逆转录病毒载体介导HSV—TK基因在膀胱癌细胞的表达和作用

应用基因工程技术构建了带ＨＳＶＴＫ基因的逆转录病毒重组体ｐＬＮＳＸＴＫ，磷酸钙沉淀法转染ＰＡ３１７细胞，建立了重组病毒的载体产生细胞系ＰＡ３１７／ＴＫ细胞。用病毒上清感染人的膀胱癌细胞株ＢＩＵ８７，Ｇ４１８筛选抗性克隆ＢＩＵ８７／ＴＫ细胞。提取ＰＡ３１７／ＴＫ和ＢＩＵ８７／ＴＫ细胞的ＤＮＡ，用ＤＩＧ标记检测证实整合了ＨＳＶＴＫ基因，在病毒上清用ＲＴＰＣＲ检测到目的基因的转录。转导ＨＳＶＴＫ基因的膀胱癌细胞获得对ＡＣＶ的化学敏感性，给予ＡＣＶ可有效地杀伤肿瘤细胞。     

原发性肝细胞肝癌患者癌组织和血清中HBV前C区基因的检测

目的 乙型肝炎炎病毒（ＨＢＶ）是原发性肝细胞肝癌（ＨＣＣ）的主要诱导因素之一。为探讨ＨＢＶ在ＨＣＣ中的重要性，我们检测了ＨＣＣ患者癌组织及血清中的ＨＢＶ前Ｃ区基因。方法 根据ＨＢＶ前Ｃ区ＤＮＡ序列，采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）对２３例手术切除后病理确诊有ＨＣＣ患者癌组织以及血清进行了检测。结果 ＰＣＲ显示２３例ＨＣＣ患者癌组织和血清中ＨＢＶ前Ｃ区基因的阳性率分别为５２．２％（１２／２３）和３０．４     

人原发性胆管细胞性肝癌与乙型肝炎病毒感染的关系

目的 探讨胆管细胞性肝癌（ＣＣＣ）与乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染间的关系。方法 应用ＰＣＲ－ＥＢ法对胆管细胞性肝癌，胆管结石的肝组织，石蜡包埋标本进行ＨＢＶ－ＤＮＡ检测。并回顾性地与ＥＬＩＳＡ法检测的血清ＨＢＶ五项标志物进行对比。结果 ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率在胆管细胞性肝癌组明显高于肝胆管结石组（Ｐ〈０．０１）；胆管细胞性肝癌的癌旁胆管上皮细胞异型增生ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性组明显高于ＨＢＶ－ＤＮＡ阴性组（     

人胃腺癌阿霉素耐药细胞系BGC—823／DOX耐药机理的研究

为了进一步阐明人胃腺癌阿霉素耐药细胞系ＢＧＣ－８２３／ＤＯＸ耐药机理和特点，作者应用ＤＮＡ分子杂交、ＲＴ－ＰＣＲ、免疫组化和流式细胞技术进行了ＢＧＣ－８２３／ＤＯＸ多药耐药（ＭＤＲ１）、拓扑异构酶Ⅱα（ＴｏｐｏⅡα）、多药耐药相关蛋白基因的基因扩增、转录、表达分子水平检测以及细胞内阿霉素含量分析。结果表明，ＢＧＣ－８２３／ＤＯＸ亲本细胞具有原发耐药的特性，与消化道肿瘤较为相似。多药耐药是ＢＧＣ－８２３／ＤＯＸ主要的耐药机理。亲本细胞具有原发耐药ＢＧＣ－８２３／ＤＯＸ与亲本无原发耐药的阿霉素耐药细胞系相比，在耐药性质上有显著的差异。     

抗人精浆蛋白单链抗体的构建及表达

目的构建抗人精浆蛋白单链抗体（γＳｍＳｃＦｖ）,为进一步应用基因工程抗体研究打下基础。方法从分泌抗人精浆蛋白单克隆抗体γＳｍＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系Ｅ４Ｂ７中提取总ＲＮＡ,经ＲＴＰＣＲ分离获得了γＳｍＭｃＡｂ轻、重链可变区（ＶＬ、ＶＨ）基因,用连接肽将其构建成具有ＶＨＬｉｎｋｅｒＶＬ结构的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到融合蛋白表达载体ＰＧＥＸ４Ｔ１中进行表达。结果经测序表明,ＶＨ、ＶＬ及Ｌｉｎｋｅｒ的序列均正确。ＳｃＦｖ在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的４０％。结论构建的抗人精浆蛋白单链抗体,为进一步制备基因工程抗体奠定了基础     

聚合酶链反应检测小儿肾病患者肾组织中相关病毒基因的表达

病毒感染与小儿肾病关系在国内外存在不同意见和观点。我们应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对２２４例小儿肾病患者血清及肾组织中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）、丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）、ＥＢ病毒（ＥＢＶ）和巨细胞病毒（ＣＭＶ）进行了检测，以期了解和探讨这些病毒在小儿肾病中...     

