骨折愈合过程中的骨形态形成蛋白表达

骨折愈合过程包括骨祖细胞的趋化、增殖、分化、并合成细胞外基质。它以对细胞、血管、以及骨基质的损伤开始 ,最终达到彻底的重新塑形而没有瘢痕形成 ,是细胞和基质的一个连续变化过程。骨折愈合的组织学特征已很明确 ,但在生化和调控方面仍不甚明确。近来用免疫组化、ＲＴ -ＰＣＲ、原位杂交等方法检测ＢＭＰ在骨折愈合过程中的表达 ,以及ＢＭＰ在骨诱导及骨折愈合方面的作用 ,表明ＢＭＰ是骨折愈合过程中的关键物质 ,本文主要就骨折愈合过程中ＢＭＰ的表达作一综述。1　骨折愈合中骨形态形成蛋白的表达1.1　正常骨折愈合正常骨折愈合分膜…     

高能震波对骨痂中骨形成蛋白表达的影响

目的 观察高能震波（ＨＥＳＷ）对骨痂中骨形成蛋白（ＢＭＰ）表达的影响，探讨其促进骨折愈合的机理。方法 手术造成家兔双侧胫骨中段标准骨折模型，对一侧胫骨骨折部施以ＨＥＳＷ，另一侧为对照组，术后每周进行Ｘ线及组织学检查，并取骨痂组织切片用ＢＭＰ抗体进行免疫组化染色（ＳＡＢＣ法（）。结果 实验组骨痂中ＢＭＰ表达强度在第２－４周时明在于对照组（Ｐ〈０．０１），且Ｘ线摄片及组织学观察均显示实验组骨折愈合时间     

骨折合并脑外伤时骨愈合过程中bFGF作用的实验研究

多年来人们在临床实践中观察到骨折合并脑外伤患者骨痂过度生长，甚至在肌肉中出现异位骨化，骨折愈合明显加快，但其发生机制尚不清楚。本研究通过酶联免疫吸附法和免疫组织化学染色，研究骨折合并脑外伤时血清中bFGF含量的变化与骨折位点bFGF表达的关系，探讨脑外伤时骨折愈合加速的机制。材料与方法一、主要仪器和试剂OLYMPAS显微镜、摄像镜和MIAS－２０００图像分析仪由四川大学公共卫生学院毒理药理教研室提供。DG３０２２酶联免疫检测仪由四川大学华西医学中心免疫教研室提供。人重组bFGFSandwichELISA药盒为美国R＆DSys…     

雌激素对骨折愈合过程中骨形态发生蛋白4 mRNA表达的影响

目的：探讨骨折愈合过程中雌激素对骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein-4，BMP—4)基因表达的影响，了解BMP—4在骨折愈合过程中的作用。方法：180只雌性SD大鼠随机分成4组。OVXE1组为卵巢切除后1d开始雌激素替代治疗；OVXE2组为骨折后雌激素替代组；OVX组为雌激素缺乏组；SO组为正常对照组。所有动物在一侧胫骨中段造成骨折模型；各组动物分别在骨折后1、2、3、4、5、6、7、14、28d处死取材；标本制成石蜡切片，用地高辛标记的BMP-4 cDNA探针进行原位核酸分子杂交；实验结果经计算机图像处理系统分析并作统计学处理。结果：各组动物骨折后1—3d，骨折周围血肿及组织内BMP—4 cRMA检测为阳性，从第4d开始为阴性。OVX组的BMP—4 mRNA表达较任何一组都明显增多(P＜0．05)；SO组及OVXE1组最少。结论：BMP—4主要在骨折愈合早期起作用。雌激素对BMP-4基因的表达有抑制作用，将BMP—4基因的表达控制在一定程度内可能是雌激素调节骨折愈合的一种方式。     

骨形成蛋白-6和骨形成蛋白-9在糖尿病合并骨折大鼠中的表达

目的:探讨骨形成蛋白(BMP)-6和BMP-9在糖尿病合并骨折时的表达改变及其与骨折愈合的关系。方法:将44只6周龄雄性SD大鼠采用Excel简单随机化分法分为糖尿病组(DM, n＝22)和非糖尿病组(ND, n＝22)。DM组腹腔注射链脲佐菌素枸橼酸溶液(STZ)50 mg/kg,ND组注射等...     

