雄激素对大鼠胎颅盖骨成骨细胞雌激素受体基因表达的影响

目的 通过研究雄激素（十一酸睾酮）对成骨细胞雌激素受体基因表达的影响，探讨雄激素对成骨细胞增殖和分化的调控机制。方法 通过对体外培养的胎鼠颅盖骨成骨细胞实施含10^-10mol／L、10^-9mol／L、10^-8mol／L三种浓度雄激素的培养液干预，采用RT-PCR的方法半定量观察成骨细胞中雌激素受体基因mRNA表达的变化，用以分析雄激素对成骨细胞中雌激素受体的影响，并进而探讨雄激素对成骨细胞的影响。结果 实验选用的各浓度组均未出现细胞毒性反应，雄激素干预使成骨细胞中雌激素受体alpha基因表达上调，而雌激素受体beta基因表达轻微下调。结论 雄激素可以特异性地在转录水平调节成骨细胞中雌激素受体基因的表达。     

Bcl-2过表达对TNF-α诱导大鼠成骨细胞凋亡的影响

目的 探讨凋亡相关基因Bcl-2过表达对TNF-α诱导大鼠成骨细胞凋亡的影响及相关机制。方法将含有Bcl-2cDNA的逆转录病毒表达载体pDOR-SB质粒转染原代培养的大鼠成骨细胞并且进行阳性克隆筛选。用30 ng/ml TNF-α刺激转染组和对照组细胞24 h,流式细胞术、透射电镜检测细胞凋亡,应用免疫组化结合计算机图像分析技术检测转染组和对照组细胞Bcl-2蛋白及TNF-α刺激前后Caspase-3蛋白表达。结果 Bcl-2蛋白表达在转染加压筛选组显著高于对照组(P<0.05)。TNF-α刺激后转染组细胞亚二倍体凋亡峰比例为6.6％,对照组为16.1％。TNF-α刺激后转染组细胞.超微结构大多正常,对照组细胞出现明显凋亡征象。TNF-α刺激后两组细胞 Ciaspase-3蛋白表达均升高;TNF-α刺激前Caspase-3蛋白表达转染组与对照组比较差异无显著性(P>0.05),TNF-α刺激后Cas-pase-3表达对照组较转染组显著高(P<0.05)。结论 Bcl-2过表达对TNF-α诱导的成骨细胞凋亡有抵抗作用,Bcl-2过表达的抗凋亡作用可能部分通过抑制TNF-α刺激引起的Caspase-3蛋白表达升高实现,有望作为抑制成骨细胞凋亡的侯选基因。     

地塞米松通过线粒体途径诱导成骨细胞凋亡的研究

目的观察地塞米松对离体成骨细胞凋亡的影响,探讨地塞米松对成骨细胞凋亡的分子作用机制。方法采用不同浓度地塞米松(10~(-8)、10~(-6)、10~(-4)mol/L)干预SD大鼠离体成骨细胞,DAPI染色观察细胞核形态,透射电镜观察细胞核及线粒体形态,流式细胞术检测细胞凋亡率,JC-1荧光探针检测线粒体跨膜电位。结果 10~(-8)、10~(-6)、10~(-4)mol/L地塞米松干预24 h后,DAPI染色发现,10~(-8)mol/L地塞米松组的成骨细胞很少发生凋亡,10~(-6)mol/L和10~(-4)mol/L地塞米松组的成骨细胞凋亡明显,地塞米松的浓度越高,核固缩、核裂解等凋亡现象越明显;透射电镜观察发现,随着地塞米松浓度增加,细胞核固缩明显,线粒体肿胀、空泡样变化现象增多;成骨细胞的凋亡率随着地塞米松浓度的增加而逐渐增高,与空白对照组相比,10~(-8)mol/L地塞米松组细胞凋亡率无明显升高(P0.05),10~(-6) mol/L和10~(-4)mol/L地塞米松组的成骨细胞凋亡率分别较空白对照组增加7.240%和31.173%(P0.05);随着地塞米松浓度的增加,线粒体膜电位逐渐减低,与空白对照组相比较,10~(-8)mol/L地塞米松组细胞膜电位下降不明显(P0.05),10~(-6) mol/L和10~(-4)mol/L地塞米松组膜电位下降分别较空白对照组降低6.814%和17.846%(P0.05)。结论地塞米松通过激活线粒体途径诱导成骨细胞凋亡,存在浓度依赖性。     

