骨相关生长因子对兔骨髓基质干细胞生长及分化的量效作用

目的研究地塞米松、重组人成纤维细胞生长因子（recombinant human fibroblast growth factor，rhFGF）及重组人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2，rhBMP-2）对兔骨髓基质干细胞（marrow slromal stem cells，MSCs）生长及分化的量效作用，为其在骨组织上程中的应用提供实验基础。方法体外分离培养免MSCs，分为1个空白对照组及9个实验组。实验组分别与终浓度为10^-8、10^-7、10^-6mol／L地塞米松；终浓度为50、200、500ngng/ml FGF；终浓度为50、500、1000ng／ml rhBMP-2培养。于4、7d终止培养并测定细胞总蛋白及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase。ALP）活性。结果与空白对照组比较，10mol／L地塞米松显著抑制细胞蛋白合成（P〈0．05），而10^-8、10^-7mol／L地塞米松对细胞蛋白合成无明显影响；10^-6,10^-7mol／L地塞米松刺激MSCs高度表达ALP（P〈0．05）。rhFGF各浓度组显著促进细胞蛋白合成量差异有统计学意义（P〈0．05），表现ALP活性抑制。rhBMP-2符浓度组对细胞蛋白合成九明显影响；50ng／ml rhBMP2不影响MSCs的ALP活性；当浓度增至500ng／ml与1000ng／ml时，ALP活性显苦增加（P〈0．05）。结论10^-7mol／L地塞米松及500、1000ng／ml rhBMP-2在不影响MSCs增殖的前提下，适当浓度能显著促进MSCs向成骨细胞转化，在骨组织工程的研究中有重要的应用价值。     

碱性成纤维生长因子对颅缝细胞成骨分化的影响

目的 探讨碱性成纤维生长因子（FGF-2）对颅缝细胞成骨方向分化的影响.方法 ①获取新生SD大鼠颅骨矢状缝及冠状缝处颅缝细胞.②添加不同浓度FGF-2,观察颅缝细胞ALP染色、ALP活性及成骨标志物（osteocalcin,OC）表达量,了解不同浓度FGF-2对颅缝细胞向成骨分化的影响.结果①各浓度FGF-2作用于颅缝细胞后,ALP染色、活性均较对照组减弱（P ＜0.05）.其中10ng/ml FGF-2诱导的细胞ALP受到的抑制最弱.②各浓度FGF-2作用于颅缝细胞后,OC表达量均较对照组增加（P ＜0.05）.其中10ng/mlFGF-2诱导的细胞其OC表达量最高.结论 ①FGF-2抑制颅缝细胞早期成骨标志物ALP的表达,而增强晚期成骨标志物OC的表达.②较低浓度的FGF-2（10ng/ml）对ALP抑制作用最弱,对OC促进作用最强,最利于促进颅缝细胞向成骨方向分化.     

山羊颈椎间盘纤维环成纤维细胞成骨潜能的体外观察

目的 诱导培养椎间盘纤维环成纤维细胞，探讨其成骨潜能，比较重组人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein2，rhBMP-2）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF—α）对其成骨的不同影响。方法利用体外细胞培养技术，建立实验山羊颈椎间盘纤维环成纤维细胞培养体系，根据培养液的不同，分为空白对照组、TNF-α组（加入50U／ml TNF-α）、rhBMP-2组（加入0．1μg／ml rhBMP-2）和TNF—α＋rhBMP-2组（加入50U／ml TNF-α＋0．1μg／ml rhBMP-2），培养3周观察纤维环成纤维细胞在条件培养液诱导下的成骨表型变化、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和骨钙素（osteocalcin，OC）等成骨指标变化。结果 各实验组培养液对细胞增殖无明显影响。rhBMP-2组和TNF-α＋rhBMP-2组细胞趋化性生长明显，矿化结节出现，茜素红染色呈深红色钙阳性反应。各实验组ALP活力与空白对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。rhBMP-2组与TNF—α＋rhBMP-2组成纤维细胞的OC分泌量与空白对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05），TNF—α组与空白对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 体外培养的椎问盘纤维环成纤维细胞有成骨潜能，rhBMP-2对纤维环成纤维细胞有明确的诱导成骨作用。     

