大鼠肝卵圆细胞的体外分离、培养及脾内移植

我们在成功建立和优化大鼠肝卵圆细胞增殖模型的基础上[1,2 ] ,在体外对大鼠肝卵圆细胞进行分离与培养 ,并将其移植入同种异体大鼠脾脏内 ,观察其在脾内的演变结果 ,为肝干细胞移植的临床应用提供实验依据。一、材料与方法1.大鼠肝卵圆细胞分离 :采用本室建立和改进的体外两步灌流法分离大鼠肝实质细胞和非实质细胞[3 ] ;所获细胞先用 5 0g离心 ,沉淀即为肝实质细胞 ,上清液中富含肝卵圆细胞 ,上清液采用 5 0 0g进行离心 ,沉淀物中富含肝卵圆细胞 ,加F12培养液悬浮细胞 ,再用相同条件离心 ,反复 3次 ,将沉淀物用F12培养液制备成细胞悬液 ;…     

大鼠肝卵圆细胞的分离培养和体外分化研究

目的 观察大鼠肝卵圆细胞的活化，为进一步研究肝卵圆细胞特征建立简单的分离培养方法。方法 利用2-乙酰氨基笏／部分肝切除建立肝卵圆细胞活化的大鼠模型，采用选择性消化法从该模型中分离纯化肝卵圆细胞，并做免疫细胞荧光鉴定。用丁酸钠诱导其分化。结果 成功地建立了肝卵圆细胞活化模型，并从中分离培养了表达OV6、CK19、AFP、白蛋白、c-kit、Thy1、CD45和CD34的卵圆细胞。在丁酸钠刺激下它可向肝细胞分化。结论 利用选择性消化法可以分离到肝卵圆细胞，并且其具有肝干细胞的特征。     

成体小鼠肝脏卵圆细胞的分离及培养

目的:建立一种稳定的成体小鼠卵圆细胞的分离和培养方法。方法:采用喂饲2-乙酰氨基芴（AAF）加2/3肝切除方法诱导肝脏卵圆细胞的增殖。经门静脉灌注消化法和等密度离心法分离卵圆细胞，并在体外进行长期培养。免疫荧光和免疫双标法对培养的卵圆细胞加以鉴定。结果:体外培养的卵圆细胞呈集落样生长，稳定传代并已培养至3个月。免疫荧光和免疫双标法证实培养的细胞为卵圆细胞，并显示该细胞具有分化潜能。结论:该方法是一种稳定的成体小鼠卵圆细胞的分离和培养方法，为肝脏干细胞的相关研究和应用奠定基础。     

大鼠肝卵圆细胞的形态学及免疫组织化学特征研究

肝卵圆细胞等肝干细胞有可能在肝衰竭及遗传性肝病治疗中发挥重要作用[1 ] 。我们在已建立的大鼠肝卵圆细胞增殖模型基础上 ,对大鼠肝卵圆细胞的形态学参数及细胞表型等生物学特征进行研究。一、材料与方法1.大鼠模型建立 :按照我们建立和改进的方案[2 ] ,选择体重 15 0 ｇ左右的雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠 (第三军医大学动物研究所提供 ) ,2～ 3个月龄 ,实验前单只分笼饲养 1周以上。实验大鼠通过胃管灌喂2 乙酰氨基芴 (ＡＡＦ ,Ｓｉｇｍａ公司产品 ) ,每天 1次 ,连续 4ｄ ,第 5天在戊巴比妥全身麻醉下行 2 3肝切除 (手术当日不灌喂ＡＡＦ) ,…     

大鼠肝卵圆细胞的分离与鉴定

目的：分离、培养和鉴定大鼠卵圆细胞。方法：以3'-me-DAB刺激卵圆细胞迅速增生,改良梯度离心法分离、培养大鼠卵圆细胞,观察其形态及增值特点并进行细胞免疫组织化学鉴定。结果：改良的梯度离心的方法能够有效地分离大鼠肝卵圆细胞,卵圆细胞胞体为卵圆形,代谢缓慢,具有干细胞的特点,可以形成集落,并且表达OV6、CD34及Nestin。结论：改良梯度离心法分离的细胞具有干细胞的特点,可以表达卵圆细胞特异性的表面标记OV6、造血干细胞表面标记CD34和神经中间丝蛋白Nestin,具有横向分化的可塑性,为进一步实验研究提供参考依据。     