骨折合并脑外伤时IGF-Ⅱ对骨折愈合的影响

目的测定骨折合并脑外伤后血清胰岛素生长因子2(insulin-like growth-factor 2,IGF-Ⅱ)的变化情况,并与单纯脑外伤、单纯骨折病人以及正常人进行对比,分析脑外伤后IGF-Ⅱ浓度变化与骨折愈合之间的关系,以期为临床骨折的治疗提供新的理论依据。方法选择52例住院患者,随机分为四组,每组13例,包括正常组、单纯骨折组、骨折合并脑外伤组及单纯脑外伤组。每例于伤后1、3、7、14d抽取外周静脉血5ml,采血后室温凝固30min,离心1000×G15min,收集分离血清,于-20℃冷冻保存。试验时严格按照IGF-Ⅱ试剂盒使用说明进行操作,计算出所有标本的IGF-Ⅱ的含量,并经统计学分析得出结论。结果单纯脑外伤组和单纯骨折组伤后第3天血清IGF-Ⅱ含量升高,1周时为正常组的2倍,2周时为正常组的3倍。骨折合并脑外伤组伤后第3天血清IGF-Ⅱ含量明显升高,为正常组的2倍,1周时可达5倍,2周时可达到7倍。其与单纯骨折组或单纯脑外伤组比较,差别均有统计学意义(P0.05)。结论骨折合并脑外伤病人IGF-Ⅱ含量明显升高,提示IGF-Ⅱ可能加速骨折愈合过程。     

骨折合并脑外伤时IGF—Ⅱ对骨折愈合的影响

目的测定骨折合并脑外伤后血清胰岛素生长因子2（insulin—like growth-factor2,IGF-Ⅱ）的变化情况,并与单纯脑外伤、单纯骨折病人以及正常人进行对比,分析脑外伤后IGF-Ⅱ浓度变化与骨折愈合之间的关系,以期为临床骨折的治疗提供新的理论依据。方法选择52例住院患者,随机分为四组,每组13例,包括正常组、单纯骨折组、骨折合并脑外伤组及单纯脑外伤组。每例于伤后1、3、7、14d抽取外周静脉血5ml,采血后室温凝固30min,离心1000×G15min,收集分离血清,于-20℃冷冻保存。试验时严格按照IGF-Ⅱ试剂盒使用说明进行操作,计算出所有标本的IGF-Ⅱ的含量,并经统计学分析得出结论。结果单纯脑外伤组和单纯骨折组伤后第3天血清IGF-Ⅱ含量升高,1周时为正常组的2倍,2周时为正常组的3倍。骨折合并脑外伤组伤后第3天血清IGF-Ⅱ含量明显升高,为正常组的2倍,1周时可达5倍,2周时可达到7倍。其与单纯骨折组或单纯脑外伤组比较,差别均有统计学意义（P〈0．05）。结论骨折合并脑外伤病人IGF-Ⅱ含量明显升高,提示IGF-Ⅱ可能加速骨折愈合过程。     

合并脑外伤的骨折愈合过程中PDGF的作用

目的 通过研究大鼠股骨干骨折合并脑外伤时骨痂组织内PDGF表达水平的变化,探讨脑外伤对骨折愈合的影响及作用机制. 方法 取12周雄性SD大鼠64只,体重(356 4±25)g,随机分成8组,每组8只.A1、B1、Cl、D1组分别为骨折合并脑外伤1、2、3、4周组,制作脑外伤和股骨干骨折模型;A2、B2、C2、D2组分别为单纯骨折1、2、3、4周组,制作单纯股骨干骨折模型作对照.各组摄CR片后截取骨痂,行HE染色观察骨痂生长情况及其组织形态,免疫组织化学染色测定PDGF表达,原位杂交检测PDGF mRNA表达. 结果 CR片示在同一时间点A1、B1、C1、D1组较A2、B2、C2、D2组骨折端骨痂形成早,骨痂多,骨折愈合快.HE染色示A1组可见较多早期软骨细胞、成纤维细胞,A2组骨折间隙可见成纤维细胞,仅夹杂有少量的早期软骨细胞;B1组骨折端有新生骨小梁长入,B2组未见骨小梁形成;C1组骨折端有大量编织骨形成且骨小粱间有少量成熟软骨细胞,C2组少量骨小梁向骨折端长入;D1组编织骨向板层骨转化,D2组骨折端为不成熟骨小梁.免疫组织化学染色和原位杂交实验均可见成纤维细胞、间充质细胞、血管内皮细胞、早期软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞胞浆出现广泛的强阳性反应,A1、B1、C1、D1组PDGF和PDGF mRNA阳性细胞百分数均高于同一时间点A2、B2、C2、D2组,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 脑外伤对骨折愈合有促进作用,可能与脑外伤后PDGF表达水平升高有关.     