小剂量阿司匹林对去势大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]检测不同浓度低剂量阿司匹林对去势后(OVX)大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响.[方法]建立SD大鼠去势模型,全骨髓贴壁法培养骨髓基质干细胞(BMSCs),传代4次后进行成骨诱导,建立对照组和不同浓度阿司匹林组(0.25、0.5、1、2及5mmol/L).于不同的培养时间点,倒置显微镜观察并进行MTT检测细胞增殖生长情况;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测培养细胞上清ALP活性;于诱导7d和21d时分别行细胞碱性磷酸酶染色和茜素红钙化结节染色.[结果]阿司匹林无明显促进BMSCs增殖作用,而大剂量阿司匹林(5 mmol/L)具有抑制BMSCs增殖作用.实验组(0.25、0.5、1、2 mmol/L阿司匹林组)细胞培养上清中ALP浓度较对照组显著增强(P＜0.05);碱性磷酸酶染色(1、2 mmol/L组)阳性表达增强;茜素红染色显示,实验组(0.5、1、2mmol/L组)钙结节数量、钙化面积均高于对照组(P＜0.05).[结论]阿司匹林不能直接促进去势大鼠BMSC增殖活性,但小剂量阿司匹林可显著提高体外培养BMSC成骨活性,增强钙盐沉积,促进钙结节形成.     

骨形成蛋白2活性多肽体外定向诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的剂量依赖性研究

目的探讨自行合成的骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP-2)活性多肽对大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)体外定向诱导成骨的能力,评价BMP-2活性多肽的成骨诱导性及诱导成骨的剂量依赖性。方法取4周龄Wistar大鼠分离培养MSCs,传至第3代时改用条件培养基,培养基中分别加入浓度为300、200、100、50及0μg/ml的BMP-2活性多肽,并依次记为A、B、C、D和E组。细胞培养至5、10、15及20d,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,测定钙含量,采用实时荧光定量PCR(fluorescent quantitativePCR,FQ-PCR)检测型胶原、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及骨钙素(osteocalcin,OCN)mRNA的表达,检测不同浓度BMP-2活性多肽体外诱导成骨的能力。结果倒置相差显微镜下观察,用条件培养基培养3～4d后,培养细胞由长梭形转变为短梭形或多角形。随条件培养基中BMP-2活性多肽浓度的增加,细胞发生成骨样改变的时间提前。ALP活性和钙含量检测显示,A组和B组较其他组增加明显,且差异有统计学意义(P<0.05),但A、B组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。FQ-PCR检测发现不同浓度条件培养基培养14d后,型胶原、OPN和OCN mRNA在各组均有表达。Ct值表明其表达量的大小顺序为A、B、C、D组,E组无表达,A组和B组的Ct值明显大于C组和D组,差异有统计学意义(P<0.05),但A组和B组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论BMP-2活性多肽能有效地促进MSCs向成骨方向分化,其诱导作用存在剂量依赖关系,最佳诱导剂量为200μg/ml。     

外源性重组人骨形态发生蛋白-2应用于兔腰椎植骨融合中细胞增殖的实验研究

目的 探讨外源性重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)应用于兔腰椎后路横突植骨融合中的促成骨效应细胞增殖作用及其成骨机制. 方法 45只新西兰大白兔随机分为三组(n=15),建立腰椎后路横突间植骨融合模型,分别植入rhBMP-2/异体骨复合骨条(复合骨组)、自体髂骨条(自体骨组)、单纯异体髂骨条(异体骨组).用流式细胞仪检测2、7、14、28、35 d具有成骨效应的骨髓基质细胞(MSCs)、成骨细胞、血管内皮细胞的增殖量. 结果复合骨组MSCs增殖量在术后2、7、35 d均比自体骨组和异体骨组高,差异均有统计学意义(P<0.05).复合骨组成骨细胞增殖量除在术后2 d高于自体骨组,差异有统计学意义(P=0.028)外,在其他时间点差异均无统计学意义(P>0.05),但复合骨组成骨细胞增殖量在术后2、7、14、28、35 d时均高于异体骨组,差异有统计学意义(P<0.05).复合骨组血管内皮细胞增殖量在术后2、7、28 d均高于自体骨组和异体骨组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 在脊柱融合的不同时间段,外源性rhBMP-2能有效地促进MSCs、成骨细胞、血管内皮细胞增殖.     

