骨髓间充质干细胞在丝素蛋白/骨形态发生蛋白中的生物学行为观察

目的 观察丝素蛋白与牛骨形态发生蛋白的载体系统与骨髓间充质干细胞的体外相容性.方法 将多孔丝素蛋白修剪成20×10×5 mm长方体状物,置入6孔板中;将粉状bBMP用PBS液溶解制成2mg/ml混悬液,0.5ml无菌移液管滴定于多孔丝素蛋白上(0.5毫升/个).骨髓间充质干细胞以107/ml接种到载体系统上,复合4小时后加入生长液继续体外培养,每1、4、8天时进行碱性磷酸酶、矿化结节染色观察以及扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察;另外同时设立单纯丝素蛋白与细胞复合培养对照组进行观察.结果 倒置显微镜、扫描电镜和共聚焦显微镜下观察到细胞在两种材料上生长形态、活性正常,体外培养24小时时细胞已贴附材料上,呈匍匐状伸展,以后逐渐融合生长,8天时大量细胞成片状攀附在材料表面,并分泌有大量的网状细胞外基质,实验组可见结节状基质生成;碱性磷酸酶、矿化结节染色观察发现实验组细胞碱性磷酸酶和矿化结节染色阳性反应,对照组阴性.结论 丝素蛋白是一种良好细胞外基质材料,也是一种良好生长因子的缓释载体.     

转染人骨形态发生蛋白在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的：采用基因转移技术将人骨形态发生蛋白7（hBMP-7)基因转染兔骨髓间充质干细胞（BMSc ),检测外源基因的表达。方法：常规分子生物学技术构建hBMP-7逆转录病毒载体,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,感染兔骨髓间充质干细胞,使用原位杂交以及免疫组织化学的方法检测hBMP-7在BMSc中的表达。结果：原位杂交和组化检测经hBMP-7基因转染的BMSc中出现阳性结果,未转染的BMSc中未见阳性结果出现。结论：采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至BMSc中,并有外源性基因的表达。     

转染人骨形态发生蛋白在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的采用基因转移技术将人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因转染兔骨髓间充质干细胞(BMSc),检测外源基因的表达.方法常规分子生物学技术构建hBMP-7逆转录病毒载体,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,感染兔骨髓间充质干细胞,使用原位杂交以及免疫组织化学的方法检测hBMP-7在BMSc中的表达.结果原位杂交和免疫组化检测经hBMP-7基因转染的BMSc中出现阳性结果,未转染的BMSc中未见阳性结果出现.结论采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至BMSc中,并有外源性基因的表达.     

骨形态发生蛋白2基因转染的骨髓间充质干细胞修复羊胫骨干骨缺损

目的 评价腺病毒介导的人骨形卷发生蛋白2(Adv-hBMP-2）基因转染的羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)对长骨干骨缺损的修复效果．方法 22只羊，体重18．1～29．5kg．制造羊胫骨干骨缺损(2．1cm)．分为4组：Ⅰ组．Adv-hBMP-2转染BMSCs组(8只)；Ⅱ组．腺病毒介导的β半乳槠苷酶(Adv-βgal)转染BMSCs组(6只)；Ⅲ组，未转染BMSCs组(6只)；Ⅳ组，未治疗组（2只)。细胞自身分泌的细胞外基质作为细胞载体。分期行X线、计量组织学检查和生物力学测定。结果 X线检查示Ⅰ组的羊胫骨干骨缺损内有明显骨痂形成；24周，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的愈合率分别为6/7、1／5、2／5及0／1，X线疗效评分显示Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ组的评分比较．差异有显著性意义。组织学检查显示，与其它组相比．Ⅰ组的新生骨量最多，并有皮质骨形成。生物力学测试示Ⅰ组的力学强度最大。结论 Adv-hBMP-2基因转染的BMSCs在缺乏骨传导性支架的条件下可修复长骨干骨缺损。     

