骨质疏松大鼠骨髓基质细胞膜片的体外构建研究

目的探讨骨质疏松大鼠骨髓基质细胞膜片的构建及基本生物学特性。方法建立大鼠绝经后骨质疏松症(PMOP)模型,分离培养骨质疏松大鼠骨髓基质细胞(O-r BMSCs),并以O-rBMSCs为种子细胞构建细胞膜片。通过倒置显微镜、HE染色、扫描电镜及透射电镜对细胞膜片进行形态学检测;以免疫组织化学染色检测细胞外基质相关蛋白的表达情况。结果成功建立了大鼠PMOP模型,体外分离培养的O-rBMSCs具有多向分化潜能。显微镜下可见细胞复层生长,采用富含维生素C的培养基连续培养10 d左右即可获得白色膜样结构,该细胞膜片具有较好的弹性,HE染色及扫描电镜观察发现O-rBMSCs膜片由多层细胞及丰富的细胞外基质组成。透射电镜下可观察到细胞间连接。免疫组织化学染色示O-rBMSCs膜片高表达Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白。结论 O-rBMSCs体外采用富含维生素C的培养基连续培养可构建细胞膜片,该细胞膜片富含细胞外基质,有望应用于骨质疏松机体的组织再生。     

复合脉冲电磁场对去卵巢大鼠骨质疏松预防作用的研究

目的 观察复合脉冲电磁场（PEMFs)对去卵巢大鼠骨质疏松（OP）的预防作用,以寻求防治OP的新途径。方法 3月龄SD大鼠随机分为正常对照组（N）、去卵巢组（O）、去卵巢加苯甲酸雌二醇处理组（E）及去卵巢加PEMFs处理组（EM）,治疗8周后测定骨生物力学、骨密度、骨形态学。结果 生物力学性能测定显示,经PEMFs治疗后股骨最大抗拉强度和椎骨最大抗压强度明显提高,较O组分别增加39．2％、37．9％（P＜0．01）,并超过N组和E组（P＜0．01）;EM组骨密度（BMD）尽管未恢复至正常（P＜0．05）,但与0组相比仍有明显改善（P＜0．01）,且已基本达到E组水平;骨形态学分析发现EM组骨小梁增宽、致密,分布有序,结构优于O组和E组。结论 PEMFs能够增加骱密度,改善骨生物力学性能和骨结构。鉴于其对OP的预防作用主要是通过提高骨质量来实现的,我们认为在PEMFs一定程度上优于苯甲酸雌二醇,是颇具潜力的预防骨质疏松的方法。     

去卵巢大鼠骨质疏松检测指标的实验分析

目的：分析大鼠去势后不同时间体重、骨载荷、骨密度的变化及其相关性，为骨质疏松治疗药物研究中动物模型和实验指标的选择提供参考。方法：5月龄雌性Wistar大鼠50只，随机分为模型组和正常组。两组分别于造模后3、9、13个月检测体重、骨密度和骨载荷。结果进行统计学分析。结果：模型组体重明显高于正常组；两组腰椎载荷和骨密度出现显著性差异的时间均早于股骨；股骨骨密度出现明显下降的时间早于载荷；模型组骨密度低于正常组并与体重的增长呈负相关，模型组载荷低于正常组但与体重的增长呈正相关。结论：去卵巢大鼠体重的变化可对载荷和骨密度产生不同影响，且不同部位的骨组织和不同年龄大鼠，骨量丢失存在差异.     

复方尼尔雌醇片预防去卵巢大鼠骨质疏松的实验研究

目的 探讨复方尼尔雌醇片（Compound nylestriol tablet,CNT；每片含尼尔雌醇0.5mg，左炔诺酮0.15mg)，对去卵巢（OVX）大鼠骨质疏松的预防作用。方法 建立OVX大鼠骨质疏松模型，分组分剂量予以CNT，尼尔雌醇和左炔诺酮治疗14周，观察其对全身，左股骨骨密度校正指数（ADJBMD；adjusted bone mineral density)，骨Ca,P和血清Ca,P,ALP的影响。结果 CNT0.039-0.39mg/kg可增加全身及离体左股骨ADJBMD，且具有剂量依赖性；CNT0.117-0.39mg/kg可增加骨Ca含量，增高血Ca水平（P＜0．05或P＜0．01）。单用CNT中所含相应剂量的尼尔雌醇，也可增加ADJBMD，增加骨Ca含量及增高血Ca水平的作用，但程度不如CNT。结论 CNT对OVX大鼠骨质疏松模型有预防作用，其疗效优于单独使用尼尔雌醇及左炔诺酮。     