常温下缺血预处理对肝细胞凋亡调节基因表达影响的实验研究

目的 探讨常温下大鼠肝脏缺血预处理对细胞凋亡调节基因C-jun和Bcl-X_L的表达及其对肝细胞的保护作用。方法 将30只Wistar大鼠随机分成假手术组(S组,10只)、缺血再灌注组(IR组,10只)、缺血预处理组(IP组,10只)。S组在游离肝蒂后、IR组和IP组在再灌30 min后0、1、3、6、20 h点采集肝组织标本切片行肝细胞凋亡,C-jun和BcI-X_L基因表达及形态学改变等检测。各组均在3、6、20 h点采集血标本检测肝损害标记酶(ALT、AST、LDH)。结果 ALT、AST及LDH值各时间点IR组和IP组均明显高于S组(P<0.01),IP组明显低于IR组(P<0.01)。IR组和IP组与S组比较,细胞凋亡指数(AI)有显著性增加(P<0.01),IP组与IR组比较,AI明显减少(P<0.01)。C-jun基因在S组和IP组各时间点表达不明显;在IR组表达明显,3h点达高峰,并持续至6h点。Bcl-X_L基因在S组、IR组各时间点表达不明显,在IP组3、6、20h点表达明显(P<0.05或P<0.01)。形态学研究显示,IR组有肝组织大片坏死及不可逆超微结构损害;IP组未见明显肝细胞坏死,且超微结构损害为可逆性。结论 ①缺血预处理通过调节肝细胞凋亡调节基因C-jun和Bcl-X_L的表达,发挥其对大鼠常温下肝脏缺血再灌注损伤的保护作用;②IR损伤可能通过激活凋亡诱导基因C-jun表达而促发大鼠肝细胞的过度凋亡;③IP可能通     

酒精诱导体外培养成骨细胞凋亡及Bcl-2、Bax mRNA表达的实验研究

目的 观察酒精对体外培养成骨细胞凋亡的影响及凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA表达变化.方法 体外分离培养成骨细胞,随机分组进行不同浓度酒精干预,利用AO/EB染色观察细胞凋亡形态学改变、DNA Ladder检测凋亡细胞DNA片段形成等定性方法证实凋亡发生.流式细胞技术定量测定细胞凋亡率.RT-PCR检测细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA表达.结果 不同浓度酒精干预后,成骨细胞发生皱缩,AO/EB染色出现凋亡细胞,随酒精浓度增加形成规则的DNA Ladder梯状条带,100mM浓度时最明显.流式细胞仪分析,与对照组(3.42%±1.07%)相比,100 mM酒精干预48h后细胞凋亡率增加,为11.94%±1.14%,差异有统计学意义(P<0.05).与对照组比较,成骨细胞经100 mM酒精干预培养24 h后,Bcl-2 mRNA表达强度降低66%,Bax mRNA表达强度增高11%,Bcl-2/Bax比值下降69%,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 酒精引起体外培养成骨细胞凋亡,是酒精性骨损害的发生机制之一.凋亡相关基因Bcl-2 mRNA表达下调和Bax mRNA表达上调与酒精引起成骨细胞凋亡有关.     

