肝癌抑癌基因GSTP1、p16、RIZ1、RASSF1A异常甲基化检测及其临床意义

目的 研究肝细胞癌中的GSTP1、p16、RIZ1、RASSF1A 4种基因启动子区域甲基化状态的表达差异,并探讨其在肝癌发生中的作用.方法运用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific PCR,MSP）技术,分别检测35例肝癌组织及其相应的癌旁组织和20例正常对照肝组织中4种候选抑癌基因（GSTP1、p16、RIZ1、RASSF1A）启动子区域的甲基化表达情况,并结合临床病理资料进行分析.结果在肝细胞癌、癌旁及正常对照肝组织中检测到GSTP1基因启动子区的甲基化率分别是57.1 （20/35）,25.7％（9/35）,0％ （0/20）;p16基因启动子区甲基化率分别是54.3％ （19/35）,37.1％ （13/35）,0％ （0/20）; RIZ1基因启动子区甲基化率分别是68.6％ （24/35）,14.3％ （5/35）,0％ （0/20）;RASSF1A基因启动子区甲基化率分别是88.6％ （31/35）,74.3％（26/35）,10％ （2/20）,其中癌组织中GSTP1和RIZ1基因甲基化率均显著高于相应的癌旁组（P＜0.01）和正常对照肝组织（P＜0.01）,癌组织中p16、RASSF1A启动子区甲基化率高于癌旁组织,但二者无统计学意义（P＞0.05）,但明显高于正常对照肝组织（P＜ 0.01）.在肝癌组织中肿瘤有包膜侵犯者GSTP1基因甲基化阳性率明显高于无包膜侵犯者（P＜0.05）;乙肝表面抗原（HbsAg）阳性的肝癌患者p16基因甲基化阳性的比率要显著高于HbsAg阴性者（P＜0.05）;而RIZ1、RASSF1A与临床病理资料间均没有统计学意义（P＞ 0.05）.结论RIZ1、GSTP1基因甲基化状态具有肝癌特异性,或可作为临床肝癌辅助诊断的分子标记物.慢性HBV感染可能是导致p16甲基化而失活的原因,GSTP1基因启动子甲基化可能与肝细胞癌的侵袭性有关.     

大黄素对胰腺癌细胞作用的实验研究

目的探讨大黄素对胰腺癌细胞增殖的抑制作用及其机制。方法采用CCK-8法观察不同浓度的大黄素对人类胰腺癌细胞株PC-3细胞增殖的抑制作用;采用荧光显微镜和流式细胞仪观察细胞的凋亡及生长周期的变化;采用透射电镜观察其超微结构的变化;采用免疫组织化学的方法,观察凋亡相关基因蛋白(Fas,Fas-L)表达的变化。结果不同浓度(0、10、20、40和60μmol/L)的大黄素均可抑制PC-3细胞的增殖,而且抑制率呈浓度依赖关系;荧光显微镜检测显示大量早期凋亡细胞(FITC+/PI-),流式细胞仪观察显示明显的凋亡峰出现,并使细胞周期主要被阻滞在G1期(55.19～85.80%);电镜观察显示了大黄素作用后的PC-3细胞具有典型的凋亡细胞形态学特征:细胞膜完整、胞浆浓缩、染色质固缩、核碎裂等;免疫组化研究表明大黄素对PC-3细胞表达的凋亡相关基因具有一定调节作用,即可上调Fas(+～+++)、Fas-L(-～+++)的表达。结论大黄素既能有效地抑制人类胰腺癌PC-3细胞株的生长,又可以诱导癌细胞凋亡,这可能与其能够调节PC-3细胞的Fas和Fas-L凋亡相关基因蛋白的表达有关。     

抑癌基因RASSF1A与胆管癌的研究进展

Duand-Fardel于1840年第一次描述了胆管癌是一种起源于胆总管上皮的恶性肿瘤,是一种较少见的胆道恶性肿瘤,约占消化道肿瘤的3％.RASSF1A是Dammann等[1]于2000年利用酵母双杂交筛选方法,在染色体3p21.3这个区域克隆出的一个新型的Ras因子,它属于RASSF1家族(Ras Association Domain family 1)(RASSF1A-RASSF1 H)的一个亚型,后续的研究又表明它是一个新型的抑癌基因,其失活可以导致人类多种恶性肿瘤的发生.其失活方式有突变、杂合性缺失、纯合型缺失、启动子甲基化,其中以启动子甲基化最为常见.RASSF1A表达的失活同胆管癌的发生、发展、治疗、预后息息相关.     