牛骨胶原／牛骨形成蛋白液局部注射治疗骨折延迟愈合9例

目的：观察牛骨胶原／牛骨形成蛋白复合物经皮骨折端注射治疗骨折延迟愈合的效果。方法：在C臂机透视下准确定位骨折端,制造新鲜创伤后,依据骨折部位不同经皮局部注入5－10mL骨胶原／骨形成蛋白液,摄片复查至骨折愈合,结果：8例在2－3个月获得临床骨折愈合,无并发症发生,1例治疗失败,结论：骨折延迟愈合可以应用牛骨胶原／BMP液局部注射治疗,方法简单,易于推广应用。     

克隆并构建人骨形成蛋白2真核表达载体

目的探讨构建人骨形成蛋白2(human bone morphgenetic protein 2,hBMP 2)真核表达载体的方法.方法由人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA,利用RT PCR方法扩增获得hBMP-2基因cDNA,将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM T hBMP-2重组质粒载体,转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒.分别用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3.1( )真核表达载体,将克隆载体中hBMP基因重组到pcDNA3.1( )真核表达载体,提取质粒作酶切电泳、PCR鉴定及DNA测序.结果人骨肉瘤细胞中经RT-PCR得到1.2kbp的hBMP 2扩增条带,重组质粒pGEM T-hBMP 2经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP 2条带和4.0 kbp的载体片断;pcDNA3.1 hBMP-2质粒经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP-2条带和5.0kbp的载体片断,重组质粒酶谱分析与预期一致;DNA序列分析测序结果校对后经BLAST分析,表明核酸序列与Gene Bank中和hBMP-2的mRNA序列完全吻合.结论通过此方法能成功克隆获得hBMP-2基因,并构建其真核表达载体.     

人骨形成蛋白-2和骨保护素在小鼠成肌细胞中的共表达

目的：构建人骨形成蛋白－2（BMP－2）和骨保护素（OPG）的共表达真核载体，研究其在小鼠成肌细胞C2C12中的表达。方法：以人骨肉瘤细胞系MG63的总RNA为模板，RT－PCR法获得人OPG的编码cDNA，克隆入真核表达载体pIRES2－EGFP的多克隆位点，再将入BMP－2的编码区cDNA克隆入pIRES2－EGFP中的BstXⅠ位点，构建BMP－2和OPG的双顺反子真核表达载体pIRES2－EGFP－2－OPG，在阳离子脂质体介导下转染C2C12细胞，Western blot法检测BMP－2和OPG的表达。结果：（1）获得人OPG编码区全长cDNA.。（2）构建人BMP－2和OPG的双顺子反子真核表达载体p IRES2－EGFP－2－OPG。（3）经Western blot检测，pIRES2－EGFP－2－OPG转染C2C12细胞后，细胞可稳定表达BMP－2和OPG。结论：构建了人BMP－2和OPG的共表达真核载体，并可在C2C12细胞中稳定表达，为应用BMP－2和OPG进行骨质疏松等疾病的治疗研究奠定了基础。     

骨形成蛋白2基因修复兔桡骨缺损的实验研究

目的观察携带人骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）基因的腺病毒载体（adenovirus carrying BMP-2 gene，Ad—BMP2），通过纤维蛋白凝胶与牛松质骨支架（bovine cancellous bone，BCB）复合，修复骨缺损的效果。方法将60只新西兰大耳白兔随机分为4组，每组15只。制成双侧桡骨中段1．5cm骨缺损模型，采用4种材料植入修复。A组：Ad-BMP-2＋BCB；B组：重组BMP-2＋BCB；C组：携带D-半乳糖酐酶基因的腺病毒对照载体（adenovirus carrying β—galgene，Ad—Lacz）＋BCB；D组：单纯BCB支架。修复术后各组于4、8和12周各处死动物5只取材，行X线片、组织学、生物力学和免疫组织化学染色检查。结果A、B两组骨缺损均得到了修复，但术后各时间点，A组在成骨活跃程度、新生骨量、力学强度及BMP-2表达等方面均明显优于B组；C、D两组均无新骨形成。结论BMP-2直接基冈治疗，操作简便、骨诱导能力强，是修复节段性骨缺损的有效方法。     