复合rhBMP-2壳聚糖微球可注射磷酸钙骨水泥制备及成骨性能研究

[目的]研究复合重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)壳聚糖微球的可注射磷酸钙骨水泥的成骨性能,从而构建一种具有骨传导和骨诱导性的新型可注射性植骨材料.[方法]制备负载rhBMP-2壳聚糖微球磷酸钙骨水泥材料,并将单纯磷酸钙骨水泥和单纯壳聚糖微球磷酸钙骨水泥材料作为对照.检测负载rhBMP-2壳聚糖微球骨水泥的rhBMP-2体外释药.在体外将青山羊骨髓干细胞(MSCs)与3种材料浸提液共同培养,通过检测碱性磷酸酶活性和骨钙素含量评价MSCs成骨分化.在体内,将3种材料植入青山羊骨缺损模型,通过组织学检测研究复合材料成骨能力.[结果]rhBMP-2在1 d时的释放量为12.6%,随后呈持续缓慢释放.在培养7、14 d,负载rhBMP-2壳聚糖微球磷酸钙骨水泥复合材料浸提液可显著提高MSCs的ALP活性和骨钙素含量,差异有统计学意义(P<0.05).组织学显示负载rhBMP-2壳聚糖微球磷酸钙骨水泥复合材料的新骨形成均优于其他组.[结论]复合rhBMP-2壳聚糖微球的可注射磷酸钙骨水泥复合材料是一种有应用前景的新型可注射骨移植材料.     

转染人骨形态发生蛋白-2基因的羊骨髓间充质干细胞的异位成骨研究

目的评价腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)基因转染羊骨髓间充质干细胞(MSCs)后的成骨活性。方法实验分为3组:(1)hBMP-2转染细胞组,(2)半乳糖苷酶基因(βgal)转染细胞组,(3)未转染细胞组。从羊骨髓中分离培养MSCs,基因转染后利用免疫沉淀和Westernblot方法检测BMP-2的表达,并在体外进行碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色、ALP定量测定、透射电镜观察。分别将细胞悬液注入裸鼠股后部肌内,分期进行X线和组织学检查。结果Westernblot检测发现只有hBMP-2转染细胞组的MSCs表达并分泌hBMP-2。该组于转染后第12d,ALP活性达高峰,与其它两组比较,差异有显著性意义;于16d后出现钙结节,而其它两组未见。透射电镜观察见hBMP-2转染细胞组的细胞内粗面内质网、线粒体和溶酶体增多。裸鼠肌内注射细胞悬液后3周,hBMP-2转染细胞组即有异位成骨,6周时明显增多,其它两组仅见纤维组织形成或微量成骨。结论hBMP-2基因转染能诱导羊MSCs分化为成骨细胞,并在裸鼠体内诱导成骨。     

恒河猴骨髓间充质干细胞体外培养及诱导分化成骨细胞的实验研究

[目的]体外分离培养非人类灵长类动物恒河猴骨髓MSCs,研究其生长、扩增及诱导分化为成骨细胞的特性.[方法]梯度离心法分离、纯化恒河猴骨髓源MSCs,观察不同接种密度和换液时间对细胞生长的影响;在体外应用成骨添加剂(含地塞米松10-7mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、维生素C 50 mg/L)或rhBMP-2(100 ng/L)定向诱导分化,对分化后的细胞进行免疫组化染色和ALP、BGP定量测定以鉴定成骨细胞,并比较两种定向诱导分化方法的效果.[结果]梯度离心法分离、纯化得到的恒河猴骨髓源MSCs具有分裂和克隆增殖的能力,种植细胞密度为10×104～30×104/cm2,48 h后半量换液,以后每3 d全量换液的方法较合理,MSCs能少量表达ALP活性,分泌的钙量较少;诱导分化后的细胞具有和体内成骨细胞相同的形态学特征,ALP染色阳性,能表达Ⅰ型胶原,不表达Ⅱ型胶原,细胞融合后3 d,ALP和BGP分泌明显增加,融合后14 d细胞ALP、BGP的分泌水平略有升高,但无明显增加;采用成骨添加剂和rhBMP-2诱导分化MSCs后相同时期成骨细胞ALP活性、BGP含量无明显差异.[结论]密度梯度离心法分离得到的非人类灵长类动物骨髓源MSCs,体外培养具有分裂、克隆增殖的能力,在加有成骨细胞诱导剂或rhBMP-2的培养基里能诱导分化为成骨细胞,化学药物在定向诱导分化过程中具有和生长因子相一致的作用.     

