兔髂骨骺板软骨细胞体外构建骺板样软骨组织

目的 利用组织工程学技术体外构建骺板样软骨组织。方法 从4～5周龄兔髂骨骺板软骨处获取软骨细胞，在离心管内轻微离心后，体外培养。行组织学观察。结果 培养至第7天时，细胞呈现定向分化，形态与体内骺板软骨细胞相类似：肥大软骨细胞体积较大、呈圆形或椭圆形；增殖、成熟软骨细胞体积小，呈圆形或扁圆形；细胞周围充满大量的细胞外基质。这些不同分化阶段的细胞形成了分化区带，肥大软骨细胞位于上侧，增殖、成熟细胞位于中间，其次是散在静止软骨细胞。培养第14天，分化区带更加明显，增殖、成熟细胞和肥大软骨细胞呈现纵向定向排列。培养第21天，组织表面出现膜样的结构。结论 体外构建的骺板样软骨组织与天然骺板的组织学形态极为相似。从髂骨处骺板处获取肥大软骨细胞进行体外构建骺板软骨材料，更具有临床实用性。     

骺板软骨细胞复合三维支架体外构建组织工程软骨的研究

目的探讨将骺板软骨细胞复合三维支架经体外培养,构建组织工程软骨的效果及其生物学特点. 方法将3周龄幼兔第1代骺板软骨细胞与液态的生物凝胶混合,接种于聚磷酸钙纤维/L-聚乳酸(CPPF/PLLA)三维支架材料,构建组织工程软骨组织块,连续培养4周.行大体、倒置显微镜及组织学、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组织化学光镜观察,定量检测硫酸糖胺多糖(GAG)含量. 结果构建的组织工程软骨块在培养过程中能保持其初始外形,种子细胞呈稳定的三维均相分布,外观逐渐呈乳白色、半透明,硬度亦不断增加.培养1周有软骨细胞陷窝形成,2周后形成富含Ⅱ型胶原和蛋白聚糖、具有典型软骨组织结构的工程化软骨,且Ⅰ型胶原逐渐转为阴性.4周时构建软骨的组织结构与天然骺板软骨相类似,硫酸GAG含量平均为天然骺板软骨的34%以上. 结论骺板软骨细胞复合三维支架体外培养可生成典型软骨,且可形成类似天然骺板软骨的组织结构,能满足修复骺板缺损的基本要求.体外培养1～2周可能是植入体内修复骺板缺损的较佳时机.     

组织工程骺板软骨移植修复兔胫骨上骺板缺损

目的　探讨在体外以三维支架构建的组织工程骺板软骨修复胫骨上骺板缺损的效果 ,了解促进植入工程化软骨与受区骺板融合方法的效果。　方法　酶消化分离幼兔骺板软骨细胞并接种培养 ,收获第 1代软骨细胞 ,制成 2 .5× 10 7/ ml的细胞凝胶混悬液 ,接种于聚磷酸钙纤维 / L-聚乳酸 (CPPf/ PL L A)复合支架体外构建组织工程化软骨。采用幼兔右侧胫骨上骺板 4 0 %缺损模型 ,将日本大耳白兔 72只分为 4组 ,每组 18只 :A组缺损区植入同窝幼兔来源的工程化软骨 ,并以相同的细胞凝胶混悬液充填其间隙 ;B组充填复合有生物凝胶而无细胞的 CPPf/ PL L A支架材料 ;C组植入皮下脂肪 ;D组不做任何充填。分别于术后 2、4、6、8、12和 16周摄 X线片、大体及组织学观察。　结果　A组术后2周组织工程化软骨在骺板缺损区即衍生为典型的骺板组织结构 ,并与受区骺板组织很好融合 ;4周修复骺板组织 ,结构正常、胫骨无畸形 ;8周后骺板修复区出现早闭的组织学表现 ,胫骨出现短缩和内翻畸形 ;16周修复区骺板已闭合 ,胫骨畸形明显 ,生长功能恢复率为 4 3.6 %。B、C、D3组术后 2周胫骨即出现畸形 ;4周骺板缺损区均已骨性闭合 ,畸形明显 ;16周畸形严重。后三组间差异无统计学意义 ,骺板缺损区无骨生长。　结论　组织工程化的骺板软骨     