胰岛素样生长因子1转染骨髓间充质干细胞与丝素蛋白羟基磷灰石复合材料促进骨缺损修复的实验研究

目的:观察胰岛素样生长因子1(IGF 1)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)与丝素蛋白羟基磷灰石复合材料构建的组织工程骨修复骨缺损的效果。方法:用45只新西兰大白兔制备骨缺损模型后随机分为3组,每组15只,A组骨缺损处不植入任何材料,B组骨缺损处植入单纯骨髓间充质与丝素蛋白羟基磷灰石复合材料复合体,C组骨缺损处植入IGF...     

hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达及生物学效应的观察

目的:观察人骨形态发生蛋白-2(humanbonemorphogeneticprotein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)后的表达及表达产物对BMSCs增殖和向成骨细胞分化的影响。方法:利用腺病毒表达载体Adeno-XTM将hBMP-2基因转染兔BMSCs,用免疫组化染色。检测细胞内BMP-2的表达。然后通过MTT法分析其对细胞增殖的影响,并分别通过体外检测Ⅰ型胶原合成和表达情况、碱性磷酸酶染色和钙结节VonKossa染色,观察腺病毒介导hBMP-2基因转染兔BMSCs的成骨分化能力。结果:转基因细胞6周时仍能表达外源性基因。基因表达产物hBMP-2能明显促进BMSCs的增殖以及I型胶原的合成,转染后第14天碱性磷酸酶染色多数细胞为阳性,第21天出现钙结节。结论:hBMP-2基因转染BMSCs后可获得稳定表达,且基因表达产物能促进BMSCs增殖,并诱导其向成骨细胞分化。     

骨形态发生蛋白2基因转染的兔骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-聚己内酯支架体外构建载基因仿生骨的实验研究

[目的] 构建聚乳酸-聚己内酯(PLA/PCL)吸附骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因的聚乙二醇(PEG)纳米复合物形成生物可降解仿生骨材料,接种兔骨髓间充质干细胞(rabbit bone mes-enchymal stem cells,rBMSCs),检测BMP-2基因的转染情况及其对细胞增殖、分化的影响.[方法] 通过溶液共混法制备PLA/PCL载基因仿生骨,接种rBMSCs细胞于仿生骨之上,培养48 h;Real-time PCR检测转染后细胞BMP-2及骨钙素mRNA表达水平;应用Western Blot及免疫组化检测rBMSCs转染后BMP-2蛋白表达;免疫荧光检测rBMSCs细胞Ⅰ型胶原蛋白表达;ELISA检测转染后细胞培养上清中分泌BMP-2浓度,同时检测细胞内碱性磷酸酶活性,从而分析细胞分化情况;流式细胞检测转染BMP-2后细胞周期的变化.[结果] 以未转染细胞作为对照,免疫组化表明转染后细胞内BMP-2表达量明显上调(P＜0.05);Real-time PCR检测结果表明BMP-2与骨钙素mR-NA表达显著增加(P＜0.05);同时Western Blot结果同免疫组化结果相似,BMP-2也有明显上调(P＜0.01);免疫荧光检测Ⅰ型胶原表达量显著上升(P＜0.01);ELISA检测细胞培养上清中BMP-2分泌量也有增加(P＜0.05);碱性磷酸酶较对照组相比活性显著增强(P＜0.05),而流式细胞检测S期细胞无明显变化(P＞0.05).[结论] 载基因仿生骨具有稳定而安全的转染性能,其转染后对rBMSCs细胞的分化效果是明显的,而对于细胞周期变化的影响并不显著.     

慢病毒介导兔脑红蛋白基因感染骨髓间充质干细胞的实验研究

[目的]构建携带兔脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)基因的重组慢病毒,感染兔骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs),建立稳定表达兔Ngb的BMSCs/Ngb细胞。[方法]构建携带Ngb基因的重组慢病毒载体,在脂质体Lipofectamine 2000作用下转染293 T细胞,Real-time PCR检测慢病毒滴度;以Ngb重组慢病毒感染BMSCs,通过荧光表达法判定感染复数(multiplicities of infection,MOI),实时荧光定量PCR(real-time PCR)、蛋白质印迹(Western blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)判定感染后的BMSCs中Ngb的表达情况。[结果]构建Ngb重组慢病毒载体,经酶切及测序鉴定完全正确,能够转染293 T细胞并表达,滴度为2×108 TU/ml,Ngb重组慢病毒感染BMSCs最佳MOI值为100,且Ngb重组慢病毒感染BMSCs能持续稳定高水平表达Ngb mRNA和蛋白。[结论]成功构建Ngb重组慢病毒,并将Ngb基因稳定感染至BMSCs中,实现Ngb的持续稳定高水平表...     

