过氧化物酶增殖物激活受体γ对大鼠肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨过氧化物酶增殖物激活受体γ（PPARγ）对大鼠肝星状细胞（HSC）增殖与凋亡的影响。方法 常规培养大鼠HSC，经系列浓度的PPARγ天然配体（15-d-PGJ2）或合成配体（GW7845）作用后，通过噻唑蓝（MTT）比色法及流式细胞仪观察细胞的增殖和凋亡状态，应用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot探讨PPARy配体诱导凋亡的分子机制，透射电镜观察HSC形态学变化。结果15-d-PGJ2和GW7845可通过抑制细胞增殖同时诱导凋亡而抑制HSC生长，且呈剂量依赖效应（各实验组与对照组比较，P＜0．01）；PPARy活化可显著抑制HSC中bcl-2基因表达（同时在转录和转录后水平），且此抑制作用可被PPARγ特异性拮抗剂GW9662部分或完全逆转，说明此种抑制效应确由PPARγ所介导；电镜观察亦显示明显的细胞凋亡发生。结论PPARγ活化可显著抑制HSC增殖，并通过下调bcl-2基因表达而诱导凋亡，提示PPARγ可作为逆转肝纤维化治疗的新的有效靶点。     

血小板活化因子及受体拮抗剂对肝星状细胞增殖的影响

目的 观察血小板活化因子(PAF)及受体拮抗剂对体外培养的肝星状细胞(HSC)增殖的影响.方法 采用LX-2肝星状细胞系作为活化的HSC的研究模型.采用噻唑蓝比色法检测HSC的增殖.流式细胞PI染色及BrdU掺入法检测HSC的细胞周期.结果 PAF(1×10~(-8)～1×10~(-3)mol/L)各浓度组OD_(492)显著高于对照组(P<0.05);PAF(1×10~(-6))加PAF受体拮抗剂(1×10~(-7)～1×10~(-4)mol/L)组OD_(492)明显少于PAF(1×10~(-6)mol/L)组(P<0.05).PAF组HSC的S%和Prl明显增高.结论 PAF能够剂量依赖性地促进HSC增殖,而PAF受体拮抗剂能够抑制其作用.     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对肝星状细胞增殖的影响

目的 观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）激动剂对肝星状细胞增殖的影响，探讨其抗肝纤维化的可能作用机制。方法 利用胶原酶原位灌注梯密度离心方法分离大鼠肝星状细胞（HSC），利用噻唑蓝（MTT）比色法、流式细胞技术检测曲格列酮、15-脱氧-前列腺素J2（15-d-PGJ2）对HSC增殖及细胞周期的作用。结果 MTT检测表明曲格列酮、15-d—PGJ2在5～100μmoL／L浓度范围内可显著抑制HSC的增殖，与对照组比较P〈0．01；流式细胞检测表明25、50μmoL／L的曲格列酮可显著降低HSCS期细胞数量，降低细胞增殖指数，与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 PPARy激动剂通过影响HSC的增殖而发挥其抗肝纤维化作用。     

干扰素α对实验大鼠肝内纤维组织及肝星状细胞的影响

目的探讨干扰素(IFN)α防治肝纤维化作用机制.方法雄性SD大鼠54只分成A组(正常对照组)6只、B组(模型对照组)12只、C组(IFNα预防组)12只、D组(IFNα治疗组)12只和E组(生理盐水对照组)12只.分别于实验6～12周末处死,取肝组织行病理组织学与电镜下同步观察.结果B组大鼠肝内纤维组织广泛增生,假小叶形成,活化的肝星状细胞(HSC)明显增多,C组和D组肝内纤维组织明显减轻,活化HSC数量减少,凋亡数目明显增多.结论IFNα通过抑制HSC活化并诱导其凋亡防治肝纤维化形成.     

