国人正常睾丸组织定向克隆表达cDNA文库的构建及意义

目的　研究精子发生相关基因的结构与功能 ,构建中国人正常睾丸组织定向克隆表达cDNA文库。　方法　提取国人正常睾丸组织mRNA ,逆转录合成cDNA ,SalI/NotI酶切后基因重组法定向克隆于质粒表达载体pSPORT1中 ,转化细菌后扩增。　结果　文库大小为 7× 10 5,SalI/NotI酶切鉴定 ,插入的cDNA片段多为 0 .5～ 2 .0kb。　结论　国人正常睾丸组织定向克隆表达cDNA文库构建成功 ,质量较好 ,可进行包括低丰度mRNA在内的所有丰度mRNA的cDNA克隆筛选 ,为进一步研究精子发生相关基因的结构与功能提供了实验依据。     

从人肾癌酵母双杂交文库中筛选TCF4相关蛋白

目的：应用酵母双杂交技术寻找在肾癌发生过程中与Wnt信号家族成员T细胞因子4(TCF4)相互作用的新蛋白。方法：以Wnt通路中的关键信号分子TCF4的N端和DNA结合域(TCF4ND，1～495aa)为诱饵蛋白，筛选肾癌双杂交文库，得到的阳性克隆酶切分类，测序后在Gen-Bank中进行Blast分析。结果：筛出与hTCF4相互作用的阳性克隆51个，包括β环连蛋白(β-catenin)，hTCF4，激活转录因子5(ATE5)，人类锌指蛋白等，其中未知基因2个。结论肾癌的发生、发展可能有多种信号通路参与调控。     

肾癌抑制性消减杂交文库的构建及意义

目的　应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌组织与正常肾组织间差异表达的cDNA组成的消减文库。　方法　分别从肾癌组织和正常肾组织提取polyA RNA ,合成双链cDNA ,经RsaI酶切后将肾癌cDNA分为两组并加上不同的DNA接头 ,再与过量正常肾组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,PCR产物与T/A载体连接并转化大肠杆菌构建成cDNA消减文库 ,文库扩增后随机挑取克隆进行酶切、测序及同源性分析。　结果　文库共包含 4 14个阳性克隆 ,随机挑取 2 6 5个阳性克隆提取质粒并酶切分析 ,其中 2 4 6个克隆有插入片段。将其中 4 0个克隆进行测序 ,表明 1个克隆为新基因片段 ,其余 39个源于 35个已知基因。　结论　该消减杂交文库质量可靠 ,它的成功构建为进一步筛选、克隆肾癌差异表达基因提供了依据     

肿瘤坏死因子α转化酶胞内区诱饵质粒的构建及鉴定

目的:构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒载体pGBKT7-TACEc(肿瘤坏死因子α转化酶胞内区),并检测其是否具有自身激活及毒性作用。方法:从BALB/c雄性小鼠睾丸组织提取总RNA,用RT-PCR方法获得TA-CEc,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-TACEc在酵母双杂交系统中的自激活和毒性作用。结果:实验成功构建了诱饵质粒载体pGBKT7-TACEc,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。结论:pGBKT7-TACEc可应用在酵母双杂交系统中,寻找小鼠睾丸cDNA文库中与TACEc相互作用的蛋白质,为筛选小鼠睾丸中与TACEc相互作用的蛋白奠定了重要基础。     

人睾丸酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

目的:构建应用于酵母双杂交系统的人睾丸组织cDNA文库。方法:从正常人睾丸组织总RNA中纯化出mRNA,以SMARTШTM和CDSШ为引物,合成两端具有同源臂的双链cDNA,后者与线性质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母细胞Y187,两者在酵母细胞中同源重组成环形的cDNA文库质粒,收集在营养缺陷培养板上筛选出的所有克隆,即为人睾丸酵母双杂交cDNA文库。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人睾丸cDNA文库,共获得2×106个转化子,插入的双链cDNA片段的长度在0.3～4.0 kb之间。结论:利用ClontechSMART技术,成功构建了应用于酵母双杂交的人睾丸组织cDNA文库,为探讨人精子发生的分子机制奠定了基础。     