胰腺癌中p16基因甲基化改变及其蛋白表达分析

目的研究p16基因启动子区异常甲基化改变和p16蛋白表达在胰腺癌与癌旁组织中的表达特点,探讨其与胰腺癌发生发展与临床的关系。方法分别以免疫组化法(SP法)及甲基化特异PCR(MSP)检测46例胰腺癌及其癌旁组织中p16基因表达及其甲基化的水平,并结合临床资料进行分析。结果胰腺癌中p16蛋白表达率为41.3%(19/46),而癌旁组织表达率为95.7%(44/46),两者相比差异有统计学意义(P<0.01)。p16蛋白阳性的19例胰腺癌标本,均未检出基因甲基化;p16蛋白缺失的27例标本,有18例检出基因甲基化,甲基化率为39.1%。基因甲基化与p16蛋白缺失明显相关(P<0.05),p16基因表达及p16基因启动子区甲基化的发生率与胰腺癌的大小、患者性别、年龄的差异无统计学意义(P>0.05),但在组织分化程度、有无淋巴结转移、PTNM分期上有统计学意义(P<0.05)。结论p16基因启动子异常甲基化改变可能影响p16蛋白的表达;p16甲基化、蛋白表达与胰腺癌的发生发展密切相关,p16甲基化和蛋白表达是胰腺癌患者诊断及预后的候选标志物之一。     

抑癌基因P16在胰腺癌癌旁组织中的表达及意义

目的：研究抑癌基因P16在胰腺癌癌旁组织中的表达及意义。方法：采用免疫组化LSAB法检测6例正常胰腺组织,20例胰腺癌及与其相对的癌旁组织中P16蛋白的表达率。结果：癌旁组织与正常胰腺组织中P16蛋白的表达率间比较差异显著（P＜0.05);胰腺癌组织中P16蛋白的表达率与癌旁组织中的表达率正相关（P＜0.05);癌旁组织中P16蛋白表达率与胰腺癌分化程度正相关。结论：P16蛋白在胰腺癌癌旁组织中表达的异常可能与胰腺癌易复发及治疗困难有关;通过检测其表达率可以初步判定肿瘤的恶性程度。     

胰腺癌微卫星不稳定性、hMLH1启动子甲基化及其蛋白表达研究

目的探讨胰腺癌中微卫星不稳定性（MSI）与hMLH1启动子甲基化及蛋白表达之间的联系，揭示胰腺癌发生的分子机制。方法从35例胰腺癌患者的正常胰腺组织、癌组织中提取DNA；SSCP法检测标本中微卫星不稳定性发生情况；免疫组织化学法检测错配修复基因hMLH1在胰腺癌中的表达情况；MSP法检测hMLH1基因启动子甲基化状态。结果35例胰腺癌中微卫星高度不稳定7例，低度不稳定14例，稳定11例，正常组织中没有出现微卫星不稳定，两者之间差异有统计学意义（P〈0．05）。hMLH1在微卫星不稳定胰腺癌组织中常为缺失表达。在微卫星稳定胰腺癌组织中呈正常表达。35例胰腺癌中hMLH1启动子CpG岛甲基化发生率为60％（21/35）。正常组织中未发现甲基化，两者之间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论与胰腺癌有关的错配修复基因hMLH1启动子CpG岛甲基化是hMLH1基因失活的重要机制，而hMLH1的表达失活则可能导致MSI的产生，促进胰腺癌的发生。     