组织工程化骺板的研究进展

<正>近年来,组织工程技术的飞速发展给骺板损伤的治疗带来了新的机遇。近年来国内外学者对组织工程骺板的研究取得了一些进展。现就组织工程化骺板种子细胞和支架材料的研     

大鼠胫骨骺板软骨细胞P物质的表达

目的 研究P物质（SP）在大鼠胫骨骺板软骨细胞中的表达及其在长骨纵向生长中的意义。方法 应用免疫组化技术检测8周龄大鼠胫骨骺板不同组织学层次软骨细胞的SP表达状况。结果 骺板静止及增殖期软骨细胞未见SP免疫阳性染色，肥大区及钙化区软骨细胞可见SP免疫组化阳性染色。结论 骺板肥大区及钙化区软骨细胞可以表达SP，提示SP在长骨的纵向生长中可能起调节作用。     

组织工程软骨体外构建的相关实验研究

目的 探索组织工程软骨体外构建技术体系可行性.方法 种子细胞选用胎儿软骨细胞(口服药物流产胎儿,胎龄3～6个月).酶消化法获得第1代细胞,以50×106/ml浓度均匀接种于经聚乳酸(PLA)包埋聚乙醇酸(PGA)高分子聚合物支架,形成细胞-支架复合体,在体外静态培养.分别于2周、4周、8周进行大体观察、扫描电镜及组织学检测.结果 体外构建的组织工程软骨,随培养时间延长,色泽由2周时的乳白色逐渐呈现半透明,8周时接近正常软骨外观.扫描电镜显示软骨细胞与材料具有良好相容性,培养7天PGA纤维之间有基质沉积.HE染色示2周有大量软骨陷窝形成和均匀嗜碱性基质分泌,Safranin'O染色示基质有酸性蛋白多糖分布,Massons's trichome染色示基质有胶原成分,但含量较少,经免疫组织化学检测为特异Ⅱ型胶原.培养4周胶原成分开始明显增多,软骨陷窝形态接近成熟,8周细胞外基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量丰富且分布均匀.结论 以成熟软骨细胞为种子细胞,运用组织工程技术在体外能构建出具有正常软骨组织结构特征的人组织工程软骨.     

软骨生长因子对兔软骨细胞作用的实验研究

目的：探讨软骨生长因子（CDGF）对体外培养兔软骨细胞的作用。研究了CDGF,胰岛素样生长因子－I（IGF－I）及软骨细胞生长代谢三者之间的关系。方法：体外单层培养兔软骨细胞,取生长良好的第二代细胞实验,分别或共同加入不同浓度CDGF和IGF－I,利用氯胺T法和MTTI地分别观察比较细胞培养液中羟脯氨酸与能量的合成及细胞的增殖情况,结果：CDGF与IGF－I均能剂量依赖性的促进细胞外基质中羟脯氨酸的合成以及细胞的增殖与能量合成;对两种作用的最佳刺激浓度,CDGF分别为16ng/ml和32ng/ml,IGF-I为30ng/ml;二者联合应用能明显增强对软骨细胞作用。结论：CDGF可以刺激软骨细胞的增殖与胶原合成,并与IGF－I有协同作用。     

自体髂骨骺板移植重建胫骨骺板

目的　研究自体髂骨骺板移植修复胫骨骺板损伤的效果。方法　 6周龄新西兰白兔 10只 ,切取全层髂骨骺板软骨 ,切除双侧胫骨上端骺板前内侧部分 1/ 2 ,然后将所取的髂骨骺板软骨移植入左侧骺板损伤处 ,右侧不进行移植作为对照。第 8周时摄双侧下肢X线片 ,并取双侧胫骨上端 ,行HE染色及甲苯胺蓝染色。结果　移植 8周时胫骨角对照组 38 80± 3 5 0 ,髂骨骺板移植组 8 36± 3 9(P <0 0 1)。组织学检查示对照组胫骨近端骺板内侧缺损处有明显骨桥形成 ,移植组骺板缺损区由骺板样软骨修复充填 ,与邻近骺板融合 ,无骨桥形成。结论　自体髂骨骺板移植修复骺板损伤效果良好     