共表达腺病毒载体构建鉴定及其转染骨髓间充质干细胞观察

目的:构建并鉴定绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)2和血管内皮生长因子(vascular endotheliel growth factor,VEGF)165双基因共表达的重组腺病毒,为研究该双基因对骨髓J间充质干细胞成骨方向诱导和体内骨缺损修复作用奠定基...     

Ad-BMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞前后生物学特性的研究

目的：对Ad－BMP－2／GFP转染兔骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）前后的生物学特性进行观察。方法采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离获取第10代兔BMSCs,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44、CD45、CD29的表达,用携带BMP2和GFP基因的腺病毒转染细胞。分别通过倒置荧光显微镜下观察转染前后细胞形态改变,MTT 法分析转染前后细胞增殖的情况,体外Ⅰ型胶原免疫组化染色和钙结节茜素红染色以观察转染前后细胞的成骨分化情况,Western Blot 检测转染前后细胞内目的蛋白表达。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能获取高纯度第10代兔BMSCs ,流式细胞仪检测显示CD44、CD29阳性,CD45阴性。 Ad－BMP－2／GFP转染兔BMSCs后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,细胞形态向成骨方向分化,在短时间内能促进兔BMSCs 的增殖（P＜0．05）,Ⅰ型胶原免疫组化染色、茜素红染色均呈阳性,Western Blot显示细胞内稳定表达BMP－2目的蛋白。结论 Ad－BMP－2／GFP能成功转染兔骨髓间充质干细胞并能改变其生物学特性。     

聚乙烯亚胺介导骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞的研究

目的 观察聚乙烯亚胺(PEI)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)的效率,从而优化可用于转染实验的条件.方法 利用细胞计数试剂盒(CCK-8)比色法检测0.2％～2.0％ PEI的细胞毒性,利用荧光显微镜和流式细胞仪测定N/P 3.97～ 37.75的转染效率、培养液中的氯喹(0～100 μmol/L)、10％白蛋白、5％血清及0～ 20 mmol/L Mg2+对PEI转染BMSCs效率的影响.结果 当完全培养基内的PEI浓度低于0.8％,BMSCs存活率为70％；N/P 15时PEI转染BMSCs的效率为14.4％；溶酶体抑制剂氯喹可增加PEI的转染效率,培养液中的10％白蛋白、5％血清及Mg2+可降低PEI转染效率.结论 PEI是一种有效的BMSCs非病毒转染剂.     

BMSCs来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究

目的探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架植入大鼠桡骨缺损处的成骨作用和成血管作用。方法取分离培养至第3代的SD大鼠BMSCs行成骨和成内皮细胞诱导并鉴定。分别将内皮细胞(A组)、成骨细胞(B组)、混合细胞(成骨细胞和内皮细胞比例为1∶1,C组)均匀滴加于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架上制备3组细胞-支架复合物,MTT检测支架内细胞增殖活性。取2月龄雄性SD大鼠30只,制作大鼠桡骨5 mm长缺损模型并分别植入3组细胞-支架复合物(n=10)。术后4、8、12周分别取移植物行HE染色观察,CD34免疫组织化学染色计数微血管密度,RT-PCR法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨保护素(osteoprotegrin,OPG)mRNA表达。结果 BMSCs成骨诱导7 d后ALP染色可见细胞质内蓝染颗粒,细胞核呈红染;内皮细胞诱导14 d后,CD34免疫细胞化学染色可见细胞内棕色颗粒。MTT检测示3组细胞活性随时间延长逐渐升高。HE染色示,术后12周A组未见明显类骨质形成,而有较密集的微血管结构及较多纤维组织形成;B、C组可见均质的类骨质,呈条索状和岛状分布,可见大量成骨样细胞存在。术后各时间点A、C组微血管密度均显著高于B组(P<0.05);A组术后12周微血管密度高于C组(P<0.05),其余2个时间点A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A组3个时间点OPN和OPG mRNA表达水平均较低,与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);B、C组分别于术后8、12周OPN mRNA表达达峰值,4周时OPG mRNA表达达峰值。结论 BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞按1∶1比例共培养于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为组织工程骨移植物,可以促进大鼠桡骨缺损部位骨的形成和血管化,促进骨缺损愈合。     