乳鼠成骨细胞酵母双杂交cDNA文库构建

目的构建乳鼠成骨细胞的酵母双杂交cDNA文库。方法用TRIzol法提取乳鼠成骨细胞总RNA,按照SMART cDNA Library Construction Kit ( CLONTECH)说明书反转录合成双链cDNA.Spin Column去除短片段,然后用同源重组的方法将双链 cDNA和PGADT7~rec载体共转化到酵母细胞Y187中,建立文库并计算文库滴度。结果提取的总RNA的A 260/A 280为 1.99,琼脂糖凝胶电泳示28SrRNA、18SrRNA2条带,且28S与18S带亮度比值约为2。酵母文库库容为1. 68 x 107,重组率为 100%。插人片段PCR检测提示大小分布为1. 5 -4. 0 kb,平均长度约为3. 0 kb。结论乳鼠成骨细胞酵母双杂交cDNA文 库构建成功。     

丁酸钠诱导MCF-7细胞凋亡反义cDNA文库的构建和初步鉴定

目的构建丁酸钠诱导McF-7细胞凋亡过程的反义cDNA文库,以分离丁酸钠抗肿瘤效应基因。方法收集经2．5mmol/L丁酸钠处理0、12、18、24、36、48、72h的人乳腺癌MCF-7细胞,提取poly(A)+RNA,逆转录合成cDNA第一链和第二链,双链cDNA修平末端后连上EcoRⅠ/HindⅢ接头,分别用EcoRⅠ/HindⅢ酶切消化后,反向连上载体pcDNA 3．1,连接产物转化大肠杆菌得一反义cDNA文库,随机挑取40个克隆子进行酶切鉴定。结果构建的反义cDNA文库含1×10~6重组子,重组效率为90%,插入子平均长度为1．5kb。结论构建的文库容量较大,质量较高,为进一步分离丁酸钠抗肿瘤效应基因奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆肾癌转移相关基因

目的:应用抑制性消减杂交技术构建人高侵袭性肾癌细胞和低侵袭性肾癌细胞间差异表达的cD-NA消减文库,筛选并克隆肾细胞癌转移相关基因.方法:采用涂有Matrigel胶的Transwell小室分离回收高、低侵袭性肾癌细胞,分别从高侵袭性肾癌细胞与低侵袭性肾癌细胞中提取polyA RNA,合成双链cDNA,经RsaI酶切后将高侵袭性肾癌细胞cDNA分为两组并加上接头1和接头2,再与过量低侵袭性肾癌细胞cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,PCR产物与pMD18-T载体连接并转化JM109大肠杆菌构建成cDNA消减文库,文库扩增后随机挑取克隆进行测序及同源性分析.结果:文库共包含185个阳性克隆,随机挑取50个阳性克隆分析,其中45个克隆有插入片段.将其中15个有插入片段的克隆进行测序,表明源于7个已知基因.结论:利用抑制性消减杂交技术,从一对同源的高低转移表型差异的细胞株中获得了7条可能与肾癌转移相关的cD-NA序列,他们可能在促进肾癌转移中起到重要作用.     

肾癌组织消减文库的构建与肾癌特异表达基因克隆

目的 构建人肾癌组织与正常肾组织差异表达的cDNA消减文库,从文中克隆鉴定出肾癌特异性表达的基因奠定基础。方法 应用抑制性消减杂交技术,分别从肾癌及正常肾组织中提取poly(A) RNA;依次合成单链及双链cDNA,分别与2种不同的接头衔接,再与正常肾cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR;将产物T／A载体连接接构建成功cDNA消减文库。结果 构成功具有高消减效率的人肾癌组织cDNA消减文库,文库扩增后得到350个阳性克隆,其中95％克隆均含50－400bp插入片段。结论 应用抑制性消减杂交技术所构建的人肾癌组织cDNA消减文库为进一步大批量筛选、克隆肾癌特异性表达的基因奠定了基础。     

应用酵母双杂交系统筛选小鼠PIAS2相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交技术,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选与PIAS2(protein inhibitor of activatedSTAT2,PIAS2)相互作用的未知蛋白。通过对其相互作用蛋白的筛选和研究,探讨PIAS2在精子发生中的作用机制,为临床男性不育症的治疗和诊断提供理论基础。方法:以pGBKT7-PIAS2为诱饵质粒,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选出与pGBKT7-PIAS2相互作用的阳性克隆,对验证后的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,进一步采用直接酵母双杂交进行相互作用的验证。结果:经过筛选、测序、同源性分析及直接酵母双杂交验证,发现了与PIAS2相互作用的8个候选蛋白:Cyfip2、Psmb3、Nme1、nischarin、Nsun5、Ints10、Gnb2l1及Ndufaf3。结论:应用酵母双杂交系统,共筛选得到了8个不同的基因,其编码蛋白与PIAS2相互作用,可能与男性生殖调控相关。对上述蛋白与PIAS2的相互作用研究有助于揭示PIAS2的作用机制。