转化生长因子β对大鼠成骨细胞雌激素受体表达的影响

目的探讨转化生长因子β对大鼠成骨细胞雌激素受体表达的影响。方法实验中取雌性SD大鼠4肢松质骨,应用胶原酶消化法得到大量纯净成骨细胞;进行形态学观察,检测不同培养时间的细胞培养液的上清液中成骨细胞特征性分泌物:碱性磷酸酶(AKP)和骨钙素(OCN)的含量;碱性磷酸酶(ALP)染色(改良Gomori氏钙钴法);通过免疫组化法(SP法)进行雌激素受体染色;用不同浓度的TGFβ作用于体外培养的成骨细胞,进行SDSPAGE电泳和Westernblot检测雌激素受体。结果成骨细胞上清液AKP和OCN的分泌量明显高于成纤维细胞(P<0.01),形态学观察符合成骨细胞的特征。经免疫组化染色大鼠的成骨细胞存在雌激素受体,且位于胞核内。Westernblot结果显示,雌激素受体在TGFβ浓度为0.1～0.5ngml时,有较强的荧光发光信号条带。结论TGFβ在浓度为0.1～0.5ngml时,能提高成骨细胞雌激素受体基因表达水平,这可为研究TGFβ对于成骨细胞雌激素受体的作用机制及骨代谢疾病药物筛选提供新的支持。     

股骨假体近端应力遮挡对成骨细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨股骨假体近端不同强度的应力遮挡对成骨细胞增殖和凋亡的影响。方法根据股骨近端应变的有限元分析结果,在体外分组模拟应力遮挡的细胞力学环境,A组应变保持不变（对照组）、B～E组应力遮挡分别为25%、50%、75%和100%,观察不同强度的应力遮挡环境对成骨细胞相对活性、增殖指数和凋亡百分比的影响。结果C、D和E组成骨细胞的相对活性明显降低,分别为0.72±0.09、0.68±0.11和0.76±0.15,与对照组（0.92±0.13）相比差异有显著性（P〈0.05）;D组和E组成骨细胞增殖指数降低至47.87±6.58和51.65±7.71,与对照组（64.31±7.92）相比差异有显著性（P〈0.05）;C组和D组成骨细胞凋亡的百分比与对照组（7.36±0.59）相比差异有显著性（P〈0.05）,分别增高至18.76±2.82和16.78±1.69。B组成骨细胞的相对活性、增殖指数和凋亡百分比与对照组相比差异无显著性（P〉0.05）。结论股骨假体近端的应力遮挡能抑制成骨细胞增殖并（或）刺激其凋亡,两者皆存在“阈值”现象而缺乏强度依赖性。应力遮挡下凋亡的启动较增殖的抑制更为敏感。     

复方仙贞汤抑制成骨细胞凋亡的实验研究

目的 观察不同浓度的复方仙贞汤对TNF-α诱导的成骨细胞凋亡的影响。方法 TNF-α培养液诱导体外培养成骨细胞凋亡后，分别加入不同浓度的复方仙贞汤，用流式细胞仪检测其对成骨细胞的凋亡率。结果 复方仙贞汤1μg／ml组和500μg/ml组细胞凋亡率明显降低，与模型组和空白对照组相比，差异非常显著，其中1μg/ml组作用更强。500μg／ml可能是通过影响成骨细胞周期中的G0-G1和S期而达到抑制凋亡作用的，而1μg／ml组还能增加G2-M期成骨细胞。结论 复方仙贞汤能抑制TNF—α诱导的成骨细胞凋亡，以低浓度(1μg／ml)抑制作用较好。     

PDGF-BB对成年雌性大鼠成骨细胞雌激素受体α蛋白质表达影响的实验研究

目的通过研究PDGF—BB与ERα的关系，探讨PDGF—BB在骨代谢中的作用机理，并对其在骨质疏松症中的应用前景进行展望。方法①利用酶消化法分离培养成年雌性大鼠的成骨细胞；②对培养的成骨细胞及其雌激素受体α进行鉴定；③分别加入浓度为0ng／ml、0．1ng／ml、1ng／ml、10ng／ml的PDGF—BB，共同培养7d，并设阳性对照组和阴性对照组；④Western blotting化学发光法检测ER蛋白质，GIS-2010凝胶图象处理系统分析结果。结果①培养的细胞为成骨细胞，免疫组化显示ERα位于胞核；②SDS-PAGE电泳显示在66kD处有清晰的蛋白条带；③Western blot显示10ng／ml组、1ng／ml组、0．1ng／ml组ER。蛋白条带较0ng／ml组清晰，且10ng／ml组最明显。结论PDGF—BB具有促进成骨细胞雌激素受体α蛋白表达的作用，雌激素受体α蛋白含量随着PDGF—BB浓度的增加而呈增加的趋势。     