去卵巢骨质疏松大鼠骨组织肥大细胞增生及其病理学意义

目的观察肥大细胞在去卵巢骨质疏松大鼠骨组织中的分布,探讨肥大细胞增生与绝经后骨质疏松症之间的关系。方法 3月龄健康雌性SD大鼠20只,随机分为假手术组(Sham组)和去卵巢组(OVX组),卵巢去除后3个月,采集和分离血清样品测定血清雌二醇、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL),收集股骨近端干骺端、胫骨近端干骺端组织样品进行常规组织切片制作和肥大细胞的甲苯胺蓝染色,并计数单位面积肥大细胞的数量。结果 OVX组大鼠血清雌二醇、OPG含量较Sham组显著降低(P0.01),血清ALP、RANKL含量较Sham组显著增高(P0.01);组织化学染色结果显示肥大细胞主要分布于大鼠胫骨、股骨骨髓腔中,OVX大鼠胫骨、股骨骨髓腔肥大细胞数量较Sham组显著增多(P0.01)。结论 3月龄大鼠卵巢去除后3个月呈现骨质疏松症状,骨髓腔肥大细胞数量与骨质疏松呈正相关,可作为绝经后骨质疏松症诊断和治疗的依据。     

去卵巢大鼠骨髓基质细胞beta-catenin蛋白表达变化观察

目的观察卵巢切除大鼠骨髓基质细胞（BMSC）beta-catenin蛋白表达的变化。方法将18只健康3月龄未经产雌性SD大鼠随机平分为去卵巢和假手术两个组。术后14周,取左侧股骨,新鲜分离骨髓细胞,静置贴壁法体外培养9d后,采用间接免疫荧光方法检测BMSC中beta-catenin蛋白表达和定位的变化。取右侧股骨,在双能直线χ-射线骨密度仪上检测骨密度的变化。结果大鼠去卵巢14周后,股骨近端和远端的骨密度显著下降（P〈0.05）,而股骨干的骨密度没有变化（P〉0.05）。在体外培养的假手术组BMSC中,beta-catenin蛋白主要在胞核中表达。与假手术组相比,去卵巢组BMSC核中beta-catenin蛋白表达减少,而胞膜中表达增加。结论beta-catenin蛋白在卵巢切除大鼠BMSC核中表达的下降可能与绝经后骨质疏松症的发生有关。     

GYY4137对去卵巢诱导的骨质疏松大鼠的实验研究

目的探讨GYY4137对去卵巢诱导的骨质疏松大鼠的影响。方法将80只大鼠随机分为4组,采用雌性SD大鼠双侧卵巢全切除术(OVX)或假手术(Sham),建立骨质疏松模型,通过骨密度的检测确认模型建立成功,随后OVX大鼠给予腹腔注射GYY4137和阿仑膦酸钠治疗。测定血浆硫化氢(H2S)、血清碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(OCN)、降钙素、甲状旁腺激素和瘦素水平。采用双能X线骨密度仪测定左侧股骨密度(bone mineral density,BMD)。采用股骨三点弯曲试验获得股骨骨折的最大应力。结果成功建立OVX骨质疏松模型。OVX-GYY组在观察期内注射GYY4137显著提高血浆H2S水平(P 0.05)。12周时OVX-GYY组大鼠股骨密度增加(P0.05),OVX组股骨BMD值明显降低(P0.05)。双侧卵巢切除可引起大鼠生化骨代谢和血浆激素水平的改变(P均0.05)。卵巢切除还可以降低血钙、血磷和降钙素,增加甲状旁腺激素和瘦素。阿仑膦酸钠组和GYY4137组则显著改善上述指标(P均0.05)。结论 GYY4137对去卵巢大鼠骨质疏松有积极的治疗作用。     