胆管细胞性肝癌石蜡包埋肝组织中HBV DNA及免疫组织化学检测

我国为乙型肝炎（ＨＢ）高发区，表面抗原携带率达１０％，ＨＢ与肝细胞性肝癌的关系密切，但关于ＨＢＶ与胆管细胞性肝癌（ＣＣＣ）之间关系的研究罕见报道，我们应用ＰＣＲ对ＣＣＣ及肝胆管结石的石蜡包埋组织中ＨＢＶＤＮＡ进行了检测，并与酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳ...     

肝癌自杀基因治疗与基因体内导入方法和途径的实验研究

我们采用携带单纯疱疹病毒胸苷激酶 (ＨＳＶ ｔｋ)基因的质粒型ＥＢ病毒(ＥＢＶ)复制子表达载体ｐＤＲ2 /ｔｋ ,研究其转染人肝癌细胞 (ＳＭＭＣ 772 1)后对更昔洛韦 (Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ,ＧＣＶ )和阿昔洛韦(ＡＣＶ)的敏感性 ,包括杀伤作用和“旁观者效应”。在此基础上 ,根据肝脏的血供及肝癌手术治疗特点 ,利用携带人ＩＬ 2基因的ＥＢＶ复制子表达载体ｐＤＲ2 /ＩＬ 2 ,研究肝癌基因治疗中接近临床应用的最佳体内直接基因转移方法和途径。1.材料和方法 :表达载体ｐＤＲ2 /ｔｋ和ｐＤＲ2 /ＩＬ 2在中国预防医学科学院病毒所国家重点实…     

庚型肝炎病毒在血液透析患者中感染情况及基因同源性分析

目的 探讨庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）在维持性血液透析（ＨＤ）患者中的流行情况及感染相关因素。方法 应用套式逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法检测５０例ＨＤ患者血清ＨＧＶ ＲＮＡ，并分析其与透析时间、输血、肝功能损害及丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）、乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染的关系。结果 ＨＤ患者ＨＧＶ感染率达１４％，远高于正常对照人群。ＨＧＶ感染相关因素分析提示：随着透析时间的延长，输血次数的增加，ＨＧ     

人B7逆转录病毒基因转移体系的建立及在肾癌细胞中的表达

将人Ｂ７基因亚克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，构建了人Ｂ７逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮＢ７，经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导转染包装细胞，并通过Ｇ４１８筛选获得较高病毒滴度的细胞株ＰＡ３１７／ｐＬＸＳＮＢ７（３×１０５～１×１０６ｃｆｕ／ｍｌ）。用此逆转录病毒基因转移体系将Ｂ７基因转移到肾癌ＧＲＣ１细胞中，经ＲＴＰＣＲ、间接免疫荧光及ＬＳＡＢ细胞免疫组化等检测方法检测到转基因细胞中Ｂ７ｍＲＮＡ及Ｂ７分子的表达。介导人Ｂ７基因的逆转录病毒基因转移体系的建立，为人肾癌转基因瘤苗的应用研究提供了实验基础。     

乙型肝炎病毒x基因上调肝癌细胞胰岛素样生长因子-Ⅱ胚胎启动子活性的研究

目的　研究乙型肝炎病毒x基因（HBx）对肝癌细胞胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)启动子活性的影响,探讨HBx基因影响肝癌恶性表型的分子机制。方法　应用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测QGY7701肝癌细胞株和转HBx基因肝癌细胞株QGY/HBx的IGF-Ⅱ成年启动子P1与胚胎启动子P3、P4的活性。结果　与QGY7701细胞相比,QGY/HBx细胞IGF-Ⅱ基因P1启动子活性无明显改变(分别为3.12±1.18与3.74±1.87,P＞0.05),而P3与P4活性显著升高(2.27±0.68、3.97±1.66与1.20±0.39、1.45±0.43比较,P＜0.05)。结论　HBx基因可上调肝癌细胞IGF-Ⅱ基因胚胎启动子P3、P4活性,这可能HBx基因增强肝癌恶性表型的一个重要机制。     

