成人骨髓间充质干细胞的培养及其向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的探讨在体外诱导成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的方法。方法采用梯度离心法和全骨髓法,利用含血清的DMEM培养基培养成人骨髓间充质干细胞,以β-巯基乙醇诱导其向神经元样细胞方向分化。应用免疫细胞化学技术对培养细胞及其分化细胞进行鉴定。结果骨髓细胞培养至第10d时,全骨髓法收获的细胞数为(1.73±0.44)×107/ml,而梯度离心法收获的细胞数为(7.65±0.52)×107/ml,其差异有统计学意义(P<0.01);但两种方法所得细胞的生物学特性没有差别。骨髓间充质干细胞经β-巯基乙醇诱导后细胞形态发生改变,伸出突起并交织成网;免疫细胞化学法检测显示54.76%±3.65%的细胞表达神经元特异性蛋白NSE,同时36.28%±4.27%的细胞表达神经胶质细胞特异性蛋白GFAP。结论梯度离心法较全骨髓法收获细胞数量大。在体外条件下,利用β-巯基乙醇和适宜的培养液可使骨髓间充质干细胞定向分化为神经元。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化研究的体外实验

目的 分离培养较高纯度大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,检测其多向分化潜能.方法 采用密度梯度离心结合差速贴壁法分离培养大鼠BMSCs,观察细胞形态,检测表面标志物CD34、CD44、CD45、CD90表达情况,及其成骨、成脂、成神经诱导后茜素红染色、油红O染色和NSE、GFAP免疫荧光染色情况.结果 细胞呈典型的成纤维细胞样形态,CD44和CD90呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达,细胞纯度＞98%.成骨、成脂、成神经诱导后,茜素红染色、油红O染色、NSE和GFAP免疫荧光均为阳性.结论 密度梯度离心结合差速贴壁法可分离、培养出高纯度的大鼠BMSCs,该细胞具有成脂、成骨、成神经多向分化潜能,是脊髓损伤修复的一种较理想的种子细胞.     

骨髓间充质干细胞对异种T淋巴细胞增殖的影响及其机制

目的 研究骨髓间充质干细胞(MSCs)对异种混合T淋巴细胞增殖的影响及其机制.方法 采用密度梯度离心法分离豚鼠MSCs;免疫组织化学法检测MSCs膜表面CD45和CD44的表达;流式细胞术检测MSCs周期;CCK-8法检测和绘制MSCs的生长曲线;观察MSCs和其培养上清对体外异种淋巴细胞混合培养的影响.结果 MSCs膜表面CD45表达阴性、CD44表达阳性;分析MSCs周期显示,MSCs中20%左右处于S期、G2期和M期,其余80%左右均处于G0期和G1期.MSCs和其培养上清均能明显抑制异种T淋巴细胞混合培养的增殖反应(P<0.05),加入白细胞介素2(IL-2)能逆转MSCs的抑制作用(P<0.05).结论 MSCS的鉴定可根据细胞形态.膜表面标志物来确定.MSCS及其培养上清对异种淋巴细胞混合培养的增殖反应有显著的抑制作用.     

小鼠骨髓间充质干细胞移植异体睾丸的研究

目的:研究小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)移植异体睾丸。方法:①分离5~6周龄的BALB/c小鼠胫骨、股骨,冲出骨髓,用Percoll密度梯度离心法和贴壁法分离、培养、纯化MSCs。②取第3代MSCs,用Hoe-chest33342标记并观察,制备细胞悬液。③用睾丸网注射法将标记的MSCs移植入异体小鼠睾丸内,于各时相点取睾丸组织,在3个位点连续制作快速冰冻切片,镜下观察。结果:①传至3代即可得到数量较多的纯化的MSCs。②在荧光显微镜下,标记的MSCs细胞核呈亮黄色。③用睾丸网注射法行小鼠MSCs移植异体睾丸成功,未见免疫排斥反应发生。移植后1、3d,只在中间的切片上见到MSCs,细胞核呈亮黄色,两侧的切片未查到MSCs,移植后1d细胞较集中,移植后3d细胞散在分布;移植后6、9、12d,3个位点的切片均见MSCs,部分MSCs排列呈管状;移植后15、18d,MSCs的核荧光有所减弱;移植后21d,荧光消失。结论:用睾丸网注射法将小鼠MSCs移植异体睾丸获得成功,未见免疫排斥反应发生,移植后的MSCs存活。     