大鼠卵巢去势后颌骨和股骨骨髓基质干细胞性能观察

目的观察去卵巢骨质疏松大鼠颌骨及股骨来源的骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力的差异。方法雌性SD大鼠双侧卵巢切除建立骨质疏松模型。培养正常和骨质疏松状态下大鼠颌骨及股骨来源的骨髓间充质干细胞。观察细胞形态,进行MTT和CCK-8实验比较四组干细胞的增殖能力。制备四组干细胞膜片与TCP复合进行大网膜移植,术后6w行组织学观察。结果去卵巢组BMSCs在同等时间条件下与未去卵巢组比较,初期增殖速度无显著性差异,3 d后增殖速度则慢于健康组(P0.05)。颌骨和股骨BMSCs在健康骨质环境下,细胞的OD值各时间段均未出现统计学差异;骨质疏松状态下颌骨来源BMSCs后期的增殖能力明显优于股骨来源的BMSCs(P0.05);四种膜片的大网膜移植结果显示体内移植6w后在的TCP诱导下均可形成不均质的矿化物沉积和纤维样组织穿通,似牙周膜/牙骨质复合体样结构;去卵巢组和未去卵巢组颌骨来源BMSCs组较同等条件下股骨来源BMSCs再生矿化物能力强,牙骨质/牙周膜样复合体的形成更满意。结论骨质疏松对BMSCs的增殖和分化可能存在着部位因素影响且具有一定的时间依赖性。     

红车轴草异黄酮对去卵巢大鼠骨质疏松防治作用的实验研究

目的探讨红车轴草异黄酮对去卵巢大鼠引起的大鼠骨质疏松症的防治作用。方法采用切除大鼠双侧卵巢方法建立大鼠骨质疏松模型，以尼尔雌醇作阳性对照，采用放射免疫法检测实验大鼠血清雌二醇（E2）、促黄体生成素（LH）、骨钙素（BGP）、白细胞介素6（IL-6），用生物化学法检测大鼠血浆抗酒石酸盐酸磷酸酶（TRAP）。同时用定量超声检测大鼠股骨近端超声振幅衰减（BUA）及大鼠股骨骨干重和骨灰重。结果红车轴草总异黄酮可显著提高E2水平，降低LH及BGP、TRAP和IL-6活性，显著提高实验大鼠股骨干重、灰重。同时大鼠股骨近端BUA明显升高。结论红车轴草异黄酮具有提高雌激素作用，可有效抑制骨吸收，降低骨转化率，加强成骨细胞活性，增加骨密度。对去卵巢引起的大鼠骨质疏松症具有明显的防治作用。     

大鼠骨髓基质细胞的体外培养

目的：观察大鼠骨髓基质细胞在体外培养的条件,为骨组织工程学研究奠定一定实验基础。方法：取幼年SD大鼠,处死后分离骨髓,原代培养骨髓基质细胞,传代后分别观察其生长特性,绘制生长曲线,测定分裂指数和贴壁率。结果：大鼠骨髓基质细胞在第7代以前生长形状相对稳定,生长曲线相似;第4d分裂指数最高,为16％;传代后12h贴壁率最高,为90％。结论：本实验方法中,骨髓基质细胞在体外培养条件下,早期生长性状稳定,增殖速度快,适应性强,可作为骨组织工程学研究的种子细胞。     

Propagation of adult rat bone marrow-derived hepatocyte-like cells by serial passages in vitro