雌激素受体β1上调p53基因表达促进乳腺癌细胞的凋亡

目的观察外源性雌激素受体β1(estrogen receptor β1,ERβ1)基因转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后对p53基因表达和细胞凋亡的影响,探讨ERβ1在乳腺癌中的生物学作用。方法应用脂质体法将ERβ1真核表达质粒转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞中,分别用荧光实时定量PCR法、Western blot法检测转染前、后细胞中ERβ1与p53 mRNA和蛋白表达的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞生长曲线显示转染前、后细胞增殖能力的改变。结果转染外源性ERβ1真核表达质粒后,MDA-MB-231细胞中ERβ1及p53 mRNA和蛋白表达明显增强(P0.01);细胞凋亡率明显增加(P0.01),增殖能力明显减弱(P0.01)。结论在乳腺癌中,ERβ1可以通过上调p53基因表达促进乳腺癌细胞凋亡,从而抑制乳腺癌细胞的增殖。     

地塞米松对不同月龄雌性大鼠成骨细胞雌激素受体表达的影响

目的观察体外培养的不同月龄雌性大鼠成骨细胞内雌激素受体水平的差异及地塞米松（1×10^-8mol/L）对不同月龄雌性大鼠成骨细胞雌激素受体表达的影响。方法采用酶消化法分别提取、纯化和培养新生（24h以内）、2、4、8、12月龄雌性Wistar大鼠成骨细胞,并且用Western-blot、ECL法检测体外培养成骨细胞雌激素受体的水平。结果提取的大鼠成骨细胞生长情况良好,碱性磷酸酶染色阳性,具有成骨细胞特性。Western-blot结果显示：雌性大鼠成骨细胞内雌激素受体水平在新生鼠和8月龄鼠较高,在2、4、12月龄鼠较低;地塞米松组成骨细胞雌激素受体表达水平在新生和2月龄低于对照组,在4、8、12月龄高于对照组。结论不同月龄雌性大鼠体外培养的成骨细胞雌激素受体的表达水平不同;1×10^-8mol/L地塞米松对体外培养的雌性大鼠成骨细胞雌激素受体水平有影响且与大鼠的月龄有关。     

二磷酸盐和骨碎补总黄酮对诱导后成骨细胞影响的实验研究

目的探索二磷酸盐和骨碎补总黄酮联合作用如何在分子水平发挥作用于成骨细胞,揭示其效果如何。方法使用诱导方法作用于骨髓基质干细胞,使之转化为成骨细胞;用RT-PCR检验成骨细胞;不同浓度的二磷酸盐或骨碎补总黄酮配制成条件培养基,作用于成骨细胞,并分析生长曲线,分析细胞基因碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ALP）和胶原酶Ⅰ（collagenase colⅠ）表达情况。结果骨髓基质细胞经过4周诱导可转化为表达colⅠ和ALP的成骨细胞,经过生长曲线分析,二磷酸盐和骨碎补总黄酮10^-4^-10-6mmol·L^-1时,对诱导后的成骨细胞有抑制作用;10^-8mmol·L^-1有促进作用;10^-10-10^-12mmol·L^-1不明显,其中10^-8mmol·L^-1作用最强;基因分析后,发现二磷酸盐和骨碎补总黄酮促进成骨细胞表达colⅠ和ALP,且两者合用效果大于单独用药。结论二磷酸盐和骨碎补总黄酮合用均可促进成骨细胞基因表达,且两者合用效果大于单独用药。     