缺氧和营养缺乏对软骨终板干细胞凋亡的影响及相关机制

目的 :观察缺氧和营养缺乏对软骨终板干细胞(cartilage endplate-derived stem cells,CESCs)凋亡的影响,探讨B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19-k Da结合蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3,BNIP3)信号通路在其中的作用。方法 :从临床获取退变椎间盘软骨终板标本,分离培养软骨终板细胞,使用琼脂糖筛选获得CESCs并进行干细胞标志物鉴定,将第三代细胞分别在常氧/完全培养基(对照组)与缺氧和营养缺乏(实验组)条件下培养48h,通过流式细胞术检测细胞凋亡率,CCK-8法检测细胞活性,Western Blot检测BNIP3、Bcl-2关联x蛋白(Bax)、Bcl-2关联k蛋白(Bak)和低氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白表达水平。使用BNIP3小干扰RNA(siRNA)干扰CESCs中BNIP3基因,同时设置阴性干扰对照组(Scramble siRNA),同前分组处理后再次检测细胞凋亡率、细胞活性及BNIP3、Bax、Bak蛋白的表达水平。结果:对5例标本获得的CESCs进行了干细胞标志物鉴定,其中细胞表面粘附分子44(CD44)、CD73、CD90和CD105为阳性,CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR为阴性,提示CESCs具有干细胞特性。实验组细胞凋亡率为(29.12±0.65)%显著高于对照组的(14.87±2.03)%(P0.05);实验组的细胞增殖活性明显降低,为对照组的56.18%(P0.05)。与对照组相比,实验组BNIP3、Bax、Bak蛋白的表达均显著上调(P0.05)。使用BNIP3 siRNA干扰后,缺氧和营养缺乏引起的细胞凋亡增加和细胞增殖活力下降均被明显抑制;同时,缺氧和营养缺乏导致CESCs中BNIP3、Bax和Bak的蛋白表达升高也被显著逆转(P0.05)。结论:缺氧和营养缺乏能够诱导CESCs发生凋亡,此过程可能是通过上调BNIP3、Bax和Bak蛋白表达而发挥作用的。     

胆红素浓度对肝星状细胞活化增殖和凋亡的影响

目的 探讨低浓度胆红素( bilirubin)对活化态肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)增殖、活化、凋亡的影响.方法 从肝脏分离纯化培养HSCs,DCFH-DA法检测不同浓度胆红素对HSCs中活性氧的影响.通过CCK-8比色法检测胆红素对HSCs增殖的影响.Western blot检测HSCsα-肌动蛋白(d-SMA)的表达.流式细胞仪检测胆红素对HSCs凋亡的影响.PCR检测胆红素对HSCs纤维化相关基因表达的影响.结果 分离并培养HSCs,低浓度胆红素浓度(0、1、10、20 mg/L)抑制HSCs中活性氧的产生,明显抑制HSCs的增殖(0.624±0.092,0.536±0.127,0.407±0.033,0.399±0.022,F=13.454,P＜0.05)及α-SMA的表达(339 ±2,336±10,246±7,242±5,3.7±0.3,F=191.107,P＜0.05),促进HSCs的凋亡(2.69±0.07％,2.95±0.10％,4.41±0.22％,4.91±0.86％,F=34.731,P＜0.05),改变HSCs纤维化相关基因的表达,TIMP-1 mRNA/MMP-2 mRNA的比值呈降低趋势(54±2,65±2,47 ±2,44±2,F=73.400,P＜0.05).结论 低浓度胆红素具有抑制HSCs活化增殖,促进凋亡的潜能.胆红素的作用可能与其抗氧化功能有关.     