Previously, we found that hepatocyte growth factor receptor (c-Met)-and alpha-fetoprotein (AFP)-expressing cells were present in adult rat bone marrow, and that these cells also expressed hematopoietic stem cell markers, such as CD34, Thy-1, and c-Kit. When bone marrow cells were cultured in a hepatocyte growth medium (HGM) with HGF and EGF, colonies composed of polygonal cells resembling mature hepatocytes appeared by 2 weeks and grew very slowly because of overgrowth of stromal cells. At days 34-41, 2-mm2 sheets of hepatocyte-like cells were cut out of their colonies by scratching with an injection needle under observation with a phase contrast microscope, transferred into wells of 24-well plates, and cultured in the HGM medium in the presence or absence of HGF and EGF. When cells reached confluence, cells were detached with trypsin and EDTA and transferred step by step into bigger culture vessels. Thus, hepatocyte-like cells were expanded 1000-fold during less than 4 months. These cells were immunocytochemically stained for albumin and also for AFP and the hematopoietic stem cell markers described above, showing characteristics of oval cells. By RT-PCR, we detected mRNAs of tryptophan-2,3-dioxygenase and tyrosine aminotransferase, markers of hepatocytes at a terminal differentiation stage. The present culture system may be useful for supply of hepatocyte resources for cell transplantation therapy.     

Stimulation of aryl sulfatase in rat peritoneal macrophages exposed to bone in vitro

Rat peritoneal macrophages elicited by injection of thioglycollate were cultured in the absence and presence of non-vital, milled rat bone or latex beads. After 0, 48, 96, and 144 hours exposure to these substances, the levels of aryl sulfatase B were determined. Cells exposed to bone demonstrated a significant (p less than .001) time-dependent increase in the specific activity of aryl sulfatase B. After 144 hours the specific activity of aryl sulfatase in cells exposed to bone was 20 fold higher than that in the 144 hour controls. There were no significant differences in the levels of aryl sulfatase B in controls over time, nor were the levels of enzyme in those exposed to latex beads difference from controls. We conclude that the specific activity of aryl sulfatase B increases when macrophages resorb bone and suggest that this enzyme could be used as a marker or index for bone resportion.     

Stimulation of aryl sulfatase in rat peritoneal macrophages exposed to bone in vitro

Summary Rat peritoneal macrophages elicited by injection of thioglycollate were cultured in the absence and presence of non-vital, milled rat bone or latex beads. After 0, 48, 96, and 144 hours exposure to these substances, the levels of aryl sulfatase B were determined. Cells exposed to bone demonstrated a significant (p<.001) time-dependent increase in the specific activity of aryl sulfatase B. After 144 hours the specific activity of aryl sulfatase in cells exposed to bone was 20 fold higher than that in the 144 hour controls. There were no significant differences in the levels of aryl sulfatase B in controls over time, nor were the levels of enzyme in those exposed to latex beads different from controls. We conclude that the specific activity of aryl sulfatase B increases when macrophages resorb bone and suggest that this enzyme could be used as a marker or index for bone resportion.     

骨髓源性多巴胺前体细胞移植治疗帕金森病模型鼠

目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化为多巴胺(DA)能前体细胞后移植治疗帕金森病(PD)模型鼠的疗效及作用机制.方法 将纯化的BMSCs诱导为DA前体细胞,免疫荧光染色和流式细胞仪检测TH阳性细胞的表达及百分比.将PD大鼠模型随机分为3组,分别注入诱导、未诱导的BMSCs和生理盐水于模型鼠右侧纹状体区.干预后观察行为学的变化,免疫荧光鉴定以及高效液相色谱检测腑内DA含量的变化.结果 诱导后可见TH阳性细胞,且比例可达10.3%.移植治疗6周后诱导组旋转次数变化多于未诱导组(P<0.05)和生理盐水组(P<0.01);诱导组可见BrdU/TH、BrdU/NSE双标阳性的细胞,未诱导组只见BrdU/GFAP双标细胞;BMSCs诱导组DA脑内含量明显高于未诱导组和生理盐水组(P<0.05),而后两组差异无统计学意义(P>0.05).结论 BMSCs诱导为DA前体细胞移植治疗PD模型的疗效总体好于未诱导的BMSCs组和生理盐水组.     

