机械分离成人尸体胰腺提高胰岛数量和质量

目的通过机械分离胰腺的方法,提高成人胰岛数量和质量。方法切取8个成人尸体胰腺,并保存于4℃UW液中。首先经主胰管插管灌注复合胶原酶溶液,使胰腺膨胀,然后将胰腺剪切成5~8块,放入Ricordi室中,于37℃下机械震荡消化。收集的胰岛溶于100mlUW液中,放置30min。先将Ficoll液泵入COBE2991细胞分离仪中,然后泵入UW/胰岛制剂,最后加入M199液冲洗。收集纯化的胰岛,计算胰岛当量(IEQ)和纯度,检测胰岛的活性。结果热缺血时间为0~1min,冷缺血时间0.5~4h。纯化前收集的胰岛数量平均为(376.7±50.2)×103IEQ,纯化后为(378.6±56.7)×103IEQ;胰岛收获率平均为(86.8±9.4)%,镶嵌的胰岛平均占(11.0±2.7)%;收获的胰岛纯度平均为(88.3±5.1)%;经AO-PI染色后检测胰岛的活度为(91.3±7.8)%。胰岛素分泌指数平均为5.87±0.81。结论通过机械分离胰腺的方法,可以获得更多的胰岛数量和更高的胰岛活性,适合用于临床移植。     

家兔胰岛分离纯化方法的改进

目的介绍一种新的家兔胰岛分离纯化方法并进行纯化后胰岛的外观、活性和胰岛细胞团表面结构等质量分析。方法雄性日本大耳白,采用2 mg/m L胶原酶V逆行胰管灌注和消化,并用Hanks液洗涤,用Histopaque-1119、Histopaque-1077密度梯度离心进行胰岛纯化,DTZ、FD-PI染色鉴定胰岛纯度和活性,扫描电镜观察纯化后胰岛表面结构。结果家兔胰管开口于小肠,纯化得到家兔胰岛外形圆整,纯度90%,活性(87.4±5.9)%,纯化前胰岛当量为(1 874.8±464.5)IEQ,纯化后胰岛当量为(1 254.8±235.8)IEQ;扫描电镜结果显示胰岛细胞团表面有被膜,但部分胰岛被膜被消化。结论采用此方法可快速得到纯度高、活性好且结构完整的家兔胰岛,为进一步进行家兔胰岛体外质量及体内移植研究奠定了基础。     

不同器官保存液对成人胰岛分离、纯化及功能的影响

目的探讨不同器官保存液保存胰腺对胰岛分离、纯化及功能的影响。方法以成人胰腺为研究对象,分别以高渗枸橼酸钾溶液(HCA液)与威斯康新大学器官保存液(UW液)灌洗、保存胰腺,进行胰岛分离及纯化,比较两组分离、纯化后收获的胰岛数及胰岛当量数(IEQ),并在体外评价其功能。结果两组在胰腺重量、热缺血时间、冷缺血时间没有明显差异的情况下,胰腺分离、纯化后所获得的胰岛数及胰岛当量数的差异无显著性(P>0.05),纯化后的胰岛细胞在体外低糖与高糖刺激下,其胰岛素的分泌量及C肽的释放量的差异也无显著性(P>0.05);两个组胰岛细胞的活率均在85%以上。结论在胰岛移植中,可以使用HCA液作为胰腺保存液。     

国产胶原酶在小鼠胰岛分离中的效果研究#br#

目的 研究一种国产胶原酶在小鼠胰岛分离中的分离效果,探索该胶原酶在胰岛分离中应用的 可行性。方法 将国产胶原酶分别配成不同浓度的胶原酶溶液和含中性蛋白酶的胶原酶的溶液,经胰管逆行灌注胶原酶的方法进行小鼠胰岛分离,采用Ficoll液对胰岛进行纯化,计数所得的胰岛细胞团,培养 6 h后检测活性,对最佳分离结果的胰岛做同系糖尿病小鼠的肾被膜下移植,监测术后血糖和进行组织学 检查,以进口Sigma胶原酶V为对照。结果 国产胶原酶在小鼠胰腺消化时间、所得胰岛数量和活性效果 上跟进口胶原酶V有一定差距（P＜0.01）,但含中性蛋白酶的国产胶原酶组在小鼠胰岛分离数量和当量上 与进口胶原酶组无差异（P＞0.05）,分离的胰岛在体内移植后降血糖效果与进口胶原酶组无差异（P＞0.05）。 结论 国产胶原酶结合中性蛋白酶可用于小鼠胰岛的分离。     