血小板源生长因子对肝星状细胞增殖与Ⅰ型胶原合成的影响

目的 观察PDGF-BB对HSC细胞增殖以及合成Ⅰ型胶原的作用。方法 大鼠的HSC细胞用不同浓度的PDGF-BB培养处理，收集细胞和培养液上清。细胞增殖用噻唑蓝（MTT）法检测，流式细胞仪检测细胞周期，Ⅰ型胶原蛋白用ELISA法检测，RT—PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果 PDGF-BB在浓度1～10μg/L时呈剂量依赖性地促进HSC细胞增殖，当浓度大于10μg/L其促增殖作用达到饱和。PDGF-BB明显促进细胞的DNA的合成，使细胞大部分处于S期。PDGF-BB能在蛋白和mRNA水平上促进Ⅰ型胶原的合成，并且随着PDGF-BB处理时间地延长其合成量也增加。结论 PDGF-BB除了能促进肝星状细胞的增殖外，也促进Ⅰ型胶原的合成。     

Smad3沉默对IGFBPrP1诱导肝星状细胞分泌细胞外基质作用的影响

目的 明确胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(insulin-like growth factor binding protein related protein1,IGFBPrP1)是否通过Smad3信号通路影响肝星状细胞分泌细胞外基质.方法 (1)化学合成2对针对Smad3基因的siRNAs(siRNA1,siRNA2),转染肝星状细胞株(HSC-T6).采用实时定量PCR和Western blot法筛选抑制效率较高的siRNA用于干扰实验;(2)将肝星状细胞株(HSC-T6)分为4组:阴性对照组、siRNA-Smad3转染组、siRNA-Smad3+IGFBPrP1组和IGFBPrP1组.将筛选的抑制效率较高的siRNA转染HSC-T6细胞株,田Western b1ot检测各组Smad3、纤维连接蛋白及Ⅰ型胶原的表达.结果 (1)siRNA2-Smad3对Smad3的抑制效率较高;(2)与阴性对照组相比,siRNA-Smad3转染组Smad3蛋白的表达显著下降(P＜0.01).与IGFBPrP1组相比,siRNA-Smad3+IGFBPrP1组纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达均显著降低(P＜0.01).结论 IGFBPrP1影响肝星状细胞分泌细胞外基质的机制之一是通过Smad3信号通路来实现的.

Abstract：

Objective To identify the effect of IGFBPrP1 on the secretion of extracellular matrix in hepatic stellate cells through the Smad3 signaling pathway. Methods (1)Two pairs of chemically synthesized siRNAs (siRNA1, siRNA2) targeting Smad3 were transfected into HSC-T6 cells,real-time PCR and Western blot were used to evaluate the silence efficiency, and the better siRNA was used. (2)HSC-T6 cells were divided into four groups: Negative control group, siRNA-Smad3 transfection group, siRNA-Smad3+IGFBPrP1 group and IGFBPrP1 group. The better siRNA was chosen to transfect into HSC-T6 cells. The protein expressions of Smad3, fibronectin and Collagen Ⅰ were evaluated by Western blot. Results (1)siRNA2-Smad3 inhibited Smad3 gene expression stronger than another siRNA. (2)After transfection of siRNA2-Smad3, the protein expression of Smad3 was significantly decreased compared to the negative control group(P＜0.01). The protein expression of fibronectin and Collagen Ⅰ in IGFBPrP1 stimulating HSCs treated with siRNA2-Smad3 were significantly decreased compared to that in IGFBPrP1 stimulating HSC without siRNA2-Smad3 (P ＜0. 01 ).Conclusion IGFBPrP1 induces the secretion of extracellular matrix in hepatic stellate cells through the Smad3 signaling pathway.     