兔骨髓间充质干细胞分离方法的比较

目的：建立并优化骨髓间充质干细胞分离纯化的方法。方法：从兔的胫骨中抽取骨髓，分别通过直接培养、经Fichu—Hypeque和Perool两种分离介质进行分离后再培养的方法，收获所培养的细胞，然后测量间充质干细胞所占的比例。结果:直接培养、经Fichu—Hypaque、Perool分离后再培养的细胞中，骨髓间充质干细胞比例分别为67．3％、83．6％、93．4％。结论:采用Perool分离方法可以更好的提高MSCs的纯度，提高MSCs的培养效率。     

诱导骨髓间充质干细胞表达软骨细胞表型

目的：诱免骨髓间充质干细胞达软骨细胞表型，方法：抽取兔骨髓，经密度梯度离心和粘附分离得到MSCs，用生长因子诱导，考察细胞软骨骨特异性基质的表达水平，结果：TGF－β1，IGF－I和维生素C结合可促进MSCs表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原mRNA，但并未促进成骨特异性的碱生磷酸酶合成和钙盐沉积。结论：TGF－β1，IGF－I和维生素C结合诱导可促进MSCs增殖，表达软骨细胞表型，而不产生诱导成骨效应。     

骨髓间充质干细胞促进“创面”愈合的实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）促进创面愈合的作用和用于创面修复的可行性。方法：密度梯度离心法分离培养正常人骨髓间充质干细胞（hMSCs），流式细胞仪检测培养第二代细胞CD14、CD29、CD34、CD44、CD45和CD106抗原表达以鉴定MSCs。实验分3组：直接共培养组（n=8）为hMSCs（1×10^5/ml）与人表皮角质形成细胞（HEKa）直接接触共培养；间接共培养组（n=7）为在transwell透明聚碳酸酯膜上层加入hMSCs细胞悬液[（2-3）×10^5个细胞）]，下层接种HEKa，间接共培养；单纯HEKa培养组（n=7）单纯培养HEKa。在倒置显微镜下刮擦生长融合成片的HEKa细胞以制备宽度为100μm的“表皮创面”模型。模型制备后24、48、72h，倒置相差显微镜下计数每高倍视野越过创缘迁移到创面的HEKa数，并用SigmaScan Pro5软件计算创面愈合率，检测HEKa细胞吸收脱氧胸腺嘧啶核苷的放射活性，判定HEKa细胞的分裂增殖活性。结果：流式细胞仪检测第二代hMSCs CD29、CD44和CD106抗原阳性（分别为94.81%、95.38%、97.40%），CD14、CD34、CD45抗原阴性（分别为1.23%、3.05%、2.64%）；直接培养组、间接培养组和单纯HEKa培养组越过创缘进入创面的细胞伤后24h分别有（10.00±0.25）、（5.50±0.20）和（5.20±0.35）个/高倍视野；48h分别有（55.30±0.22）、（27.00±0.34）和（26.50±0.25）个/高倍视野；72h分别有（110.50±0.45）、（42.50±0.50）、（40.20±0.38）个/高倍视野。3组伤后72h创面愈合率分别为（60.00±0.04）%，（35.00±0.01）%、（33.00±0.05）%。脱氧胸腺嘧啶苷掺入培养基法表明hMSCs对体外共培养HEKa细胞的增殖作用分别为（1650±270）cpm/10^5 cell、（1240±210）cpm/10^5 cell、（1180±220）cpm/10^5 cell。上述各指标直接共培养组与单纯HEKa培养组比较，差异有显著性（P〈0.01），而间接培养组与单纯HEKa培养组间差异无显著性（P〉0.05）。     