端粒酶在大鼠肝卵圆细胞中表达的意义

目的 检测大鼠肝卵圆细胞端粒酶活性,探讨端粒酶表达与卵圆细胞增殖分化的关系.方法 采用2-AAF/PH模型诱导大鼠卵圆细胞增殖,改良的胶原酶灌注结合密度梯度离心法分离,用细胞免疫荧光和电镜鉴定卵圆细胞.采用免疫组织化学、RT-PCR、荧光定量PCR等方法检测卵圆细胞端粒酶的表达,组间比较采用t检验分析其意义.结果 采用2-AAF/PH模型成功诱导大鼠卵圆细胞增殖.分离的卵圆细胞核大,卵圆形,胞质少,呈铺路石样生长.电镜发现细胞核质比大,胞质内细胞器少且发育不成熟.细胞免疫荧光结果表达OV-6、AFP、CK-19、albumin、c-kit.端粒酶逆转录酶(TERT)表达在门静脉周围增殖的卵圆细胞核内,随着卵圆细胞逐渐向肝细胞方向分化,TERT阳性细胞数逐渐减少.大鼠正常肝组织TERT mRNA表达水平最高,为LE-6卵圆细胞的2.27倍;分离的卵圆细胞TERT mRNA表达水平为LE.6卵圆细胞的1.26倍;采用2μg和4μg细胞提取物分析细胞的端粒酶活性,随着LE-6卵圆细胞传代次数的增加,由24代传至40代,端粒酶活性由△A=1.05、1.15降低到△A=0.25、0.45(t=17.74,12.38,P<0.05).结论 卵圆细胞具有端粒酶活性,端粒酶可能是卵圆细胞维持其增殖能力和多分化潜能的一个必要条件.     

肝卵圆细胞来源分化增殖的研究进展

卵圆细胞为肝内一种祖细胞，在肝细胞严重受损或分裂增生受抑制时可向肝细胞和胆管上皮细胞分化，是一种具有双向分化潜能的祖细胞。卵圆细胞的分化增殖受多种因素调控．新近研究认为SDF-1-CXCR4生物学轴在卵圆细胞增殖过程中起非常重要的作用。肝癌的发生与卵圆细胞的分化异常有一定的关系。卵圆细胞分化为肝细胞和胆管上皮细胞使其可能成为旰脏细胞移植的重要细胞来源，在治疗终末期肝病、生物人工肝及基因治疗的研究领域有着广阔的应用前景。     

大鼠肝卵圆细胞增殖模型的建立和体外分离的实验研究△

目的探讨以2-乙酰氨基芴（2-AFF）灌胃与2／3肝切除法联合运用建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型的适宜剂量,并探讨肝卵圆细胞的体外分离培养方法。方法将174只Wistar大鼠随机分为4个实验组（各30只）、未处理组（24只）和生理盐水组（30只）。4个实验组大鼠分别给予5、10、15及20mg／（kg·d）2-AAF灌胃（分别对应第1、2、3及4实验组）,于第5天行2／3肝切除,术后继续灌胃至处死大鼠;生理盐水组大鼠以生理盐水灌胃,其余操作同实验组;未处理组大鼠不做任何处理。6组分别于肝切除术后第4、8、12及16天各随机处死6只大鼠,取肝组织行HE染色和免疫组化染色,观察肝卯圆细胞的增殖情况[第4天时同时检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AsT）水平];并采用二步胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心法对大鼠肝卵圆细胞进行分离和培养。结果肝切除术后第4天,未处理组、生理盐水组、第1、2、3及4实验组大鼠的存活率分别为100％（24／24）、93％（28／30）、93％（28／30）、90％（27／30）、90％（27／30）及80％（24／30）。肝切除后第4天,与未处理组及生理盐水组比较,第2、3和4实验组大鼠的血清ALT及AST水平均升高（P〈0.05）。HE染色结果显示,第2、3及4实验组大鼠的肝组织均出现不同程度的肝损伤,其中第3和第4实验组均可见明显的肝卵圆细胞增殖反应;免疫组化染色结果显示,第2、3及4实验组卵圆细胞标志6（OV-6）表达阳性细胞数在术后第4、8、及12天,随2．AAF剂量的增加逐渐升高,与2-AAF间呈剂量嫩应关系（P〈0.05）。大鼠肝卵圆细胞进行体外分离和培养后,经OV-6免疫组化染色鉴定,有80％的细胞表达呈阳性。结论联合运用15mg／（kg·d）2-AFF灌胃加2／3肝切除,于术后第12天,有效诱导了肝卵圆细胞的增殖,且造模大鼠的耐受性较好、死亡率低。采用二步胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心法较成功地分离出了大鼠肝卵圆细胞。     