骺板损伤的诊断与治疗进展

骺板损伤可导致骨骺与干骺端之间形成骨桥，骺板提前闭合，造成肢体短缩和(或)成角畸形，影响儿童生长发育。早期诊断较困难，X线、CT、MRI等影像学检查及“骨桥地图法”可协助诊断。传统治疗有骨桥切除后以脂肪、骨水泥等填塞，但效果不一。近年来，随着显微外科及组织工程等新技术的开展，用培养的骺软骨细胞、间充质干细胞等移植代替无活力的填充物植入，它能不断增殖并抑制骨桥形成，将为骺板损伤治疗提供更好的解决方案。本文结合国内外最新研究成果对骺板损伤的现状进行回顾，并对其前景作一展望。     

过量氟化物摄入对实验大鼠胫骨骺板软骨细胞分化的影响

目的：观察及分析过量氟化物对大鼠骺板软骨生长发育的毒性作用。方法：SD大鼠分为对照组,低过量氟组和高过量氟组,分别于实验10周和20周观察大鼠胫骨骺板软骨光镜,电镜下组织形态学变化。结果：与对照组比较,光镜下过量氟组大鼠骺板软骨增厚,增殖层软骨细胞和肥大层软骨细胞滞留和堆积,排列紊乱,并出现软骨半岛,软骨岛和原纤维显露,且骺板软骨损伤随染氟剂量和时间延长而明显加重,电镜下骺板软骨细胞坏死增加,存活细胞功能活跃,可继续合成和分泌胶原蛋白。结论：过量氟对大鼠骺板软骨细胞分化有明显的损伤作用,可进一步干扰软骨内化骨。     

兔髂骨生长板细胞的培养及体内成软骨作用的研究

目的 建立大量生产髂骨生长板软骨细胞的培养及保存方法,观察髂骨生长板细胞在裸鼠体内的成软骨作用,为生长板组织工程提供种子细胞。方法 取二周龄兔髂骨生长板软骨,经机械剪切和化学消化作用后,接种、培养及液氮保存,通过显微镜观察其生物学表现,并通过甲苯胺兰、碱性磷酸酶染色及Ⅱ型胶原染色对其生物学特性进行签定。将生长良好的第二代细胞注入裸鼠背部,于第四周取材,进行组织学观察。结果 细胞可在体外大量增殖并在六代内无明显反分化,但缺乏向肥大细胞进一步分化的能力。冷冻复苏细胞存活率为92％。注射的细胞悬液可在裸鼠体内形成软骨组织,并进一步向肥大细胞转化。结论 成功建立了髂骨生长板细胞的培养及冻存方法,证明髂骨生长板细胞可在体内进一步形成软骨组织并向肥大期细胞转化。     

培养软骨、关节软骨、生长板和半月板的超微结构研究

目的 探讨离心管培养软骨作为移植材料的可能性。方法 3周龄兔关节软骨细胞经离心管培养2周形成软骨,另取6周龄兔肱骨头关节软骨、肱骨近端生长板和半月板,并对4种软骨进行透射电镜观察,比较其软骨细胞和细胞外基质结构。结果 离心管培养软骨具有独特的超微结构,与关节软骨和生长板有一定的相似性,而与半月板有明显区别。4种软骨都形成了各自不同的细胞和细胞外基质特征,离心管培养软骨呈现典型软骨细胞凋亡,生长板表现“黑暗”软骨细胞,关节软骨和半月板未见细胞凋亡。结论 离心管培养软骨具有独特的超微结构,可作为关节软骨和生长板的移植物。     