骨髓间充质干细胞减轻体外扩增的脐血造血干细胞衰老的作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血造血干细胞体外扩增及抗细胞衰老的作用.方法 从新鲜脐血中分离出CD34+细胞,分别接种在含或不含MSC及细胞因子的培养体系中,取培养10d后的造血干细胞,分别用于细胞计数,集落分析,流式细胞仪检测表面标记,并对培养后的细胞进行β-半乳糖苷酶活性检测,采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测衰老相关基因p16INK4amRNA的表达.结果 体外培养10d后,MSC组、细胞因子组及MSC+细胞因子组对脐血总有核细胞(TNC)、CD34+细胞的体外扩增及克隆形成能力均有支持作用,以MSC+细胞因子组最为明显(P＜0.05),其扩增倍数分别达到(45.3±6.8)倍、(38.4±5.8)倍及(50.2±4.2)倍,但衰老细胞比例及p16INK4amRNA表达倍数则以MSC组最低,MSC+细胞因子组次之,细胞因子组两项指标均为最高(P＜0.05).结论 MSC能更好保护体外扩增的脐血造血干细胞,减少细胞衰老的发生,MSC+细胞因子是有效扩增脐血造血干细胞并保持细胞干性的更理想方法.     

骨髓间充质干细胞及其诱导成骨的研究进展

间充质干细胞(MSCs)是一种多潜能成体干细胞,主要存在于骨髓,还存在于胚胎时期间充质来源的骨外组织[1],如皮肤成纤维细胞、脂肪干细胞、骨骼肌的卫星细胞和血管内皮细胞等。骨髓MSCs(BMSCs)是骨髓基质的组成成分,体外分离培养后,在一定的诱导条件下,BMSCs具有向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多向分化的能力[2-3],这些细胞经过20～30个培养周期,仍能保持多向分化潜能。无论是自体的还是同种异源的BMSCs,一般都不会引起宿主的免疫反应。BMSCs以其来源充足、取材简便、对供体损伤小、易于分离培养、体外增殖能…     

成人骨髓间充质干细胞体外低氧培养及生物学特征

目的建立人骨髓间充质干细胞（human marrow mesenchymal stem cells,hMSCs）体外低氧培养及向成骨细胞分化的生物模型,研究其生物学特征,为骨组织工程提供实验依据。方法采用人淋巴细胞分离液分离健康成人hMSCs,DMEM-LG（含20%胎牛血清）中培养,10～14d后传代培养。取第2代细胞,根据培养氧浓度及培养基类型分为4组：正常氧组（20%O2加DMEM-LG,A组）、低氧组（1%O2加DMEM-LG,B组）、正常氧成骨诱导组（20%O2加条件培养基,C组）及低氧成骨诱导组（1%O2加条件培养基,D组）,通过细胞计数、细胞增殖测定（MTT法）、集落形成检测、RT-PCR检测、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性检测及茜素红染色,研究低氧环境对hMSCs生物学行为的影响。结果与A组相比,B组及D组中的hMSCs有较高的增殖速度,并且不受条件培养基的影响,比较差异有统计学意义（P〈0.01）。B组中的hMSCs生成的集落逐渐增多,A组9d后生成的集落数基本不发生变化。D组培养的hMSCs的ALP活性逐渐增高,但明显低于C组,两者差异有统计学意义（P〈0.01）。定量RT-PCR检测,C组ALP、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白及骨粘连蛋白mRNA表达量明显增加（P〈0.01）。培养4周后,与其他3组相比,C组可见到明显的钙盐沉积和染成红色的钙结节。结论低氧使hMSCs增殖率增加,集落形成能力增强,抑制向成骨细胞分化。     

骨髓间充质干细胞对胶质瘤趋向性的研究

目的 利用体内、外迁移模型观察骨髓间充质干细胞对胶质瘤的趋向性。方法 体外应用圆环柱细胞共培养体系、Matrigel细胞球体共培养体系和Transwell双室培养体系模型观察BMSCs向胶质瘤细胞的趋瘤效应。建立颅内c6胶质瘤模型，将预先标记BrdU的BMSCs注射人对侧脑半球。免疫学方法检测BMSCs在胶质瘤内的分布。结果 3种体外模型从不同角度显示了BMSCs的胶质瘤趋向性的存在。体内经对侧注射的BMSCs向肿瘤侧发生迁移，主要分布于包括浸润区和肿瘤小灶在内的肿瘤与正常脑组织交界部位。结论 BMSCs具有明显的胶质瘤趋向性，可作为治疗胶质瘤新的侯选的基因药物投递系统。     