野生型和突变型RASSF1A基因对人肝癌细胞生长的影响

目的　探讨野生型 /突变型RASSF1A基因的表达对人肝癌细胞株QGY 770 3在体内外生长的影响。方法　构建突变型RASSF1A基因的真核表达载体 ,通过脂质体介导的基因转染法将野生型 /突变型RASSF1A基因的真核表达载体及空载体转染肝癌细胞株QGY 770 3 ,G418筛选稳定表达株 ,并以逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和Westernblot进行鉴定。通过细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验和裸鼠致瘤性试验对各稳定表达株的生物学行为进行检测。结果　成功建立稳定表达野生型和突变型RASSF1A基因的肝癌细胞株。以转染空载体的QGY 770 3细胞为对照 ,野生型RASSF1A基因的表达可明显抑制肝癌细胞在体外的生长 ,显著降低肝癌细胞在软琼脂中形成的克隆数目 (P <0 .0 1)和大小 ,显著减慢裸鼠皮下瘤的生长速度和重量 (P <0 .0 1)。突变型RASSF1A基因的表达对肝癌细胞的生长影响不大。结论　野生型RASSF1A的重表达有助于QGY 770 3恶性表型的逆转 ;野生型RASSF1A基因是一个肝癌相关的抑癌基因。     

linamarase稳定转染肝癌细胞系的建立及研究

目的构建含木薯linamarase(lis)基因的稳定转染肝癌细胞系,并对其生物学特性进行研究。方法应用PCR法从木薯的DNA中扩增出lis基因,将其克隆至pcDNA3.1(+)质粒中,构建重组质粒pcDNA3.1/lis。通过脂质体法将其转染人肝癌细胞系HepG2,进行G418筛选,获得稳定转染的肝癌细胞系HepG2/lis,通过免疫荧光染色、RT-PCR和Western blot法鉴定lis在细胞中的表达;采用Lambert法对细胞内lis酶的活性进行分析;采用MTT法观察稳定转染细胞系生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期,裸鼠成瘤实验分析其体内成瘤特性。结果 lis基因能稳定整合于真核细胞中,并包装出具备β-葡萄糖苷酶活性的蛋白。lis在细胞中的稳定表达对细胞形态、生长特性、细胞周期、体内成瘤性等生物学特征并无明显影响。结论成功构建含lis基因的稳定转染肝癌细胞系,为将lis自杀基因系统应用于肝癌的治疗提供了实验基础。     

HBx基因大鼠卵圆细胞株的建立及鉴定

目的 构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达质粒pEGF-HBx,建市稳定、高效表达乙型肝炎病毒x基因(HBx)的大鼠卵圆细胞株,以便进一步研究HBx基因和卵圆细胞在肝癌发牛过程中的作用和机制.方法 用PCR方法从质粒pcDNA3.1-HBx中扩增含Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的HBx基因序列.对增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-NI)及扩增的HBx目的 基因片段进行双酶切,纯化后用连接酶连接得到重组体pEGFP-HBx,将其转化大肠杆菌DHSα,抗生素筛选培养得到阳性克降,提取质粒后用双酶切和基因测序进行鉴定.通过脂质体介导将质粒pEGFP-HBx转染到大鼠卵圆细胞株(LE/6)中,经G418筛选,尤限传代后得到稳定表达EGFP-HBx融合蛋白的细胞株.分别采用RT-PCR和免疫细胞化学技术检测细胞株中HBx基凶的表达情况.结果 双酶切及基因测序结果均显示构建的pEGFP-HBx质粒中含有完整的HBx基因片段.将得到的抗性细胞株培养传代20次后仍表达强的荧光;RT-PCR及免疫细胞化学检测均发现HBx基因在抗性细胞(LE/6)中得到了稳定转录和翻译.结论 已成功构建带HBx基因的真核表达质粒pEGFP-HBx,获得了稳定、高效表达EGFP-HBx融合蛋白的大鼠卵圆细胞株,为进一步研究HBx基凶和卵圆细胞在肝癌发生过程中的作用和机制奠定了实验基础.     