巴戟天多糖含药血清对体外培养成骨细胞凋亡的保护作用观察

目的:通过体外培养成骨细胞(osteoblast,OB),观察巴戟天多糖对细胞凋亡的保护作用,探讨巴戟天促进成骨细胞活性的机制.方法:取巴戟天多糖和巴戟天水提液制备含药血清,用含药血清进行细胞培养.取24 h内新生SD大鼠头盖骨成骨细胞,取2代培养的成骨细胞,分为对照组(培养过程中仅加入大鼠血清)、诱导凋亡组(对照组中加入全反式维甲酸)、巴戟天水提物组(诱导凋亡组中加入巴戟天水提物药物血清)、巴戟天多糖组(诱导凋亡组中加入巴戟天多糖药物血清),通过荧光显微镜观察,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR检测Bcl-2/Bax基因表达,对巴戟天多糖在细胞凋亡过程中的作用进行评价.结果:诱导凋亡组12 h诱导的OB出现凋亡,细胞核或细胞质内可见致密的黄绿染色,染色质形成明亮的凝聚块,24 h单个凋亡细胞与周围的细胞分离,细胞皱缩呈圆形或卵圆形,细胞变小,胞浆致密,细胞器相互靠近,染色质浓缩,形成不同形状和大小的块状.巴戟天水提物组、巴戟天多糖组凋亡率显著低于诱导凋亡组(P＜0.01),且巴戟天多糖组低于巴戟天水提物组(P＜0.05).凋亡细胞Bcl-2 mRNA表达水平:对照组＞巴戟天多糖组＞巴戟天水提物组＞诱导凋亡组.Bax mRNA表达水平:诱导凋亡组＞巴戟天水提物组＞对照组＞巴戟天多糖组(P＜0.01).Bcl-2/Bax:对照组＞巴戟天多糖组＞巴戟天水提物组＞诱导凋亡组(P＜0.01).结论:巴戟天在一定程度上可抑制全反式维甲酸诱导的成骨细胞凋亡,且巴戟天多糖的这种作用显著优于巴戟天水提物,说明巴戟天多糖是巴戟天抑制成骨细胞凋亡的主要成分之一.     

化疗药物诱导胰腺癌细胞凋亡过程中p53和bcl—2基因表达量？…

目的 本文通过观察化疗药物话导胰腺癌细胞凋亡过程中,Ｐ５３和ＢＣＬ－２基因表达量的变化,探讨化疗药物诱导胰腺癌细胞发生凋亡过程与相关基因表达的关系。方法 采用斑点杂交及激光密度扫描技术对化疗药物配伍;５－氟尿嘧喧（５－ＦＵ）、丝裂霉素（ＭＭＣ）和表柔比星（Ｅ－ＡＤＭ）诱导胰腺癌细胞株细胞发生凋亡过程中Ｐ５３和ＢＣＬ－２基因表达量的变化进行了检测分析。结果 化疗药物诱导胰腺癌细胞株细胞发生凋亡过程中     

组织间植入125I粒子诱导H22肝肿瘤细胞凋亡的研究

目的观察^125I粒子近距离照射对H22肝癌细胞凋亡的影响及其机制。方法用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法（TUNEL）检测^125I粒子近距离照射对H22细胞凋亡的影响；免疫组化Elivion^TM plus法检测Survivin蛋白的表达。60只小鼠分为A组：植入放射性粒子；B组：植入化疗药DDP；C组：植入放射性粒子和化疗药DDP；D组：正常对照组。结果^125I粒子近距离照射和／或化疗后对H22肝癌肿瘤体积抑制率A、B、C组分别为43．8％、40．7％和58．3％；凋亡指数（AI）分别为（25．15±10．36）、（33．42±12．25）和（42．34±13．95），与对照组D组（20．45±14．54）比较，C组其凋亡指数（AI）差异有统计学意义（P〈0．05）；Survivin蛋白的表达率分别为50．0％、55．6％和36．4％，与D组100．0％比较，C组表达率差异有统计学意义（P〈0．05）。结论^125I粒子近距离照射H22肝癌可有效诱导肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞增殖；联合化疗药，其凋亡作用更强；Survivin可能参与了其中的调节作用。     