Differentiation of adult human bone marrow mesenchymal stem cells into Schwann-like cells in vitro

Bonemarrowmesenchymalstemcells, alsocalledbonemarrowstromalcells (BMSCs), areisolatedfrombonemarrow, andtheycanmultiplyinvitroanddifferentiateintoosteogeniccells,chondrocytes, adipocytes, musclecellsandneuralcells.1 5 RecentstudieshavedemonstratedthatBMSCsfromadultratscoulddifferentiateintoSchwann likecellsinspecificconditions.6, 7 BMSCsmayhavepotentialapplicationforautologousneuraltransplantation. Inthisstudy, wetrytoinvestigatethedifferentiativecapabilityofadulthumanBMSCsintoSchwann l…     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学性状的研究

目的：分离培养兔骨髓间充质干细胞，对其生物学性状进行观察。方法：用密度梯度离心法与贴壁培养法相结合，分离兔骨髓间充质干细胞，进行体外培养扩增，绘制其生长曲线，用倒置显微镜、细胞爬片、扫描电镜、透射电镜观察细胞的生物学性状。结果：密度梯度离心后，活细胞比例在95％以上，贴壁培养的细胞呈纺锤形，细胞增殖力强，平均倍增时问为32h，细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降。结论：密度梯度离心与贴壁培养相结合可以提高细胞分离效率。体外培养的兔骨髓问充质干细胞生长稳定，增殖力强，可以作为组织工程的种子细胞。     

体外负压培养对骨髓间充质干细胞成骨活性的影响

目的：探讨体外负压培养对骨髓间充质干细胞（bone marrow derived stroma cells,BMSCs）成骨活性的影响。方法：取第3代BMSCs分为实验组和对照组,实验组进行间歇性负压培养,设置压力为17kPa,每次30min,每日4次,干预2周;对照组于普通CO2培养箱中常规培养。倒置显微镜下观察细胞形态,检测ALP活性,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原的表达,RT-PCR检测2周后以及终止负压后1、2、3d骨保护素（osteoprotegerin,OPG）mRNA和骨保护素配体（osteoprotegerin ligand,OPGL）mRNA表达水平。结果：诱导2周后,BMSCs呈现出显著的成骨细胞特性,与对照组比较,ALP活性显著增加,Ⅰ型胶原表达阳性,实验组细胞OPG mRNA表达水平显著提高,OPGL mRNA表达水平显著降低,且差异均有统计学意义（P〈0.05）。负压终止后3d,两组细胞OPG mRNA和OPGL mRNA表达水平差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：体外负压培养可以提高BMSCs成骨活性。     

人脂肪组织与骨髓来源间充质干细胞生物学特性的比较

目的 比较脂肪来源间充质干细胞(ADAS)和骨髓来源间充质干细胞(BMSC)的生物学特性.方法 分离ADAS和BMSC,比较它们的表型、细胞倍增时间及分泌的相关因子,分别检测它们对T淋巴细胞的活化、细胞周期、增殖及凋亡的作用.结果 BMSC和ADAS在细胞表型上类似,只有CD106的表达有差异;在增殖速率上,ADAS群体倍增时间为28 h,显著高于BMSC的39 h(P＜0.05);ADAS和BMSC同样具有抑制T淋巴细胞增殖的能力,在有丝分裂原刺激和混合淋巴细胞反应的T淋巴细胞增殖中,这种抑制作用都具有剂量依赖性,在1:2时抑制作用极强,但是在1:100时这种抑制作用基本消失;在共培养时,ADAS和BMSC都可以使绝大多数的T淋巴细胞被抑制在G0/G1期,同时也可以抑制T淋巴细胞的早期活化,但是ADAS的上述作用均比BMSC弱;ADAS并不具有抑制T淋巴细胞凋亡的作用,而在TH0细胞向TH 1细胞或TH2细胞分化中所起的作用基本相似,主要抑制TH0细胞向TH1细胞(表达IL-2和IFN-γ的T淋巴细胞)的分化,而对向TH2细胞(表达IL4和IL-10的T淋巴细胞)分化没有明显的影响.结论 ADAS与BMSC具有类似的免疫调节作用,在相同体积的脂肪组织中能够得到的干细胞前体细胞的数量是骨髓组织的10倍以上,因此ADAS较难以获得的BMSC更有广泛的应用前景.     