大鼠肝脏Kupffer细胞的分离、纯化

目的建立简单、有效而稳定的大鼠肝脏Kupffer细胞分离、纯化的实验方法。方法①大鼠肝脏的胶原酶离体灌注；②Percoll液不连续梯度离心分离Kupffer细胞；③选择性贴壁纯化Kupffer细胞；④吞噬墨汁实验、DAB染色，光镜、电镜下观察鉴定Kupffer细胞。结果最终获得的大鼠肝脏Kupffer细胞活性〉90％，纯度为95％，光镜下Kupffer细胞具有较强的贴壁及吞噬碳粒能力，DAB染色呈黄色煎蛋样结构；新分离的Kupffer细胞呈圆形，形态大小一致；2d后，细胞发生伸展，呈多角形或星形。电镜下观察可见典型特点：有伪足及杯口状改变，有丰富的溶酶体和吞噬体。结论本实验建立的大鼠肝脏Kupffer细胞的分离培养方法效果稳定，同时培养的细胞具有良好的生物学性状。     

肝干细胞与肝癌关系的研究现状与临床价值

目的探讨肝干细胞与肝癌的关系及其临床应用前景。方法对国内、外相关研究成果进行回顾性分析。结果肝癌可能是肝干细胞分化不全或分化异常造成并由各种不同分化等级的细胞组成的。结论肝干细胞假说正逐渐得到广泛认同,对其的不断深入研究对揭示肝癌的细胞起源,研究肝癌的发生、转移机理等有重要意义。     

成人睾丸间质细胞的培养和鉴定

目的寻求一种有效的体外分离、纯化成人睾丸间质细胞的方法。方法利用4个梯度(60%、34%、26%、21%)的Percoll液分离、纯化成人睾丸间质细胞。对分离的细胞进行细胞学观察、锥虫蓝染色、3β羟基类固醇脱氢酶(3βHSD)染色、分泌睾酮能力和绒毛膜促性腺激素(hCG)对分离睾丸间质细胞的作用等检测。结果通过该方法能够获得高纯度(>90%)的成人睾丸间质细胞,并通过上述实验检测证实分离、纯化的睾丸间质细胞有良好的分泌睾酮能力。结论采用该方法对成人睾丸间质细胞进行初步的分离和纯化是简单有效的。     

肝卵圆细胞在进行性肝损伤过程中分布及迁移的实验研究

目的 探讨卵圆细胞在进行性肝损伤过程中的分布及迁移规律。方法 清洁型SD大鼠60只随机分为对照组(20只)和实验组(40只)，两组均于肝癌造模后的不同时相切取肝组织标本进行形态学观察、常规病理和原癌基因编码蛋白(C-kit)免疫组化检测。结果 对照组大鼠肝脏表面光滑，组织学形态正常，偶见C-kit阳性细胞。实验组于肝癌造模后的第2周，首先于汇管区发现卵圆细胞沿胆管上皮依次排列增生，这些卵圆细胞呈C-kit阳性表达。随着肝损伤进行性加重，卵圆细胞以汇管区为中心向肝小叶穿插、迁移。肝癌形成期，以混合型癌多见，癌结节内外均见有卵圆细胞，此期C-kit阳性细胞仍集中于汇管区。结论 卵圆细胞为肝组织内对损伤反应最敏感的一种细胞；肝卵圆细胞的无序迁移参与假小叶形成；卵圆细胞与肝癌的发生密切相关。     