凋亡相关基因在骨肉瘤细胞中的表达及其临床意义

目的 探讨凋亡相关基因在骨肉瘤细胞中的表达及其临床意义.方法 采用3个公认的骨肉瘤细胞株及1个成骨细胞株,提取总RNA,合成生物素标记的cRNA与Affymetrix(R)GeneChip(R) U133A芯片杂交,筛选差异表达的凋亡相关基因.利用MATLAB软件进行细胞凋亡通路的KEGG分析.结果 以表达差异≥2.0倍为限,在Affymetrix(R)HG-U133A芯片包含的所有基因中,3个骨肉瘤细胞株与成骨细胞株比较,一共筛选出7个差异表达的凋亡相关基因:3个上调基因(IKBKB、IL1R1和FAS),4个下调基因(TP53、PPP3CB、PPP3CC和APAF1).利用MATLAB软件将7个差异表达的凋亡相关基因映射到KEGG的凋亡通路上.结论 骨肉瘤足细胞增殖和细胞凋亡间平衡失调的结果,通过调控细胞凋亡相关基因的表达可以诱导肿瘤细胞凋亡,达到抗肿瘤目的 .     

持续性甲状旁腺素抑制成骨细胞分化 的实验研究

目的探讨持续性给与甲状旁腺素(PTH)对成骨细胞分化过程的抑制作用。方法培养MC3T3-E1成骨前体细胞,持续性给与PTH处理,碱性磷酸酶(ALP)染色方法,检测细胞内ALP的分泌;免疫荧光方法检测细胞内Osterix(Osx)蛋白的表达;real-time RT-PCT法和Westernblot方法检测细胞内成骨因子基因和蛋白的表达。结果 MC3T3-E1成骨前体细胞具有自发向成骨细胞方向分化的特征,与对照组相比,经PTH持续性处理的细胞ALP染色强度明显降低,Osx免疫荧光强度较弱,细胞内成骨因子基因和蛋白的表达亦显著低于对照组。结论持续性给与PTH具有抑制成骨细胞分化的作用。     

蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛与c-myc、c-fos、c-jun表达的关系

目的 通过采用兔基底动脉穿刺建立的蛛网膜下腔出血（SAH）模型，系统研究蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛发生（CVS）的情况，脑血管痉挛的病理损害。方法应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学的方法分别检测受累动脉c-myc、c-fos、c-jun mRNA及c-myc、c-fos，c-jun蛋白表达情况。结果 SAH后CVS发生过程中，在8h后相继出现c-myc、c-fos、c-jun mRNA的明显表达，c-myc、c-fos、c-jun的蛋白表达落后于基因表达，免疫组织化学显示c-myc、c-fos、c-jun主要表达在血管内皮细胞及平滑肌细胞。基因与蛋白表达均具有明显的时间依赖性，并与病理损害程度相平行。结论 揭示SAH后CVS的发生可能与细胞凋亡的发生有关，为防治SAH后CVS提供了一个研究方向。     

雌激素对大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变影响的实验研究

了解雌激素对大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变及其Ｋ－ｒａｓ基因突变的影响。方法雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠单次腹腔注射重氮乙酰丝氨酸（ａｚａｓｅｒｉｎｅ）３０ｍｇ／ｋｇ体重,部分大鼠２个月后开始每２周内肌肉注射成酸雌二醇０．１８ｍｇ／１００ｇ体重,４个月后实验结束常规取胰腺组织行光镜和电镜检查,并应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法检测Ｋ－ｒａｓ基因突变情况。结果单纯给予Ａｚａｓｅｒｉｎｅ的大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变（ＡＡＣＮ）发生率１００％,Ｋ－ｒａｓ基因突变率４２．１％;经雌激素处理后,ＡＡＣＮ发生率９２．４％,Ｋ－ｒａｓ基因突变率２５．６％。结论Ａｚａｓｅｒｉｎｅ可成功诱导大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变,Ｋ－ｒａｓ基因突变在此过程中属早期事件。雌激素在一定程度上可抑制该癌癌前病变的发生发展。