陶瓷化骨-水凝胶与骨髓基质细胞自体皮下成骨实验

目的观察重组人骨形成蛋白(recombinant human bone morphogenetic protem 2,rhBMP-2)-转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)与陶瓷化骨-水凝胶和骨髓基质细胞复合后,植入自体皮下成骨能力的影响.方法用矿化液诱导第1代成年SD大鼠骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)5 d后,应用改良钙钴法染色、Von Kossa染色、免疫组织化学染色观察诱导后的MSCs向成骨细胞分化情况.将收集的细胞(5×106/ml)分成3组,A组加入rhBMP-2(5μg)-TGF-β(0.05μg),B组加入rhBMP-25μg,C组不加生长因子作为空白对照;然后将细胞接种在陶瓷化骨-水凝胶上,植入自体12只SD大鼠皮下,每组6只,每只大鼠3种材料各1块.术后4、8周取材,行组织学观察骨基质形成情况,图像分析测量单位面积骨形成量,免疫组织化学染色观察Ⅰ型胶原、BMP合成情况.结果 MSCs经过5 d矿化诱导后,大部分细胞变小,胞浆突起变短,呈多边形.改良钙钴法染色见胞浆含有棕黑色颗粒的阳性细胞,Ⅰ型胶原免疫织组化学染色见大部分细胞胞核未着色,胞浆呈棕黄色;Von Kossa染色见20 d已经形成矿化结节.动物体内植入后4周,各组均有形状不规则的条索状骨基质形成,图像分析示A组的骨基质面积明显多于B组(P＜0.01);A、B组Ⅰ型胶原平均灰度值明显低于C组(P＜0.01),各组BMP的表达无明显差异(P＞0.05).8周时各组均有形状不规则的条索状、斑块状砖红色骨基质形成,A、B两组成熟骨面积明显多于C组(P＜0.01);Ⅰ型胶原、BMP均有阳性表达,但各组间平均灰度值无明显差异(P＞0.05).结论陶瓷化骨-水凝胶与MSCs复合物植入自体皮下后能形成骨组织,rhBMP 2-TGF-β复合生长因子较单纯rhBMP-2有更强的促进骨形成作用.     

成骨细胞与诱导剂对骨髓基质干细胞的增殖与成骨分化的影响

目的探索一种新的骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)增殖与成骨分化的体外诱导培养体系. 方法乳大鼠颅骨来源的第3代成骨细胞与诱导剂(1 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50μg/ml抗坏血酸)对大鼠股骨、胫骨来源的MSCs生长的影响.于8块24孔板上培养MSCs,每孔接种5×104个第3代MSCs.按培养成分不同分为4组,每组2块.DMEM培养为对照组;诱导剂培养为诱导剂组;成骨细胞培养为成骨细胞组;联合使用成骨细胞与诱导剂培养为联合诱导组.计数诱导1～8 d各组MSCs的数量并绘制细胞生长曲线,检测诱导10 d的MSCs的碱性磷酸酶活性,采用RT PCR检测诱导2周时MSCs骨钙素mRNA的表达水平.结果原代及传代MSCs形态正常.细胞生长曲线示MSCs数量均随时间延长增加.成骨细胞组增殖最快,诱导剂组增殖最慢,5～8 d成骨细胞组及诱导剂组细胞数量与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).联合诱导组碱性磷酸酶活性为2.01±0.56 U与对照组0.68±0.14 U、诱导剂组1.27±0.43 U及成骨细胞组0.77±0.19 U比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).对照组不表达骨钙素mRNA,诱导剂组为0.783±0.094、联合诱导组为0.814±0.071与成骨细胞组0.302±0.026比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论联合使用成骨细胞和诱导剂诱导MSCs,不影响MSCs的正常增殖而促进MSCs的成骨分化,诱导效果较好,可望成为一种新的骨组织工程种子细胞的体外培养体系.     

The effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on the osteogenic potential of rat mesenchymal stem cells after several passages

Background Since the osteogenic potential of bone marrow derived mesenchymal stem cells (BMSCs) becomes reduced with passage, establishment of culture condition that permit the rapid expansion of BMSCs while retaining their potential for differentiation is needed for clinical application. Bone morphogenetic proteins stimulate osteogenic differentiation in mesenchymal progenitor cells as well as increase stem cell numbers. Thus, we analyzed the effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) on the osteogenic potential of rat BMSCs over several passages.

Material and methods Osteogenic differentiation in vitro was evaluated in terms of the alkaline phosphatase (ALP) activity and the osteocalcin (OC) concentration in the supernatants, and the expression of ALP and OC mRNA in the cultured cells. For in-vivo osteogenesis, BMSCs cultured with and without rhBMP-2 through all passages were implanted into athymic mice.

Results  The levels of osteogenic markers were significantly higher in the cells of the BMP(+) group than in the cells of the BMP(-) group, although they decreased with passage irrespective of whether or not rhBMP-2 was added. Similar to the in-vitro experiments, there was a greater degree of bone and cartilage tissue formation in the BMP(+) group over all passages.

Interpretation  From our results, osteogenic potential can be maintained even in BMSCs that have been passaged several times in the presence of rhBMP-2. These cells are capable of inducing and participating in bone formation and can be used for clinical applications.     

体外诱导家猪骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的观察家猪骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)在体外诱导条件下成骨分化的特征及相关基因的表达。方法选取3月龄雌性长白猪6头,无菌条件下于胫骨近端抽取骨髓15ml。采用密度梯度离心法并根据细胞贴壁特性对MSCs进行分离、纯化,倒置相差显微镜观察原代细胞生长情况,于培养第7天计算MSCs百分比含量及群体倍增值。将第1代细胞置于含1×10-8mmol/L地塞米松(dexamethasone,Dex)、10mmol/Lβ-磷酸甘油(β-glycerophosphate,β-GP)和82μg/ml抗坏血酸(ascorbic acid,Asc)的成骨诱导培养液中培养21d,作为实验组;DMEM培养液中培养作为对照组。分别行细胞形态学观察、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)组织化学染色、钙沉积和细胞增殖测定,采用实时定量PCR分析成骨分化的相关基因表达。结果原代MSCs特征:培养第1天,有核细胞大部分由悬浮的圆形血源性细胞组成;第3天换液弃除非贴壁细胞,MSCs克隆开始形成,细胞呈成纤维细胞样生长;第7天,镜下观察到大小不一的克隆。细胞在培养后12～14d基本长满,原代细胞群体倍增值平均为13。MSCs成骨分化:诱导培养14d实验组细胞形态由成纤维细胞样变成立方体样,而对照组细胞始终保持成纤维细胞样。培养5d,对照组细胞计数为11723±4040,实验组为10276±5513,二者差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,实验组诱导培养14d,ALP染色呈强阳性,21d钙沉积明显增加(P<0.01)。实验组MSCs成骨相关基因:核心结合因子α1(corebinding factorα1,Cbfα1)、osterix、ALP、型胶原、骨连接素(osteonectin,ON)、骨钙素(osteocalcin,OC)表达逐渐增强;Cbfα1、ALP、ON在分化早期增加明显;与第7天比较,第21天osterix和OC基因表达明显上调(P<0.05);第14天,型胶原表达也上调(P<0.05)。结论密度梯度离心法分离的猪MSCs,在体外诱导条件下能通过上调分化特异基因表达向成骨细胞分化。     

The effect of noncoherent red light irradiation on proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are promising for use in regenerative medicine. Low-level light irradiation (LLLI) has been shown to modulate various processes in different biological systems. The aim of our study was to investigate the effect of red light emitted from a light-emitting diode (LED) on bone marrow MSCs with or without osteogenic supplements. MSCs both with and without osteogenic supplements were divided into four groups, and each group was irradiated at doses of 0, 1, 2 and 4 J/cm². Cellular proliferation was evaluated using WST-8 and 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) fluorescence staining. The alkaline phosphatase activity, mineralization, and expression of osteoblast master genes (Col1α1, Alpl, Bglap and Runx2) were monitored as indicators of MSC differentiation towards osteoblasts. In groups without osteogenic supplements, red light at all doses significantly stimulated cellular proliferation, whereas the osteogenic phenotype of the MSCs was not enhanced. In groups with osteogenic supplements, red light increased alkaline phosphatase activity and mineralized nodule formation, and stimulated the expression of Bglap and Runx2, but decreased cellular proliferation. In conclusion, nonconherent red light can promote proliferation but cannot induce osteogenic differentiation of MSCs in normal media, while it enhances osteogenic differentiation and decreases proliferation of MSCs in media with osteogenic supplements.     