实验大鼠胰岛分离移植技术方法的比较分析

目的 探索高效的大鼠胰岛分离移植技术方法.方法 应用Wistai-Furth大鼠,于体内或体外胶原酶经胰管灌注膨化胰腺,联合不同密度Ficoll液或Histopaque液纯化胰岛细胞,评估胰岛的数量、纯度、胰岛当量以及肾被膜下胰岛移植的有效性.结果 体外经胰管灌注膨化胰腺结合Histopaque液纯化提取胰岛的数量、纯度和胰岛当量值均显著高于体内灌注组各数值(P＜0.01),其提取时间无显著差别.1000个胰岛细胞移植进入左肾被膜下,有效的逆转了糖尿病大鼠高血糖,其远期糖耐受结果优于500和800个胰岛细胞移植组.结论 体外灌注膨化消化胰腺结合Histopaque液纯化胰岛的分离方法是一种满意的分离技术.1000个胰岛细胞是保证肾被膜下胰岛移植成功的最低有效数量.     

一种快速分离纯化小鼠胰岛的方法

目的 介绍一种快速分离纯化小鼠胰岛的方法及进行纯化后胰岛的活性、完整性和胰岛内结构的质量分析.方法 雄性ICR小鼠,采用2 mg/mL胶原酶V灌注和消化,并用Hanks液快速洗涤,用Histopaque（R）-1077和Histopaque（R）-1119密度梯度离心对胰岛进行纯化,用手工方法进行胰岛挑选,DTZ、FD-PI染色鉴定胰岛纯度及其活性,透射电镜观察胰岛内的结构.结果 胰岛开始消化至手工挑选前过程耗时＜ 25 min,每只小鼠得到胰岛数量为：128±36,当量为：145±42,纯度＞90％.透射电镜显示胰岛内部血管仍有损伤.结论 采用此方法可快速得到数量较多、结构较完整的小鼠胰岛,且活性高,为进一步进行胰岛的体外质量研究及体内移植奠定了基础.     

成人胰岛大容量分离技术的改进及胰岛功能检测

目的 通过对人胰岛分离技术的改进以获得大量高活力胰岛并检测其功能,为利用同种异体胰岛移植治疗1型和部分2型糖尿病提供理论依据和技术基础。方法 采用改良的自动分离技术连续分离28例人胰岛,然后用连续性密度样度离心法纯化胰岛。胰岛收获量以国际标准的胰岛当量(islet equivalent,IEQ)表示。胰岛功能的测定分别为体外测定胰岛的胰岛素／DNA比率;静止葡萄糖刺激试验(SGS)及将胰岛移植至糖尿病裸小鼠的体内胰岛功能鉴定并随后进行腹腔糖耐量试验,连续测定移植鼠血糖水平及其体内C肽浓度。结果 28例成人胰腺分离的胰岛收获量为5000～1030000IEQ／胰腺,平均为291635IEQ／胰腺,前13例平均每个胰腺收获49123IEQ,平均每克组织收获846IEQ。平均纯度为87％,随着技术的改进后15例的分离结果则分别为：平均每个胰腺501813IEQ,平均每克组织7003IEQ,平均纯度89％。体外胰岛素刺激试验结果表明分离纯化后的人胰岛有正常功能,将12次分离得到的胰岛分别移植至34只糖尿病裸鼠肾包膜下,其中29只糖尿病裸鼠于12h内血糖恢复正常且糖耐量试验接近正常鼠,血中C肽水平亦接近正常鼠。结论 采用改进的人胰岛分离方法,可以获得大量高活力的具有正常功能的胰岛,为同种异体胰岛移植用于临床奠定了必要的实验基础。     