BMP-2联合低氧环境诱导BMSCs向软骨表型分化的研究

目的探讨BMP-2联合低氧环境诱导BMSCs向软骨表型分化的可行性,并进一步研究其生物学机制。方法取4周龄健康清洁级雌性SD大鼠骨髓采用贴壁法体外培养BMSCs,取第2代细胞根据培养条件不同分为4组:常氧对照组(A组)、常氧加BMP-2诱导液组(B组)、低氧(O2浓度3%)对照组(C组)和低氧加BMP-2诱导液组(D组)。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,培养7、14、21 d阿利新蓝染色检测各组软骨基质糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)分泌水平,21 d时Western blot检测细胞内Ⅱ型胶原和低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)蛋白表达水平,RT-PCR检测成软骨、成骨以及低氧相关基因表达水平。结果诱导培养21 d,D组细胞变为类圆形,细胞密度降低,细胞周边呈陷窝样,基质包裹细胞;A、B、C组均未见上述典型变化。D组阿利新蓝染色明显较其他组深,并随诱导时间延长蓝染加深,21 d时出现成片深染蓝色,其他组各时间点仅见散在少量的淡染蓝色。Western blot检测D组细胞内Ⅱ型胶原蛋白表达水平较其他组显著增高,C、D组HIF-1α蛋白表达水平较A、B组显著增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测D组成软骨分化相关指标Ⅱ型胶原α1(collagenⅡα1,COL2α1)、聚集蛋白聚糖表达最高,而B组成骨分化相关指标COL1α1、ALP、Runt相关转录因子2表达水平最高,C、D组低氧相关指标HIF-1α较A、B组显著增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 BMP-2联合低氧(O2浓度3%)环境可以诱导大鼠BMSCs向软骨分化,并抑制其成骨分化,HIF-1α可能是参与促软骨生成过程中的一个重要信号分子。     

骨髓间充质干细胞与聚乳酸-羟基乙酸支架材料相容性研究

目的 观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其分化的神经样细胞与聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架材料的相容性,并探讨两者复合修复周围神经损伤的效果.方法 (1)在体外,通过荧光显微镜、流式细胞仪、扫描电镜等技术观察BMSCs在PLGA上的生长及分化成神经样细胞的情况;(2)在体内,取右侧坐骨神经损伤的SD大鼠,随即分为4组,分别移植单纯PLGA、BMSCs-PLGA、神经样细胞-PLGA及直接缝合神经,术后斜板试验观察4组动物下肢功能情况;60d后处死大鼠,取神经标本做病理切片.结果 (1)在体外,BMSCs在PLGA上生长良好,与同期培养板里面的细胞比较,吸光度值(A)差异无统计学意义(P＞0.05);(2)在体内,BMSCs及其神经样细胞复合PLGA后能修复损伤的坐骨神经,促进大鼠下肢运动功能的恢复.术后3周,各组大鼠斜板试验的角度分别是:直接缝合组(38.32 ±5.51)度、单纯PLGA组(40.27 ±2.74)度、BMSCs-PLGA组(45.14±3.43)度、神经样细胞-PLGA组(60.56±4.70)度,且神经样细胞-PLGA组显著高于其他组(P＜0.01);病理切片显示支架与宿主神经组织有良好的生物相容性.结论 BMSCs能诱导分化生成神经样细胞,而PLGA与两者有良好的生物相容性.     

骨髓间充质干细胞与骨组织共培养模型的建立

目的:建立骨髓间充质干细胞(BMSCs)与骨组织共培养模型,模拟体内成骨环境,以全面研究骨髓间充质干细胞及细胞支架复合物的生物性状.方法:通过插入式培养皿和培养板来构建细胞一组织共培养的模型,将新鲜兔骨碎粒及骨块与骨髓间充质干细胞共培养,观察共培养条件下细胞的形态学变化、ALP活性及矿化能力,免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素.结果:构建出骨髓间充质干细胞与骨组织共培养的模型.共培养的间充质干细胞同期ALP活性高于普通培养对照组,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性,对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性.结论:体外构建的共培养模型部分模拟了体内成骨环境;经过共培养的细胞呈现成骨细胞的表型.     