传代对残耳软骨细胞体内软骨形成能力的影响

目的：研究传代对残耳软骨细胞体内软骨形成能力的影响。方法分离培养人残耳软骨细胞,将第3-8代细胞分别复合聚羟基乙酸/聚乳酸支架,构建组织工程化软骨;体外培养4周后植入裸鼠体内观察8周。采用组织学染色观察各组标本的软骨形成情况;Real-time PCR检测软骨分化相关基因的表达;生物力学分析新生软骨的弹性模量。结果各代复合物体外培养4周时均不能形成软骨组织,但第3-5代残耳软骨细胞COL 2A1、第3-4代的SOX 9和第3代的DLK 1仍可维持较高的表达水平（P〈0.05）;体内植入8周后,第3-6代复合物均有不同程度的弹性软骨结构形成,并随代次增高而减少,第3-6代复合物的弹性模量明显高于第7、8代。结论残耳软骨细胞传至第4代仍能保持良好的体内软骨形成能力,但扩增传代对残耳软骨细胞软骨表型去分化的影响在第7代后已无法逆转。     

Visualization of living terminal hypertrophic chondrocytes of growth plate cartilage in situ by differential interference contrast microscopy and time-lapse cinematography

The functional unit within the growth plate consists of a column of chondrocytes that passes through a sequence of phases including proliferation, hypertrophy, and death. It is important to our understanding of the biology of the growth plate to determine if distal hypertrophic cells are viable, highly differentiated cells with the potential of actively controlling terminal events of endochondral ossification prior to their death at the chondro-osseous junction. This study for the first time reports on the visualization of living hypertrophic chondrocytes in situ, including the terminal hypertrophic chondrocyte. Chondrocytes in growth plate explants are visualized using rectified differential interference contrast microscopy. We record and measure, using time-lapse cinematography, the rate of movement of subcellular organelles at the limit of resolution of this light microscopy system. Control experiments to assess viability of hypertrophic chondrocytes include coincubating organ cultures with the intravital dye fluorescein diacetate to assess the integrity of the plasma membrane and cytoplasmic esterases. In this system, all hypertrophic chondrocytes, including the very terminal chondrocyte, exist as rounded, fully hydrated cells. By the criteria of intravital dye staining and organelle movement, distal hypertrophic chondrocytes are identical to chondrocytes in the proliferative and early hypertrophic cell zones.     

培养软骨同生长板的比较研究

目的：探讨培养软骨用作生长板移植替代物的可行性。方法：自1月龄兔分离软骨细胞、离心管培养2周形成软骨。切取6周龄兔胫骨生长板，与培养软骨进行组织学、胰岛素样生长因子I型受体α链（IGF－I Ra)免疫组织化学、^3H-胸腺嘧啶脱氧核苷（^3H-TdR)掺入率检测和电镜观察。结果：培养软骨具有一定的骺软骨组织学结构，缺乏典型的生长板软骨细胞柱状排列。培养软骨和生长板IGF－IRa免疫组织化学染色均为阳性。培养软骨^3H-TdR掺入率显著高于生长板（P＜0．01）。培养软骨中细胞外基质结构疏松，5％软骨细胞呈现凋亡。结论：培养软骨具有一些与生长板相似的性质，可能成为生长板的移植替代物。     

Transplantation of Autologous Chondrocytes Seeded on a Fibrin/Hyaluronan Composite Gel Into Tracheal Cartilage Defects in Rabbits: Preliminary Results

Reconstruction of tracheal defects is one of the most difficult procedures in head and neck surgery. To date, various reconstructing techniques have been used with no consensus on the best approach. This study investigated the feasibility of using a fibrin/hyaluronic acid (HA) composite gel with autologous chondrocytes for tracheal reconstruction. Chondrocytes from autologous rabbit auricular cartilages were expanded and seeded into a culture dish at high density to form stable tracheal cartilages mechanically using a fibrin/HA composite gel. A 1‐cm long by 0.5‐cm wide defect was created by a scalpel on the cervical tracheae of six rabbits. Tissue‐engineered cartilages using fibrin/HA composite were trimmed and fixed to the defect boundaries with tissuecol. Postoperatively, the site was evaluated endoscopically, histologically, radiologically, and functionally. None of the six rabbits showed signs of respiratory distress. Postoperatively, in all cases, rigid telescopic examination showed that the implanted scaffolds were completely covered with regenerated mucosa without granulation or stenosis. Histologically, the grafts showed no signs of inflammatory reaction and were covered with ciliated epithelium. Even when grafts were broken and migrated from their original insertion site, the implanted cartilages were well preserved. However, the grafts did show signs of mechanical failure at the implantation site. The beat frequency of ciliated epithelium on implants was very similar to that of normal respiratory mucosa. In conclusion, implants with autologous chondrocytes cultured with fibrin/HA showed good tracheal luminal contour, functional epithelial regeneration, and preservation of neocartilage without inflammation but lacked adequate mechanical stability.     