Down-Regulation of Osteoblastic Cell Differentiation by Epidermal Growth Factor Receptor

The role of epidermal growth factor receptors (EGF-R) in osteogenic cell differentiation was investigated using preosteoblastic MC3T3-E1 (MC3T3) cells and osteoblast-like ROS 17/2.8 (ROS) cells. When cultured in the presence of β-glycerophosphate (GP) and ascorbic acid (AA), MC3T3 cells underwent spontaneous differentiation into osteoblasts which was confirmed as they expressed osteoblast markers such as alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP) and osteocalcin (OC). Interestingly, the number of EGF-binding sites decreased during their differentiation into osteoblasts, and the osteogenic protein-1 (OP-1) treatment, which accelerated their differentiation, lowered the number of EGF-binding sites even further. On the other hand, ROS cells with high expression levels of osteoblast markers and no EGF-R, after being transfected with human EGF-R cDNA (EROS cells), expressed numerous EGF-binding sites as well as EGF-R mRNA and protein; in the process, they ceased to express osteoblast markers, indicating their dedifferentiation into osteoprogenitor cells. Both MC3T3 and EROS cells showed increased cell growth in response to EGF, whereas ROS cells did not. These results imply that the EGF/EGF-R system in osteogenic cells has a crucial function in osteoblast phenotype suppression and osteogenic cell proliferation.     

富血小板血浆对青山羊骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对体外培养的中国青山羊骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）增殖和成骨分化的影响,探讨PRP促进骨修复的细胞学机制。方法将体外培养第3代中国青山羊MSCs,分为对照组（单纯血清培养组）和PRP组（加入10%PRP复合培养）,通过相差显微镜观察细胞生长情况,于2、4、6、8d采用MTT法检测细胞增殖活性。将体外培养的第3代细胞分为对照组、地塞米松组（dexamethasone,DEX）组、PRP组,于培养第7天行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、第18天行矿化结节染色检测细胞成骨分化活性。结果相差显微镜下见PRP组细胞最先达到汇合,MTT法显示PRP组2、4、6、8d的平均吸光度（A）值分别为0.252±0.026、0.747±0.042、1.173±0.067、1.242±0.056明显高于对照组（A值分别为0.137±0.019、0.436±0.052、0.939±0.036、1.105±0.070）（P〈0.01）。与对照组比较,PRP组ALP阳性细胞数增多,矿盐沉积减少;DEX组ALP阳性细胞数减少,矿化结节形成明显增多。结论PRP能明显促进中国青山羊MSCs增殖,抑制MSCs向成骨细胞分化。     

小鼠胎肝间充质干细胞的体外成骨诱导及复合陶瓷化骨的实验研究

目的探讨小鼠胚胎肝脏间充质干细胞的体外分离培养方法，并观察其成骨分化潜能及与陶瓷化骨支架材料的复合能力。方法将小鼠胎肝组织制成单细胞悬液行原代和传代培养，流式细胞仪检测其表面标志。用化学成骨诱导体系对纯化的胎肝间充质干细胞行成骨诱导，并进行成骨功能检测。将其与经过Ⅰ型胶原表面改性的陶瓷化骨复合培养，观察细胞在其上的黏附生长情况。结果原代培养的胎肝间充质干细胞，具有集落形成能力，为梭形或多角形。易于传代，传代细胞与原代细胞大小、形态相似。流式细胞仪检测表明，传代后的细胞CD29、CD44阳性，CD34、CD45阴性，表达间充质干细胞的特征标志。成骨诱导7d后碱性磷酸酶染色可见有较多阳性细胞，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性；14d后，细胞碱性磷酸酶活性定量检测明显增高；28d后，矿化结节染色呈阳性。将细胞与经胶原表面改性后的煅烧陶瓷化骨复合培养。扫描电镜见载体上有大量细胞黏附于材料表面。结论小鼠胎肝间充质干细胞易于获取及传代；体外成骨诱导后可向成骨细胞方向分化；能在陶瓷化骨支架材料上黏附生长。