红景天苷对大鼠BMSCs向胆碱能神经细胞分化的影响

目的探讨传统中药红景天苷诱导大鼠BMSCs向胆碱能神经细胞分化的作用及影响,以期为红景天苷应用于干细胞治疗神经系统疾病提供理论依据。方法取4～6周龄Wistar大鼠(体重约120 g)2只分离、培养BMSCs,并采用流式细胞仪鉴定。取第2代细胞,根据诱导方法不同将实验分为红景天苷诱导组(A组)、维甲酸诱导组(B组)和空白对照组(C组),A、B组BMSCs分别采用红景天苷(20μtg/mL)和维甲酸(5μmol/mL)诱导培养1、3、6、9 d,MTT法检测细胞增殖活力;细胞免疫荧光染色检测神经细胞相关标志分子神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase,NSE)、神经微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)、β-微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach)及NGF的表达;RT-PCR检测NSE、β-TubulinⅢ、GFAP、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)mRNA的表达;ELISA法测定培养液中BDNF和NGF含量;Western blot检测NGF蛋白表达水平。结果流式细胞仪检测显示,CD90和CD106阳性,CD34和CD45阴性,实验细胞为BMSCs。A、B组诱导培养6 d和9 d,细胞增殖活力较C组明显增强(P<0.05)。RT-PCR检测示,A组诱导培养6 d,NSE、BDNF、β-TubulinⅢ、GFAP mRNA表达丰度上调至峰值。B组诱导培养6 d,NSE mRNA表达丰度上调至峰值;1 d时BDNF mRNA表达丰度上调,6 d时达峰值;3 d时β-TubulinⅢmRNA表达丰度上调至峰值;1 d时GFAP mRNA表达丰度达峰值,与其余各时间点及C组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。各组各时间点均未见GABA mRNA表达。细胞免疫荧光染色示,诱导培养3 d,A、B组NSE、MAP2、β-TubulinⅢ和GFAP阳性率与C组比较差异均有统计学意义(P<0.01);A、B组诱导培养3、6、9 d,Ach阳性率均高于诱导培养1 d时及C组阳性率(P<0.01);A、B组各时间点NGF阳性率均显著高于C组(P<0.01)。ELISA法检测显示,A、B组诱导培养1、3、6、9 d时,BDNF、NGF表达水平均较C组上调(P<0.01),各时间点A、B组间BDNF表达水平比较差异无统计学意义(P<0.01)。Western blot检测显示,A组诱导培养6 d、B组诱导培养3 d时NGF蛋白表达最高。结论红景天苷能定向诱导大鼠BMSCs分化为胆碱能神经细胞。     

包裹骨形态发生蛋白-2基因转染干细胞的微囊化方法和蛋白释放效应

目的观察转基因骨髓间充质干细胞的微囊化包裹方法和骨形态发生蛋白-2(BMP- 2)释放效应。方法利用高压微电场制备由海藻酸纳和多聚赖胺酸组成的微囊(细胞浓度为3×10~6个/ml,海藻酸钠浓度为1.5%)包被转β-gal(报告基因)或BMP-2基因的骨髓间充质干细胞,根据X-gal染色观察细胞在微囊内的存活情况,ELISA方法检测其所释放的BMP-2蛋白量,共培养方法检测其生物学活性。结果7、14、21、28 d时微囊内转基因细胞X-gal染色均为阳性。包裹后30 d,培养液上清中仍可检测到BMP-2蛋白。转BMP-2基因微囊化细胞与未包裹骨髓间充质干细胞共培养10 d后,ALP活性定量检测结果表明,Adv-hBMP-2转染细胞组ALP活性为(52.537±1.774)U/ml,明显高于未转染细胞组的(42.336±0.857)U/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。结论微囊化转基因干细胞生长良好,能持续分泌BMP-2蛋白并促进干细胞向成骨细胞方向分化。