腺病毒介导的人骨形成蛋白2基因治疗的免疫学研究

目的评价机体对腺病毒介导的人骨形成蛋白2(adenovirusmediatedhumanbonemorphogeneticprotein2,Ad-hBMP-2)基因治疗的免疫学反应。方法崇明山羊12只,手术截去右侧胫骨中段2.1cm,制备胫骨干缺损模型,随机分为2组。将Ad-hBMP-2转染的山羊骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs,转染组,n=7)及未转染的MSCs(未转染组,n=5)分别植入骨缺损内。于术后4、8、16及24周摄X线片检查骨缺损愈合情况,并对治疗前后机体对腺病毒的细胞和体液免疫反应进行检测。结果X线片示,转染组4～8周,骨缺损内有连续性骨痂形成;24周,有6侧骨缺损完全愈合,部分骨髓腔再通。未转染组4～8周,骨缺损内骨痂形成较少,与骨端界限清楚;24周,仅2侧骨缺损愈合。淋巴细胞与MSCs混合培养示淋巴细胞刺激指数(stimulationindex,SI)于植入后14d升高,转染组4.213±1.278,未转染组-0.310±0.147,且差异有统计学意义(P<0.05);28d后下降,转染组2.544±0.957,未转染组3.104±0.644,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后14、28、49和120d,转染组的血浆腺病毒中和抗体滴度分别为2.359±0.226、2.297±0.200、2.214±0.215和2.297±0.210,未转染组分别为-0.175±0.335、-0.419±0.171、0±0.171和0.874±0.524,两组各时间点差异均有统计学意义(P<0.05)。结论腺病毒介导的基因治疗可引起机体对腺病毒的细胞及体液免疫反应,从而逐渐消除腺病毒基因和相关蛋白的影响。     

骨形成蛋白2基因修饰的老年大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的研究

目的观察年龄因素对骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)成骨分化能力的影响;了解基因治疗对老年大鼠MSCs成骨分化能力的影响. 方法 1月龄(幼年组)、9月龄(成年组)及24月龄(老年组)雄性Wistar大鼠各6只,取MSCs经体外分离、培养及携带骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)基因的腺病毒载体(Ad-BMP-2)转染后,定量检测BMP-2、碱性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)表达,以及成骨细胞标志性蛋白:Ⅰ型胶原、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨桥素(osteopontin, OPN)的表达.将转染的各组MSCs分别与磷酸三钙(tricalcium phosphate, TCP)复合后植入裸鼠体内,3周后取材,比较各组诱导异位成骨能力. 结果 ELISA检测表明BMP-2基因修饰的MSCs可以有效表达BMP-2,且表达量在各年龄组间差异无统计学意义(P>0.05);各组ALP于诱导后第9天达高峰,但组间差异均无统计学意义(P＞0.05);诱导后第7天,RT-PCR半定量检测示各组均有成骨细胞特征性蛋白,即:Ⅰ型胶原、OPN及BSP的明显表达,表达量在各组间差异无统计学意义(P>0.05);BMP-2基因转染的MSCs与TCP复合后可诱导裸鼠体内异位成骨,各组成骨量差异无统计学意义(P>0.05). 结论 BMP-2基因修饰的老年大鼠MSCs可以恢复成骨分化能力,基因治疗可能为老年性骨骼疾病提供一种新的治疗途径.     

人骨形成蛋白2腺病毒表达载体转染体外培养兔腰椎间盘细胞的研究

目的 研究人骨形成蛋白2腺病毒表达载体（adenovirus-mediated human bone morphogenetic protein 2 gene，Ad-hBMP-2）转染体外培养兔腰椎间盘细胞，分析其对腰椎间盘细胞的影响。方法 成年健康新西兰大白兔4只，体重4～5kg，取L2、L3到L6、L7节段椎间盘细胞体外培养。利用免疫荧光和蛋白印迹法（Western blot）检测空白对照组（未转染）、Ad-LacZ组[感染复数（multiplicity of infection，MOI）150MOI]和不同剂量Ad-hBMP-2（50、100、150MOI）组转染后细胞hBMP-2的表达水平。采用RT-PCR检测转染后细胞Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA表达水平。结果 转染Ad-hBMP-2后通过免疫荧光和蛋白印迹法可见随转染剂量增加hBMP-2表达量逐渐增加，与50MOI组比较100MOI组升高102％，150MOI组升高183％。在转染后第6天RT-PCR结果显示转染组aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的表达高于对照组，并且随转染剂量增高mRNA的表达量均逐渐增加。aggrecan mRNA从50MOI组的61．7％增加到150MOI组的167．3％。Ⅱ型胶原mRNA从50MOI组的77．3％增加到150MOI组的169．0％。结论 Ad-hBMP-2可高效转染体外培养兔腰椎间盘细胞，随转染剂量增加hBMP-2表达量逐渐增加，同时上调aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的表达，并存在剂量依赖关系。     