体外诱导骨髓间质干细胞向软骨方向分化的研究

目的　探讨体外诱导骨髓间充质干细胞 (BMSCs)向软骨方向分化的条件和方法。方法　抽取兔股骨骨髓 ,用密度梯度离心和贴壁分离法分离BMSCs ,分别在高密度 (1× 10 6/ml)和低密度 (1× 10 4/ml)培养条件下用转化生长因子 β1(TGF β1)诱导BMSCs向软骨方向分化。倒置显微镜、透射及扫描电子显微镜观察细胞 ,用免疫组织化学、原位杂交、特殊染色方法检测Ⅱ型胶原及软骨基质成分的表达。结果　高密度诱导的BMSCsⅡ型胶原免疫组织化学阳性率为 89.2 %,Ⅱ型胶原原位杂交阳性率为 82 .6%,黏多糖特殊染色阳性 ,低密度诱导的BMSCsⅡ型胶原免疫组织化学阴性 ,Ⅱ型胶原原位杂交阳性率为 3 .8%,黏多糖特殊染色阴性。结论　TGF β1可以诱导BMSCs向软骨方向分化 ,细胞密度是BMSCs分化的重要影响因素。     

骨髓间充质干细胞输对移植肾的保护作用

目的体外培养大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），探讨其对移植肾的保护作用。方法无菌条件下取大鼠股骨、胫骨，用直接贴壁法分离纯化MSCs，体外扩增，在注射MSCs的基础上，行同种异体肾移植，实验大鼠分为注射大鼠骨髓MSCs肾移植组（Ⅰ组）和单纯肾移植组（Ⅱ组），环孢素A治疗肾移植组（Ⅲ组）术后5d结扎受体右肾动脉（左侧为移植肾）；观察右肾动脉结扎术后受体存活时间，检测右肾术后移植肾的形态学变化，肌酐水平。结果Ⅰ组、Ⅲ组大鼠生存期（15．50±6．35）d和（18．50±5．97）d较Ⅱ组（6．50±3．11）d明显延长，且前者移植肾形态学观察和功能状态均明显优于后者。结论骨髓间充质干细胞在体外很容易分离培养和扩增，骨髓间充质干细胞对早期移植肾具有保护作用。     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的:探讨分离骨髓间充质干细胞(MSCs)并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据.方法:抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[转化生长因子(TGF-β2)10ng/ml、地塞米松10-7mol/L、维生素C 50μmol/L],经7、14、21 d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.将诱导细胞与软骨支架材料--聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸(CPP/PLLA)复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况.结果:诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21 d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀.诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长.结论:体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞.     

成人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的 建立临床成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为软骨细胞的途径。方法抽取成人骨髓，Percol密度梯度离心法进行体外培养，贴壁细胞传代，取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂地塞米松、维生素C和不同剂量转化生长因子-β(TGF-β)，培养16d后,在倒置显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝染色蛋白多糖，逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学(SABC法)检测Ⅱ型胶原表达，诱导后MSCs与新型材料聚乳酸和羟基乙醇共聚物(PL-GA)复合。结果 Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的。MSCs；5、10ng TGF-β诱导分化的MSCs生长迅速。呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性，MSCs对材料PL-GA黏附力强。结论 可以从成人骨髓中培养出MSCs，并可定向诱导分化为软骨细胞，5～10ng TGF-β为最佳诱导剂量，成人MSCs可用作临床自体软骨组织工程种子细胞。