沉默DNMT1和DNMT3b基因对胰腺癌BxPC-3细胞p16|RASSF1A基因启动子甲基化的影响

目的:探讨沉默DNMT1和DNMT3b基因对胰腺癌BxPC-3细胞p16,RASSF1A基因启动子甲基化的影响。方法:将胰腺癌BxPC-3细胞分为5组:DNMT1干扰组(转染DNMT1-siRNA),DNMT3b干扰组(转染DNMT3b-siRNA),双重干扰组(转染DNMT1+DNMT3b-siRNA),阴性对照组(转染阴性siRNA)和空白对照组(转染脂质体)。转染48 h后,应用荧光定量PCR法和Western blot法分别检测细胞中DNMT1和DNMT3b的mRNA及蛋白的表达水平;甲基化特异性PCR法检测p16和RASSF1A基因启动子甲基化。结果:与空白对照组和阴性对照组比较,各干扰组目的基因的mRNA及蛋白表达量均明显降低(均P<0.01)。空白对照组与阴性对照组p16和RASSF1A基因甲基化阳性;DNMT1干扰组和双重干扰组p16基因甲基化阴性,RASSF1A基因部分甲基化;DNMT3b干扰组p16基因部分甲基化,RASSF1A基因甲基化阳性。结论:DNMT1单干扰对胰腺癌BxPC-3细胞p16和RASSF1A基因的去甲基化作用优于DNMT3b单干扰,DNMT1和DNMT3b双重干扰无明显的协同效应;提示DNMT1是胰腺癌去甲基化治疗的一个有效靶点。     

肝细胞癌患者血浆和癌组织中RASSF1A基因甲基化及临床意义

目的探讨肝细胞癌(hepatocellular carcimona,HCC)患者外周血浆和肿瘤组织中RASSF1A基因甲基化及其临床意义。方法应用甲基化特异性PCR(MSP)检测36例HCC患者血浆及其对应癌组织中的RASSF1A基因启动子甲基化状态,并分析其与临床参数的关系。结果癌组织和外周血浆中RASSF1A基因甲基化率分别为83.3%(30/36)和61.1%(22/36),二者相关系数为r=0.561(P=0.0004)。外周血浆和肿瘤组织中RASSF1A基因甲基化率与患者性别、年龄、HBV/HCV感染、肝硬化、肿瘤大小、AFP水平、肿瘤病理分级及临床分期、有无癌栓及是否为复发病例等之间无统计学相关性。以AFP≥400 ug/L为阳性,本组病例AFP阳性率为44.4%;以AFP≥20 ug/L为阳性,本组病例阳性率为69.4%。全部患者中,血浆RASSF1A基因甲基化检出率为61.1%,AFP联合血浆RASSF1A基因甲基化检测HCC的检出率为75%(27/36)。结论 HCC患者血浆和肿瘤组织中RASSF1A基因甲基化率有良好的一致性。血浆DNA甲基化联合AFP检测对HCC早期诊断具有一定意义。癌组织和血浆中基因甲基化改变与各临床参数无相关性。     

抑癌基因RASSF1A在胰腺癌组织中表达的研究

目的：探讨抑癌基因RASSF1A在胰腺癌组织中的表达及其与胰腺癌发生、发展的关系。方法：采用免疫印迹方法检测48例胰腺癌组织及其癌旁（正常）组织RASSF1A基因蛋白的表达水平。结果：癌旁组织RASSF1A蛋白的表达量高于高分化腺癌组织的表达量（P<0.05);高分化腺癌组织RASSF1A蛋白的表达量高于中、低分化腺癌组织（P<0.05)。TNM分期Ⅲ期RASSF1A蛋白的表达量低于Ⅰ,Ⅱ期(P<0.05)。RASSF1A基因蛋白表达与性别、年龄,肿瘤发生部位无明显关系(P>0.05)。结论：RASSF1A表达缺失或低下在胰腺癌的发生、发展中起重要作用。     

食管鳞癌RASSF1A基因启动子区甲基化研究

目的 研究肿瘤抑制基因RASSF1A启动子区甲基化所致该基因表达抑制在我国食管鳞癌发生中的作用及可能机制. 方法 用甲基化特异PCR技术(MSP)检测43例原发性食管鳞癌标本及6例对照食管上皮组织标本、食管鳞癌细胞系TE11和TE12中RASSF1A启动子甲基化状态;逆转录(RT)-PCR法检测5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理前后食管鳞癌细胞系中RASSF1A mRNA表达水平;Western blot方法检测食管鳞癌细胞系中细胞微管蛋白的表达. 结果 20.9%(9/43)原发性食管鳞癌标本有RASSF1A启动子超甲基化,正常食管上皮组织未发现该基因超甲基化改变.RASSF1A基因甲基化与食管癌患者的性别和TNM分期无关(P＞0.05),但在不同年龄组间的差异有统计学意义(P＜0.05).TE12细胞RASSF1A启动子发生甲基化,RT-PCR检测不到RASSF1A mRNA.TE11细胞系启动子未发生甲基化,RT-PCR检测其有RASSF1A mRNA表达.5-Aza-CdR处理可使TE12重新表达RASSF1A mRNA.TE12细胞的β-微管蛋白水平比TE11细胞低87.8%. 结论 原发性食管鳞癌存在RASSF1A启动子超甲基化,该基因甲基化与年龄相关.RASSF1A在食管鳞癌细胞系表达抑制与其甲基化状态有关.RASSF1A表达缺失可能导致β-微管蛋白减少.     