组织工程骨修复兔颅骨缺损中骨形态发生蛋白的表达

目的 探讨组织工程骨修复骨缺损,内源性骨形态发生蛋白（BMP）在组织工程骨再生过程中的分布及作用,方法 将自体成骨样细胞即刻种植在胶原包埋的聚羟基乙酸（PGA）基质材料上, 然后将该复合体或单纯基质材料移植到兔颅骨的一侧全层骨缺损区,作为实验侧Ⅰ或实验侧Ⅱ。对凤对照,不作任何植入。18只新西兰兔分别于术后3、8及14天处死,标本行组织学及BMP免疫组织化学检查,切片上,确定骨缺损区中央,距骨断端2mm、5mm为A、B、C三区,利用真彩色计算机图像分析系统在各区间测量BMP值。结果 术后3天,实验侧Ⅰ基质间存在BMP阳性细胞,8天时,实验侧Ⅰ新骨形成明显优于实验侧Ⅱ及对照侧。14天时,实验侧Ⅰ可见骨小梁形成,对照侧为纤维组织修复。BMP定量分析中,实验侧（Ⅰ、Ⅱ）三区的BMP值高于对照侧,但实验侧的浓度梯度差值小于对照侧。结论 即刻种植于PGA基质材料上的成骨样细胞在体内可合成和分泌BMP,利用组织工程技术将内源性BMP局限于骨缺损区,提高内源性BMP浓度并改善其分布,可能是组织工程骨诱导骨再生机制之一。     

骨形成蛋白2活性多肽体外定向诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的剂量依赖性研究

目的探讨自行合成的骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP-2)活性多肽对大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)体外定向诱导成骨的能力,评价BMP-2活性多肽的成骨诱导性及诱导成骨的剂量依赖性。方法取4周龄Wistar大鼠分离培养MSCs,传至第3代时改用条件培养基,培养基中分别加入浓度为300、200、100、50及0μg/ml的BMP-2活性多肽,并依次记为A、B、C、D和E组。细胞培养至5、10、15及20d,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,测定钙含量,采用实时荧光定量PCR(fluorescent quantitativePCR,FQ-PCR)检测型胶原、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及骨钙素(osteocalcin,OCN)mRNA的表达,检测不同浓度BMP-2活性多肽体外诱导成骨的能力。结果倒置相差显微镜下观察,用条件培养基培养3～4d后,培养细胞由长梭形转变为短梭形或多角形。随条件培养基中BMP-2活性多肽浓度的增加,细胞发生成骨样改变的时间提前。ALP活性和钙含量检测显示,A组和B组较其他组增加明显,且差异有统计学意义(P<0.05),但A、B组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。FQ-PCR检测发现不同浓度条件培养基培养14d后,型胶原、OPN和OCN mRNA在各组均有表达。Ct值表明其表达量的大小顺序为A、B、C、D组,E组无表达,A组和B组的Ct值明显大于C组和D组,差异有统计学意义(P<0.05),但A组和B组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论BMP-2活性多肽能有效地促进MSCs向成骨方向分化,其诱导作用存在剂量依赖关系,最佳诱导剂量为200μg/ml。     

人骨形态发生蛋白—2真核表达载体的构建

目的 构建人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2）真核表达载体,并观察其在真核细胞内表达的可能性。方法 Sal Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切含有hBMP－2全长cDNA的pUC19,回收1.24kb片段,将其连入真核表达载体pcDNA3,构建重组子pcDNA3-hBMP-2。将重组子转化细菌,扩增后提取质粒,分别用Ecor Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切和Xho Ⅰ单酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定。将重组子转染成纤维细胞,G418筛选形成阳性克隆后继续培养4周行细胞原位杂交和免疫组织化学染色。结果 琼脂糖电泳显示：用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后可形成两条带,大小分别为1.3kb和5.38kb,而Xbo Ⅰ酶切位点消失,符合物理图谱,表明载体构建成功,转染后G418筛选所获阳性克隆,继续培养4周,的位杂交和免疫组织化学染色,结果表明hBMP-1基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。结论 成功构建hBMP-2真核表达载体,该载体可在真核细胞内表达,为将来骨损伤的基因治疗奠定了一定的实验基础。