Effect of bisphosphonates on proliferation and viability of mouse bone marrow-derived macrophages

Bisphosphonates (BP) are powerful inhibitors of bone resorption. Their mechanism of action, although still unclear, is now believed to be at the cellular level. In this study we investigated the effects of these compounds on proliferation, induced either by L-cell conditioned medium (CSF-1) or 4-phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) of bone marrow cells (BMC) and on CSF-1-induced proliferation and viability of bone marrow derived macrophages (BMDM phi). BMC proliferation, measured by [3H]-TdR incorporation or by clonal assay in soft agar, was significantly inhibited by 4-amino-1-hydroxybutylidene-1,1-bisphosphonate (AHBuBP) and 3-amino-1-hydroxypropylidene-1,1-bisphosphonate (AHPrBP) at 2.5 x 10(-7) M and by dichloromethylenebisphosphonate (Cl2MBP) at 2.5 x 10(-6) M. This inhibitory effect was also confirmed on the proliferation, measured by [3H]-TdR incorporation, of BMDM phi. In the absence of CSF-1, the viability of this latter cell population, estimated by DNA content per well and lactate dehydrogenase (LDH) released into the medium, was affected in the following order of concentrations: Cl2MBP, 1.0 x 10(-4) M; AHBuBP, 5.0 x 10(-5) M; and AHPrBP, 2.5 x 10(-5) M. Since osteoclasts and macrophages might share a common early progenitor cell, probably under the control of CSF-1, the effect exerted by BP on the proliferation of the macrophage precursors may also be extended to the osteoclast precursors.     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的:探讨分离骨髓间充质干细胞(MSCs)并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据.方法:抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[转化生长因子(TGF-β2)10ng/ml、地塞米松10-7mol/L、维生素C 50μmol/L],经7、14、21 d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.将诱导细胞与软骨支架材料--聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸(CPP/PLLA)复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况.结果:诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21 d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀.诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长.结论:体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞.     

成人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的 建立临床成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为软骨细胞的途径。方法抽取成人骨髓，Percol密度梯度离心法进行体外培养，贴壁细胞传代，取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂地塞米松、维生素C和不同剂量转化生长因子-β(TGF-β)，培养16d后,在倒置显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝染色蛋白多糖，逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学(SABC法)检测Ⅱ型胶原表达，诱导后MSCs与新型材料聚乳酸和羟基乙醇共聚物(PL-GA)复合。结果 Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的。MSCs；5、10ng TGF-β诱导分化的MSCs生长迅速。呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性，MSCs对材料PL-GA黏附力强。结论 可以从成人骨髓中培养出MSCs，并可定向诱导分化为软骨细胞，5～10ng TGF-β为最佳诱导剂量，成人MSCs可用作临床自体软骨组织工程种子细胞。     

降钙素基因相关肽对大鼠骨髓单核巨噬细胞破骨分化作用的实验研究

目的 通过体外实验研究外源性降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP)对大鼠骨髓单核巨噬细胞 (BMMs)破骨分化能力的影响,为CGRP在抗骨质疏松治疗方面的应用提供理论依据。方法 采用差速贴壁的方法分离出SD大鼠髓腔内单核巨噬细胞,原代培养并传代,在培养体系中添加含不同浓度CGRP (实验组：10–7 mol/L、10–8 mol/L、10–9 mol/ L;对照组：无CGRP)的破骨诱导液,对前体细胞进行破骨诱导7天后进行相关实验检测,分别采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色）观察破骨细胞的生成能力;用RT-PCR方法检测破骨细胞系特征性基因（RANK、TRAP、NFATc1); Western-blot检测破骨特征性TRAP和RANK蛋白的表达;骨磨片甲苯胺蓝染色检测诱导的破骨细胞的骨吸收功能。结果TRAP染色显示 CGRP各浓度组镜下成熟破骨细胞的个数显著低于对照组,有统计学差异(P <0.05)并随CGRP浓度的增高成熟破骨细胞数减少,CGRP组间亦差异明显(P <0. 05);RT-PCR检测破骨特征性RANK、TRAP、NFATc1 mRNA和Westem-blot测破骨特征性TRAP、RANK蛋白的表达各CGRP组均低于对照组(P < 0. 05);骨磨片破骨细胞甲苯胺蓝染色后单倍视野下CGRP组破骨陷窝数量也明显少于对照组(P < 0. 05),且与药物组浓度与陷窝数量呈负相关性。结论 CGRP能够抑制BMMs向破骨方向的分化,为CGRP抗骨质疏松的治疗提供理论支持。