siRNA干扰ADAMTS2基因对肝星状细胞的影响

目的 探讨siRNA干扰大鼠含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶2(ADAMTS2)基因后对大鼠肝星状细胞(HSC)生物学特性的影响及其机制,评估ADAMTS2基因作为一种新的靶向基因在抗肝纤维化治疗中的应用前景.方法 设计并化学合成3对针对大鼠ADAMTS2 mRNA 2237、2597及690位点的siRNAs.用筛选出的抑制效率最高的siRNA体外转染HSC-T6,应用实时PCR、Westem blot及MTT等方法研究沉默ADAMTS2基因对大鼠HSC活化、增殖等生物学特性及对基因ADAMTS2、α-SMA、COL1α1、COL(I)、TGF-β1、MMP-2和TIMP-3表达的影响.结果 在相同注射剂量(50 nmol/L)及时间(48 h)下,2237位点的siRNA-ADAMTS2具有最高的抑制效率;能显著抑制ADAMTS2基因mRNA和蛋白表达(抑制率80％以上);显著抑制COL(I)、α-SMA和TGF-β1在HSC中的表达.HSC的增殖能力显著降低.结论 化学合成的siRNA-ADAMTS2干扰载体能有效抑制ADAMTS2基因在大鼠HSC-T6细胞系中的表达,抑制HSC的活化和增殖,同时显著降低COL(I)、α-SMA和TGF-β1的表达,具有潜在的阻止甚至逆转肝纤维化的作用.ADAMTS2可能是抗肝纤维化治疗的有效靶位,抑制ADAMTS2在肝脏的表达可能是一种有效的抗肝纤维化治疗策略.     

芪蓝方对人前列腺癌DU145细胞增殖和凋亡的作用机制研究

目的:观察芪蓝方对人前列腺癌DU145细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:以DU145细胞为研究对象,通过观察不同浓度芪蓝方组(400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0μg/ml)细胞形态变化,筛选出高、中、低浓度应用于后续实验,并采用CCK-8法检测DU145细胞增殖,流式细胞术检测DU145细胞周期、凋亡情况,Western印迹检测DU145细胞中细胞周期、凋亡相关蛋白Cyclin D1、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase 3的表达。结果:筛选结果显示100、200、400μg/ml浓度的芪蓝方均能显著抑制DU145细胞的生长、降低轮廓清晰度和贴壁能力,且200、400μg/ml浓度的芪蓝方可显著降低DU145细胞活力,故确定高中低浓度为400、200、100μg/ml,并用于后续实验研究。与空白组比较,G2期各浓度组DU145细胞数显著增加(P<0.01),而S期高、中浓度组细胞数显著下降(P<0.01、P<0.05);与空白对照组相比,芪蓝方各组DU145细胞总凋亡数均显著增高(P<0.0...     

肝星状细胞在肝脏疾病中的作用

肝星状细胞（HSC）是肝脏内重要的非实质细胞之一,可分泌、释放多种胶原纤维和细胞骨架蛋白参与肝脏疾病的病理生理过程。正常状态下,HSC通过调节细胞外基质蛋白的合成和降解维持肝脏正常的组织结构;肝脏损伤时,HSC被激活,活化的HSC导致细胞外基质的增加是肝纤维化形成并最终导致肝硬化、肝衰竭的主要原因。因此,深入研究HSC在肝脏疾病发生与发展中的作用和机制,并研究与HSC相关的治疗策略,对于提高患者生存率具有一定意义。     

肝细胞生长因子在肝星状细胞调控卵圆细胞凋亡中的作用

目的 探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)调控卵圆细胞凋亡中的作用.方法 将健康雄性SD大鼠随机分为实验组、条件对照组和假手术组.三组大鼠均接受2-AAF灌胃,实验组和条件对照组进行2/3肝切除,而假手术组仅进行开关腹.于术后第0、1、3、6、9、12和15天提取HSCs,收集该细胞的条件培养液,将HGF受体抑制剂PHA665752(5 μmol/L)加入条件对照组的条件培养液中,用各时间点的条件培养液作用于LE6卵圆细胞系24 h,经PI/Annexin-Ⅴ染色后采用流式细胞术检测LE6细胞的凋亡情况.提取第9天条件培养液处理后的LE6细胞蛋白,采用Western Blotting检测Bim和cleaved-Casepase 3蛋白的表达.结果 经第6、9、12天条件培养液处理后,实验组LE6细胞的凋亡率显著低于假手术组和条件对照组(P＜0.05),其中第9天差异最显著,而且第9天实验组的Bim和cleaved-Casepase 3蛋白的表达量均低于假手术组和条件对照组(P＜0.05).结论 HGF可能通过降低Bim蛋白表达和抑制Caspase 3活性参与HSCs对卵圆细胞凋亡的负调控.     