抑癌基因P16在膀胱移行细胞癌中表达的意义

为探讨抑癌基因Ｐ１６蛋白在膀胱移行细胞中表达的临床意义，应用免疫组化法对６９例膀胱移行细胞癌中癌中抑癌基因Ｐ１６民物进行检测。结果：６９例膀胱癌标本中３７例检测Ｐ１６蛋白阳性。Ｐ１６蛋白阳性率在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级肿瘤中分别为６９．５７％（１６／２３）、５６．２５％Ｄ（１８／３２）和２１．４３％（３／１４）。     

肿瘤坏死因子-α基因联合氟尿嘧啶治疗胰腺癌的研究

目的 探讨肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）－α基因与氟嘧啶（５－ＦＵ）联合治疗胰腺癌的作用。方法 应用ＭｏＭＬＶ逆转录病毒载体，将ＴＮＦ－α基因转导致人胰腺癌细胞株ＰＣ－３，经氨基糖甙类新霉素衍生物Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）筛选获得了抗性克隆。用逆转录聚合酶链方法检测胰腺癌细胞株转染ＴＮＦ－α的基因表达情况，同时用放线菌素Ｄ处理后小鼠成纤维肉瘤细胞Ｌ９２９检测转基因细胞表达ＴＮＦ－α的活性，并观察ＴＮＦ     

抑癌基因P16蛋白在人前列腺癌中的表达及意义

目的：研究前列腺癌中抑癌基因ＭＴＳ１蛋白产物Ｐ１６表达的情况及临床意义。方法：用免疫组织化学方法（ＳＰ法）检测了６４例前列腺癌和１２例正常前列腺组织中Ｐ１６蛋白的表达情况。结果：３８例前列腺癌Ｐ１６蛋白表达表达阳性（５９．４％）,其中高分化癌阳性率为９０．０％（１８／２０）,中分化癌为７２．２％（１３／１８）低分化癌为２６．９％（７／２６）,随着前列腺癌恶性程度的增加Ｐ１６蛋白表达阳性率显著降低,     

抑癌基因P16在肾脏肿癌中的表达及意义

为探讨抑癌基因P16与肾脏肿瘤临床病理及预后的关系，采用免疫组织化学SP法对53例肾癌组织中P16基因进行检测。结果显示，53例肾肿瘤P16基因表达的阳性率为37．73％，其阳性表达与肿瘤的病理分级、临床分期及预后均密切相关，有显著性差异（P＜0．05）。提示P16基因在抑制肾脏肿瘤的发生、发展中起重要作用，是判定肾脏肿瘤恶性程度及预后的客观指标。     

辐射诱导性自杀基因对胰腺癌体内治疗效果的实验观察

目的将PC-3胰腺癌细胞种植于balb/c裸小鼠皮下,建立移植瘤模型,观察pAdEgr-1-TK注入后在射线和前药GCV下对胰腺癌的治疗作用。方法PC-3胰腺癌细胞以1×107混以0.1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)皮下接种于balb/c裸鼠皮下,每组6只,共4组24只,待肿瘤长至约0.6 cm时,分为4组,以PC-3组作为对照,PC-3/pAdE组注射同量混以PBS的pAdEgr-1,PC-3/pAdET(不放射)和PC-3/pAdET(放射)组将纯化腺病毒pAdEgr-1-TK以1×109 pfu/ml、0.1 ml/只直接注射到治疗组肿瘤体内,1次/d,连续3 d,同时,腹腔内每日注射GCV(25 mg/kg),连续14 d,即分两次间隔48 h行剂量为10 Gy的60Co-γ射线照射,观察各组动物肿瘤生长情况,每3天测量肿瘤体积[(长径×短径2)/2],治疗结束后,处死裸鼠,取瘤体称重,并在光镜下观察肿瘤的病理结果变化。结果4组细胞接种后,balb/c裸小鼠均成瘤,成瘤潜伏期无差异,成瘤率为100%,治疗前(60Co-γ射线照射 GCV),四组动物瘤体大小无差异(P=0.824),治疗后,观察对照组肿瘤生长迅速,治疗组肿瘤生长明显减慢,体积和质量PC-3/pAdET(放射)组均明显小于其他3组(P=0.000)。结论成功建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,体内实验证实Egr-1基因启动子在射线作用下可驱动下游TK自杀基因表达而对胰腺癌起治疗作用。     