乙型肝炎病毒X蛋白对DNA甲基转移酶3A/3B表达的影响

目的观察乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对QSG7701细胞中DNA甲基转移酶（DNMT）3A/3B表达的影响。方法本研究室前期构建好的重组表达质粒pcDNA-X及空载体pcDNA3.0分别转染QSG7701细胞,经含G418的选择性培养基筛选获得稳定转染HBV-X基因的细胞克隆（pcDNA-X/QSG7701）及稳定转染空载体pcDNA3.0的细胞克隆（pcDNA3.0/QSG7701）。采用RT-PCR、Westernblot分别检测转染细胞中HBxmRNA和HBx蛋白的表达。Real-timePCR检测3种细胞DNMT3A/3BmRNA的表达情况。免疫组织化学法检测3种细胞DNMT3A/3B蛋白的表达情况。结果RT-PCR、Westernblot检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中有HBxmRNA及HBx蛋白的表达。Real-timePCR结果显示pcDNA-X/QSG7701中DNMT3A/3BmRNA表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及未转染的细胞QSG7701（P〈0.05）。免疫组织化学检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中DNMT3A/3B蛋白表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及QSG7701细胞（P〈0.05）。结论稳定转染HBV-X基因的人源性永生化非瘤性肝细胞QSG7701中DNMT3A/3BmRNA和蛋白的表达水平均显著升高,提示HBV-X基因在mRNA及蛋白水平能上调转染细胞中DNMT3A/3B的表达,而细胞中DNMT3A/3B表达的增加是否能进一步影响癌基因、抑癌基因的表达水平,从而导致细胞癌变,尚有待进一步研究。     

HBx在乙型肝炎病毒相关性肝癌形成与发展中的分子机理

目的 了解HBx基因在乙肝病毒相关性肝癌形成与发展中的分子机理。方法 综合国外近5年的文献进行分析。结果 HBx具有促进细胞恶性转化、抑制受损DNA的修复、反式激活、抑制wtp53功能和抑制细胞凋亡等生物学功能。HBx可能通过直接致癌作用、抑制DNA的修复、抑制wtp53、干扰Fas/CD95系统和抑制Caspase-3活性等分子机理，诱发肝癌形成和促进肝癌发展。结论 HBx及其编码的蛋白HBxAg具有广泛的生物学功能，从多方面、多途径促进肝癌的形成和发展。     

体外腺病毒介导的HSV-tk/GCV对产生AFP的人肝癌细胞的影响

目的 观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）/丙氧鸟苷（GCV）自杀基因系统在体外对人肝癌细胞的选择性杀伤效应。方法 采用含有甲胎蛋白基因启动子、增强子和HSV-tk基因的嵌合基因,插入腺病毒中形成重组腺病毒（AdrAFPTK）,将该重组腺病毒分别感染体外培养的甲胎蛋白阳性人肝癌细胞BEL-7402和甲胎蛋白阴性人肝癌细胞SMMC-7721,逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测HSV-tk基因的转录表达,观察GCV对人肝癌细胞的选择性杀伤作用。结果GCV在体外对重组腺病毒转染的甲胎蛋白阳性的人肝癌细胞BEL-7402有明显的杀伤作用和“旁观者效应”,而对重组腺病毒转染的甲胎蛋白阴性的人肝癌细胞SMMC-7721无明显作用。结论 在体外,表达HSV-tk基因的甲胎蛋白的人肝癌细胞可被受甲胎蛋白基因表达调控序列控制的自杀基因HSV-tk特异性杀伤,表现出极高的细胞专一性。重组腺病毒AdrAFPTK可望用于肝癌的特异性基因治疗。     

HSP27-siRNA抑制肝癌细胞生长的实验研究

目的探讨HSP27-siRNA对肝癌细胞的生长的影响。方法将HSP27-siRNA转染到人肝癌细胞株QGY细胞中;利用MTT法检测不同浓度不同时间HSP27-siRNA对QGY细胞的杀伤活性;流式细胞仪检测分析HSP27-siRNA对QGY细胞周期及凋亡的影响。RT-PCR检测HSP27-siRNA对QGY细胞HSP27 mRNA表达的影响;Western blot检测HSP27-siRNA对HSP27基因表达蛋白的抑制效率。结果HSP27-siRNA能抑制QGY细胞HSP27 mRNA的表达,使其HSP27蛋白的表达下降。HSP27-siRNA在体外能抑制QGY肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡,作用均呈剂量-时间依赖。结论HSP27-siRNA能抑制QGY细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,有可能成为临床治疗人肝癌有效方法。     

聚酯型儿茶素诱导人肝癌细胞凋亡的研究

目的 探讨聚酯型儿茶素（ＴＳ）的抗癌作用机制。方法 应用四氮唑蓝快速比色（ＭＴＴ）法，透视电镜，琼脂糖凝胶电泳，流式细胞术等方法研究ＴＳ诱导体外培养的人肝癌细胞凋亡。结果 ５０－８００ｍｇ／Ｌ ＴＳ对人肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１细胞的生长有明显的抑制作用，且量效关系明显。４００ｍｇ／Ｌ ＴＳ作用于ＳＭＭＣ－７７２１细胞２４ｈ后，透射电镜观察到凋亡小体；ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳上可见典型的“阶梯状”：