Liver cirrhosis and hepatic stellate cells

The cirrhosis represents the final stage of several chronic hepatic diseases and it is characterized by the presence of fibrosis and morphologic conversion from the normal hepatic architecture into structurally abnormal nodules. In the evolution of the disease there is loss of the normal vascular relationship and portal hypertension. There are also regenerative hepatocellular alterations that become more prominent with the progression of the disease. The liver transplantation continues to be the only therapeutic option in cases of disease in terminal phase. The hepatic stellate cells (HSC) are perisinusoidal cells that store vitamin A and produce growth factors, citocins, prostaglandins and other bioactive substances. They can suffer an activation process that convert them to cells with a phenotype similar to myofibroblasts. When activated, they present increased capacity of proliferation, mobility, contractility and synthesis of collagen and other components of extracellular matrix. They possess cytoplasmic processes adhered to sinusoids and can affect the sinusoidal blood flow. HSC are important in pathogenesis of fibrosis and portal hypertension.     

肝星状细胞中蛋白激酶C活性改变对其表达血小板源生长因子及增殖的影响

目的观察蛋白激酶C（PKC）活性改变对肝星状细胞（HSC）表达血小板源生长因子（PDGF）的影响及对HSC增殖和激活的作用。方法将肝星状细胞系rHSC-99随机分为3组：对照组（A组）；PKC激动剂PMA0．5μmol／L组（B组）；PKC抑制剂Calphostin C100nmol／L组（C组）。加药后0、3、6、12、24h分别检测各组细胞PKC活性的变化；作用24h后，采用Westernblot方法检测各组细胞PDGF和胞外信号调节激酶（ERK）的表达；采用免疫荧光化学方法检测各组细胞α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）的表达；采用MTT法检测细胞的增殖情况。结果PMA作用后PKC的活性显著增强，而Calphostin C则抑制PKC的活性。PKC活性增强后，与对照组比较HSC的PDGF表达升高了1．4倍（P〈0．01），ERK表达升高了1．2倍（P〈0．05）；n—SMA的表达升高了1．3倍（P〈0．01），并促进HSC的增殖；PKC活性抑制后则能抑制以上的作用。结论PKC活性的改变能调控HSC中PDGF的表达，在HSC的增殖和激活中发挥调节作用。     

结缔组织生长因子对Kupffer细胞诱导的肝星状细胞激活的影响

目的 探讨肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达对Kupffer细胞(Kc)诱导的HSC激活的影响.方法 构建含CTGF的RNA干扰载体.将肝星状细胞系rHSC-99分为3组:对照组、空载体组和RNA干扰组.采用RT-PCR方法 检测HSC的CTGF表达.分离培养KC,建立各组HSC与KC的共培养体系,MTT检测HSC的增殖情况;RT-PCR检测HSC的TGF-β1、I型前胶原的表达;Western Blot检测HSC的TGF-β1表达,ELISA检测共培养上清中I型胶原的表达;免疫荧光化学检测HSC的α-SMA的表达. 结果 构建CTGF的RNA干扰载体Psilencer 3.1H1-Neo-CTGF.RNA干扰后CTGF表达降低22%.KC得率为5×107,活率＞98%.在HSC和KC共培养体系中,RNA干扰HSC的CTGF表达后,与KC共培养的HSC活化和增殖明显被抑制,与对照组相比,HSC的增殖降低29%(t:20.17,P＜0.01).Ⅰ型前胶原和α-SMA的表达下降38%,细胞培养上清中Ⅰ型胶原的分泌量下降48%(t=12.18,t=7.81,t=15.96,均P＜0.05).TGF-β表达则没有明显的变化.结论 阻断HSC的CTGF表达能抑制由KC诱导的HSC激活.     