大鼠胰腺星状细胞分离培养与鉴定

目的：分离培养大鼠胰腺星状细胞,为体外研究胰腺纤维化提供细胞模型。方法：采用酶消化结合Nycodenz密度梯度离心法分离胰腺星状细胞,通过倒置显微镜观察细胞形态,油红O染色和免疫细胞化学染色desmin,α-SMA进行细胞鉴定,并绘制传代后细胞生长曲线。结果：原代培养的大鼠胰腺星状细胞呈星形或梭形生长;原代胰腺星状细胞油红O染色胞浆均可见红色密集脂滴,直至传代后消失;原代胰腺星状细胞培养48 h后,desmin表达开始减弱,α-SMA表达开始增强;传代后desmin基本不表达,α-SMA阳性表达100%;传代后第3 d-5 d的胰腺星状细胞处于快速增殖阶段。结论：酶消化结合Nycodenz密度梯度离心法分离培养大鼠胰腺星状细胞纯度高,重复性好,可以满足体外研究的需要。     

The Isolation of Epithelial Cells from the Rat Epididymis

Epithelial cells from the epididymis were released by digesting the chopped epididymis with pronase followed by collagenase plus hyaluronidase. The epithelial cells were further separated from contaminating cell types by differential centrifugation and sedimentation at unit gravity through a gradient of sucrose in Ringer. The isolated cells remained viable as judged by the exclusion of trypan blue. The cells respired in the presence of glucose and the rate of respiration was not altered by the subsequent addition of pyruvate.     

大鼠睾丸Leydig细胞的培养和鉴定

目的:研究体外培养大鼠睾丸Leyd ig细胞的有效方法。方法:原代培养大鼠睾丸Leyd ig细胞,用4 U/m l人绒毛膜促性腺激素(hCG)作用细胞,对照组未用hCG,放射免疫法测定培养液中睾酮浓度,3β羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)免疫组化染色观察睾丸Leyd ig细胞形态和生物学特性。结果:培养细胞成分均一、增殖旺盛、分化率高。接种72 h后大鼠睾丸Leyd ig细胞纯度达95%。接种后24 h内,hCG刺激组较对照组睾酮分泌量明显提高(P<0.05)。结论:体外培养的睾丸Leyd ig细胞可分泌高浓度的睾酮;睾丸Leyd ig细胞的纯化和培养方法的建立,可为中老年男性雄激素部分缺乏综合征睾酮替代治疗的基础和临床研究提供一条可行的思路。     

大鼠睾丸间质细胞的原代培养、鉴定与功能监测

目的:采用改良方法对大鼠睾丸间质细胞进行分离、纯化和原代培养,以得到更高纯度和稳定的间质细胞原代培养体系。方法:采用酶消化法分离大鼠睾丸间质细胞,再用Percoll连续密度梯度离心除去生精细胞、支持细胞等杂细胞,实现进一步纯化;用3β-HSD特异性染色法鉴定间质细胞,同时采用放射免疫法测定间质细胞睾酮分泌活性。结果:培养的间质细胞纯度达到95%以上,每个睾丸可获取间质细胞约1×106个;通过3β-HSD特异性染色鉴定,该间质细胞胞质呈蓝黑色,而且细胞具有分泌睾酮的活性。结论:酶消化后以Percoll连续密度梯度离心可分离得到高纯度且具有睾酮分泌活性的间质细胞,操作简单易行,实验方法稳定。     

大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞的体外培养和鉴定

目的探索大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（EPCs）的体外培养、诱导分化及鉴定方法。方法采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞,并在诱导培养基（EGM-2MV）中培养,贴壁筛选法分离,诱导分化为EPCs;观察EPCs的生长分化过程,对其形态、表型、功能加以鉴定。结果培养3 d,细胞贴壁较为完全,第4天换液后,细胞呈现克隆样生长,第7～8天形成类似成熟血管内皮细胞形态,呈现典型的"铺路石"样外观;诱导培养第7、10天的贴壁细胞CD34、Flk-1及CDl33染色均呈阳性;荧光显微镜下观察,DIL-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色的细胞数占贴壁细胞数的75%以上。结论采用密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞,在培养液中贴壁培养,可以扩增出具有典型特征的EPCs。