10μmol/Lβ-Ecd+50μmol/L LY294002组;⑤10μmol/L Dex+0.1μmol/Lβ-Ecd组;⑥10μmol/L Dex+0.1μmol/Lβ-Ecd+50μmol/L LY294002组。作用48 h后,Annexin V-FITC/PI法检测细胞早期凋亡率,Western-Blot检测Akt1、Phospho-Akt(Thr308)、Connexin43(CX43)、Caspase9、Bad、Phospho-Bad蛋白表达。结果与正常组比较,Dex组细胞凋亡率升高,Caspase9、Bad蛋白表达升高,Akt1、CX43蛋白表达降低;与造模组比较,β-Ecd减弱Caspase9蛋白表达,使Akt1、CX43蛋白表达增强;LY294002使Akt1、CX43蛋白表达明显减弱,而β-Ecd并不能使LY294002降低的Akt1蛋白表达升高。结论 0.1μmol/L、10μmol/Lβ-蜕皮甾酮可能通过Akt信号途径干预地塞米松诱导的骨细胞凋亡。     

地塞米松通过线粒体途径诱导成骨细胞凋亡的研究

目的观察地塞米松对离体成骨细胞凋亡的影响,探讨地塞米松对成骨细胞凋亡的分子作用机制。方法采用不同浓度地塞米松(10~(-8)、10~(-6)、10~(-4)mol/L)干预SD大鼠离体成骨细胞,DAPI染色观察细胞核形态,透射电镜观察细胞核及线粒体形态,流式细胞术检测细胞凋亡率,JC-1荧光探针检测线粒体跨膜电位。结果 10~(-8)、10~(-6)、10~(-4)mol/L地塞米松干预24 h后,DAPI染色发现,10~(-8)mol/L地塞米松组的成骨细胞很少发生凋亡,10~(-6)mol/L和10~(-4)mol/L地塞米松组的成骨细胞凋亡明显,地塞米松的浓度越高,核固缩、核裂解等凋亡现象越明显;透射电镜观察发现,随着地塞米松浓度增加,细胞核固缩明显,线粒体肿胀、空泡样变化现象增多;成骨细胞的凋亡率随着地塞米松浓度的增加而逐渐增高,与空白对照组相比,10~(-8)mol/L地塞米松组细胞凋亡率无明显升高(P0.05),10~(-6) mol/L和10~(-4)mol/L地塞米松组的成骨细胞凋亡率分别较空白对照组增加7.240%和31.173%(P0.05);随着地塞米松浓度的增加,线粒体膜电位逐渐减低,与空白对照组相比较,10~(-8)mol/L地塞米松组细胞膜电位下降不明显(P0.05),10~(-6) mol/L和10~(-4)mol/L地塞米松组膜电位下降分别较空白对照组降低6.814%和17.846%(P0.05)。结论地塞米松通过激活线粒体途径诱导成骨细胞凋亡,存在浓度依赖性。     

依普拉芬对新生大鼠颅盖骨成骨细胞BMP-2和TGF-β1 mRNA表达的影响

目的研究依普拉芬对体外培养的原代大鼠成骨细胞BMP-2(Bone Morphogenic Protein-2,骨形态发生蛋白-2)和TGF-β1(Transforming Growth Factor-β1,转化生长因子-β1)mRNA表达的影响,探讨其预防绝经后骨质疏松的机制。方法体外分离培养新生大鼠颅盖骨成骨细胞,取第二代细胞,将不同浓度的依普拉芬加入培养液,72h后用RT-PCR技术检测各组细胞BMP-2和TGF-β1mRNA表达情况。结果与阴性对照组比较,各浓度组的依普拉芬均可使成骨细胞BMP-2和TGF-β1mRNA表达量显著增加(P<0.01),其中,依普拉芬浓度在10-8~10-5mol/L之间作用最为显著。结论10-8~10-5mol/L浓度范围内的依普拉芬均可促进成骨细胞BMP-2和TGF-β1mRNA的表达,从而间接促进其增殖和分化,增加骨形成。     

地塞米松促进大鼠颅骨成骨细胞向脂肪细胞转分化

目的 研究在不同浓度地塞米松作用下,体外培养的大鼠颅骨成骨细胞能否转分化为脂肪细胞,以进一步探讨糖皮质激素性骨质疏松症发病的具体机制.方法 将原代培养的大鼠颅骨成骨细胞分为四组,分别用含不同浓度的地塞米松(0 mol/L、10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6mol/L)的DMEM(H)培养基培养.于作用后第7天、21 d,采用倒置相差显微镜观察细胞形态的变化,进行细胞化学染色(茜素红钙结节染色、油红O染色),并采用实时荧光定量RT-PCR检测PPARγ-2、LPL及ALP基因mRNA的表达.结果 在10-6、10-7mol/L的地塞米松作用下,大鼠成骨细胞矿化能力减弱,胞浆中出现脂滴,RT-PCR结果显示脂肪细胞标志基因PPAR(γ)-2、LPL mRNA表达增高,成骨细胞标志基因ALP mRNA表达减少.而10-8mol/L地塞米松对成骨细胞的分化有促进作用.结论 长期、大剂量应用糖皮质激素可促进大鼠颅骨成骨细胞转分化为成熟的脂肪细胞,这可能是糖皮质激素性骨质疏松症的发病机制之一.