肝星状细胞对同种异体胰岛移植物的保护作用

目的 研究小鼠肝星状细胞对同种异体胰岛移植物的保护作用.方法 将糖尿病小鼠随机分为三组,分别为糖尿病组、单纯胰岛移植组及与肝星状细胞共同移植组.单纯移植组于肾被膜下移植入同种异体胰岛300个;共同移植组移植入肝星状细胞(3×105个)与同种异体胰岛(300个)混合物.分别于移植术后监测受体小鼠血糖值及正常血糖维持时间;血糖正常一周后移植组及糖尿病组小鼠分别采血检测血清中TGF-β,TNF-α,IL-1β,IFN-γ的含量,同时取出移植物进行免疫组织化学检测.结果 术后共同移植组受体正常血糖维持时间为(23.75±8.96)d,单纯胰岛移植组受体正常血糖维持时间为(11.9±6.92)d,差异有统计学意义(P<0.05);三组受体血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量差异无统计学意义(P>0.05),共同移植组受体血清中TGF-β含量为(2292.31±5.87)pg/ml,单纯移植组为(1246.55±38.91)pg/ml,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);病理学结果显示共同移植组胰岛素表达量大,并且在移植物周围有生物包膜形成.结论 在同种异体移植模型中,肝星状细胞可能通过高分泌TGF-β、局部形成包囊等方式保护胰岛移植物并延长其存活时间.     

小RNA干扰DDR2基因表达对肝星状细胞的影响

目的 探讨siRNA干扰大鼠盘状结构域受体2(discoidin domain receptor2,DDB2)基因对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的影响,评估DDR2在肝纤维化发生中的作用.方法 (1)化学合成3对针对DDR2基因的siRNAs,转染肝星状细胞株(HSC-T6),筛选抑制效率最高的siRNA用于干扰实验;(2)将肝星状细胞株HSC-T6分为3组:正常组(normal,N组)、阴性对照组(negative control,NC组)和干扰组(siRNA-DDR2,SI组).将筛选的抑制效率最高的siRNA以脂质体法转染HSC-T6细胞株,以RT-PCR检测其DDR2,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和I型胶原(collagen-Ⅰ)的mRNA表达,Western blot检测DDR2蛋白表达变化;同时四唑盐(MTT)法检测细胞增殖情况.结果 (1)868位点的siRNA抑制效率最高;(2)与正常组相比,siRNA-DDR2转染组DDR2和α-SMA的mRNA表达均显著下降(分别t=6.43,t=7.34,均P<0.01),DDR2蛋白的表达亦显著降低(t=4.49,P<0.01),同时HSC的增殖能力也显著降低(t=18.32,P<0.01);相反,阴性对照组与正常组相比,DDR2、α-SMA的mRNA表达以及DDR2蛋白和HSC的增殖能力则无明显改变.结论 siRNA-DDR2能显著抑制HSC的活化与增殖,进而抑制纤维化发生,具有潜在的抗纤维化作用.     

白藜芦醇调节肝星状细胞活性的实验研究

目的 探讨白藜芦醇（resveratrol,Res）对活化态肝星状细胞（HSCs）增殖、活化的影响及其机制。方法 从肝脏分离纯化培养HSCs,DCFH-DA法检测不同浓度Res对HSCs中活性氧的影响,CCK-8比色法检测Res对HSCs增殖的影响,Western blotting检测HSCsα-肌动蛋白（α-SMA）的表达,PCR检测Res对HSCs活性相关基因表达的影响。结果 Res抑制HSCs中活性氧的产生,明显抑制HSCs的活化与增殖（P＜0.05）,改变了HSCs活性相关基因（大鼠生肌调节因子MyoD、胶原蛋白Ⅲ及胶原蛋白I）的表达（P＜0.05）。结论 Res能够抑制HSCs的活化增殖,Res对HSCs的作用可能与抗氧化及抑制MyoD的表达有关。