软骨细胞膜片修复山羊气管的实验研究

目的探讨软骨细胞膜片技术构建的组织工程软骨,修复大型哺乳动物气管缺损的方法。方法取6头山羊耳廓软骨细胞为种子细胞,利用细胞膜片技术构建软骨组织。膜片体外培养6周,回植到动物腹部皮下;3例在皮下埋置8周后包裹于硅胶管上,移植到颈旁进行再血管化和塑形,8周后带肌肉蒂修复气道缺损(带蒂移植组);另3例在皮下埋置16周后,直接用于气道缺损修复(游离移植组)。动物气管缺损范围均为3个气管环长的全段缺损。结果所有膜片在体外培养6周后,均能形成较为成熟的软骨样组织。带蒂移植组在皮下埋置8周后能形成成熟软骨组织,移植到颈旁肌肉能成功再血管化和塑形。气管缺损修复术后,带蒂移植组均能带T型管长期存活(14周),但拔出T型管后均在2周内死亡。取材时发现,带蒂移植组修复段组织工程软骨仍然存活,并在相应部位维持了很好的管壁外形,但是没有软骨外壁的部位发生明显塌陷;内壁结缔组织增生严重,阻塞管腔。游离移植组在皮下埋置16周后,也形成了成熟软骨组织。移植修复后,在T型管存在的情况下,均在术后2周内死亡。取材发现,修复段气道均发生了严重的组织坏死感染,并波及周边组织;组织学观察仅能发现少数散在的组织工程软骨组织。结论软骨细胞膜片技术是稳定可靠的组织工程软骨构建方法;在气道复杂环境中,游离移植的软骨补片会在短时间内发生坏死;带蒂移植能保证修复段组织的存活,但是完整的软骨外壁和内壁提前(或尽快)上皮化是修复成功的关键。     

培养软骨移植修复兔生长板陈旧性缺损

目的：将培养软骨移植修复生长板陈旧性缺损,防止肢体畸形发生,减轻畸形程度。方法：分离1月龄兔软骨细胞,经离心管内培养形成软骨。在6周兔右侧胫骨上端生长板造成缺损,4周后再次手术切除缺损内组织,植入培养2周软骨。左侧胫骨经相同处理,但无植入物,为自身对照。于4、8、12周行X线照片、组织学、免疫组化检查。结果：移植培养软骨4、8、12周时右侧胫骨畸形增加程度显著低于左侧,生长板缺损区由软骨组织充填,结构完整,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。左侧胫骨畸形加重,生长板缺损区内骨桥形成,提前闭合。结论：培养软骨移植生长板陈旧性缺损,可以明显减轻肢体畸形程度,但不能纠正已发生畸形。     

培养软骨对胫骨生长影响的实验研究

目的 :探讨培养软骨植入胫骨干骺端缺损后的组织学改变 ,以及对胫骨生长的影响。方法 :自 3周龄兔关节面分离软骨细胞 ,经离心管培养 2周形成软骨。于 1 6只 1 2周龄新西兰兔右侧胫骨近端生长板下方 1 .5mm处造成边缘性缺损 ,移植培养软骨。左侧胫骨未作手术为正常对照。分别于术后 6、1 2周进行X线摄片和组织学检查。结果 :6周时胫骨近端生长板变窄 ,其下方 6mm处形成薄层软骨或不规则软骨块 ,缺乏生长板柱状细胞排列结构。大量新骨形成和植入区皮质骨增厚。 1 2周时生长板基本闭合 ,干骺端结构正常 ,无软骨。双下肢X线摄片显示双侧胫骨生长无差异 (P >0 .0 5)。结论 :培养软骨植入干骺端可以维持组织性质 ,但不具有生长板结构和生长能力