α-1抗胰蛋白酶减轻人胰腺外分泌细胞对移植胰岛的损伤

目的 探讨胰腺外分泌细胞对胰岛移植物的损伤作用及α-1抗胰蛋白酶(A1AT)对胰岛β细胞的保护作用.方法 (1)体内实验:消化成人尸体部分胰腺,人工挑选胰岛,并收集胰腺外分泌细胞.链脲霉素腹腔注射诱导Balb/c-Nu裸小鼠成为糖尿病小鼠.对照组(n=6)小鼠每只于左肾包膜下移植成人胰岛250个;共同移植组(n=7)小鼠每只分别于左肾包膜上、下极同时植入胰岛250个和等体积的胰腺外分泌细胞.持续检测受鼠血糖,28d后切取左肾,以免疫组织化学染色(SP法)观察左肾包膜下抗淀粉酶抗体的表达,并继续检测血糖.(2)体外实验.纯化胰岛组(n=6),每孔250个胰岛进行培养;非纯化胰岛组(n=6),每孔250个胰岛和等体积外分泌细胞同时培养;非纯化胰岛+A1AT组(n=6),每孔250个胰岛和等体积外分泌细胞同时培养,并加入A1AT0.5 mg/ml.48 h后,测定各孔胰岛中胰岛素含量和上清液中胰蛋白酶浓度.结果 (1)胰岛移植后,对照组和共同移植组受鼠血糖均逐步恢复正常.共同移植组较对照组血糖恢复正常时间延迟,组间比较差异有统计学意义(P＜0.01).切取受鼠左肾后5 d(移植后33 d),两组受鼠血糖均＞21 mmol/L.共同移植组可见肾包膜下有大量抗淀粉酶抗体阳性细胞,对照组少见.(2)纯化胰岛组胰岛素含量为(2.02±0.33)μg/孔,非纯化胰岛组为(1.13±0.27)μg/孔,非纯化胰岛+A1AT组为(1.68±0.17)μg/孔,各组间差异均有统计学意义(P＜0.01).纯化胰岛组胰蛋白酶浓度为(1.03±0.25)ng/ml,非纯化胰岛组为(6.92±1.21)ng/ml,非纯化胰岛+A1AT组为(3.23±0.55)ng/ml,各组间差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 胰腺外分泌细胞与胰岛同时移植会延迟植入胰岛功能恢复正常的时间,这与腺泡细胞内胰蛋白酶被激活、释放有关;在胰岛、胰腺外分泌细胞共同培养时加入A1AT,可以缓解腺泡细胞分泌的蛋白酶对胰岛的破坏.     

输注胰岛抗原特异性Treg细胞延长同系NOD小鼠移植胰岛的存活时间

目的 探讨输注胰岛抗原特异性调节性T淋巴细胞(Treg细胞)对非肥胖糖尿病(NOD)小鼠同系胰岛移植物存活时间的影响.方法·以未成熟树突状细胞(imDC)联合谷氨酸脱羧酶-65在体外诱导童贞T淋巴细胞分化成胰岛抗原特异性Treg细胞.以已发生糖尿病的NOD小鼠为受者,将分离得到的尚未进展为糖尿病的NOD小鼠的胰岛(500胰岛当量)移植至受者的肾包膜下,对照组不行移植,只观察血糖变化;单纯胰岛移植组只进行胰岛移植,不输注胰岛抗原特异性Treg细胞;实验组于术前1d静脉输注1×106个胰岛抗原特异性Treg细胞,然后进行胰岛移植.术后检测受者的血糖,以判断移植胰岛的存活时间,观察胰岛移植物的病理学变化.结果 对照组血糖持续高于11.1 mmol/L;单纯胰岛移植组小鼠的血糖于术后1～2 d降至正常,到7～17d时开始陆续升高,并维持在术前水平,移植物存活时间为(12.2±2.6)d;实验组小鼠的血糖于术后1～2 d降至正常,至第27天开始有小鼠血糖升高超过11.1 mmol/L,第43天时,所有小鼠的血糖均超过11.1mmol/L,移植物的存活时间为(35.2±4.3)d,明显长于单纯胰岛移植组(P＜0.01).单纯胰岛移植组的移植胰岛有明显的淋巴细胞浸润,并伴有胰岛细胞严重破坏,胰岛素染色未见完整的胰岛存在,仅有极少量残存的分泌胰岛素的胰岛细胞;实验组第15天时移植胰岛形态完整,仅有少量淋巴细胞浸润,分泌胰岛素的胰岛大量存在.结论 体外诱导产生的胰岛抗原特异性Treg细胞可以延缓自身免疫系统对移植胰岛的破坏,明显延长NOD小鼠移植胰岛的存活时间.     

影响成人高质量胰岛分离的关键因素分析

目的探讨在胰岛分离过程中影响胰岛分离数量和活性的关键因素,以期进一步提高胰岛移植效果。方法通过分组观察以下因素对胰岛分离效果的影响:(1)胰腺重量和所用酶的量的比例;(2)胰腺消化过程中的震荡频率和幅度;(3)DNaseI 对胰岛分离的影响;(4)胰腺消化后的残余组织量与进行纯化的次数的关系;(5)消化下来的组织在 UW 液中放置的时间.结果当胰腺重量<70g,给予分散酶0.25g;胰腺重量70～120g,给予分散酶0.5g;胰腺重量>120 g,给予分散酶0.75g;消化10min 后震荡频率为100次/min,垂直幅度2～3 cm;向稀释液中加入 DNaseI;一次纯化过程加入消化胰腺组织最大量不超过20g;将纯化前的胰岛在 UW 液中放置30 min,获得纯化后胰岛数在(4459.28±704.51)～(5018.46±952.36)IEQ/g 胰腺组织,胰岛收获率在(79.06±12.53)%～(86.03±16.12)%,胰岛素刺激指数在(5.21±1.55)～(6.91±2.03),均高于对照组。结论消除上述关键影响因素的负面影响,可以明显提高胰岛分离数量和活性。