抑癌基因LRIG1对膀胱癌细胞BIU87生物学特性的影响

质粒转染人膀胱癌BIU87细胞，用G418（800mg／L）筛选出抗性克隆。Western blot检测转染前后LRIG1和EGFR蛋白水平的变化；MTT法绘制转染前后细胞的生长曲线；Boyden小室和同质黏附实验观察转染前后细胞侵袭和黏附能力的变化。结果转染pLRIG1-GFP组LRIG1蛋白表达水平较对照组和转染空载体组明显升高，而EGFR蛋白表达水平较对照组和转染空载体组显著降低；转染pLRIG1-GFP组细胞的生长速度较对照组和转染空载体组明显减慢；转染pLRIG1-GFP后的BIU87细胞侵袭目的研究抑癌基因LRIG1对膀胱癌细胞BIU87生物学特性的影响。方法用脂质体介导的基因转染技术，将pLRIG1-GFP和黏附能力显著降低（P〈0．05）。结论LRIG1是一种抑癌基因，通过参与形成EGFR的负反馈环路，对膀胱癌细胞BIU87的生长、侵袭和转移有显著的抑制作用。     

RASSF1A在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

目的 探讨押癌基因RASSF1A在胰腺癌组织中的表达及其与胰腺癌发生、发展的关系.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测48例胰腺癌组织及癌旁正常组织RASSFA mRNA的表达水平.结果 癌旁正常组织RASSF1A mRNA的表达量高于高分化腺癌组织RASSF1A的表达量,差异有统计学意义(P<0.05).高分化腺癌组织RASSF1A mRNA的表达量高于中低分化腺癌组织,差异有统计学意义(P<0.01).TNM分期Ⅲ期RASSF1A mRNA的表达量低于Ⅰ、Ⅱ期,差异有统计学意义(P<0.05).RASSF1A mRNA表达与性别、年龄,肿瘤发生部位无明显关系(P>0.05).结论 RASSF1A表达缺失或低下在胰腺癌的发生、发展中起重要的作用.     

膀胱移行细胞癌患者RASSF1A蛋白表达和启动子区甲基化的研究

目的:探讨RASSFlA(RAS association domain family1A)蛋白表达水平与启动子甲基化的关系.方法:应用免疫印迹技术(western-blot)检测10例正常膀胱组织和23例膀胱移行细胞癌(Badder transitional cell carcinoma,BTCC)组织中RASSFlA蛋白表达水平;用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR,MSP)方法检测正常膀胱组织,BTCC组织中RASSF1A基因启动子CPG岛甲基化状态.结果:RASSF1A蛋白在正常膀胱组织中全部表达,在BTCC组织中表达率为30.4%(7/23),二组间表达差异有统计学意义(P＜0.05),但各肿瘤分期、病理分级间的表达差异无统计学意义(P＞0.05).在正常膀胱组织中,RASSF1A基因启动子未发生甲基化;在BTCC组织中,RASSF1A基因启动子甲基化频率为60.9%(14/23),二组间表达差异有统计学意义(P＜0.05).在14份启动子异常甲基化的BTCC标本中,13份同时伴有RASSFIA蛋白表达缺失或下调,两者存在明显相关性(P＜0.05).结论:RASSFlA基因启动子在BTCC组织中发生异常甲基化,使RASSF1A蛋白表达缺失,推测RASSFIA基因启动子CPG岛异常甲基化导致RASSF1A基因失活从而引起肿瘤的发生,而与肿瘤的进展可能无关.