血管内皮生长因子基因转染血管内皮祖细胞治疗肢体缺血的实验研究

目的利用血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF-165）基因转染体外诱导的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,并移植到下肢缺血的新西兰兔体内,观测其促进血管新生,改善肢体缺血的效果。方法（1）梯度离心法分离兔骨髓单个核细胞,然后用含有VEGF、bFGF、IGF-1的M199培养液诱导培养EPCs。并以免疫荧光、透射电镜等方法进行鉴定。（2）用携带VEGF165基因的腺病毒质粒（Adv-GFP-VEGF165）转染所培养的细胞,ELISA法检测上清液中VEGF蛋白的表达。（3）制作兔下肢缺血模型,并将其随机分为A、B、C 3组,分别移植EPCs、VEGF165基因转染后的EPCs、M199培养基,多种方法检测移植效果及局部整合情况。结果（1）自兔骨髓诱导出梭形贴壁细胞,免疫荧光及电镜检测证实为EPCs。（2）Adv-GFP-VEGF165成功转染EPCs,ELISA法检测转染VEGF165后的EPCs其上清液中VEGF蛋白浓度明显升高。（3）Brdu示踪显示移植细胞整合到缺血局部,CTA及免疫组化检查显示VEGF-165基因转染后的EPCs移植后其改善肢体缺血效果优于其他两组。结论VEGF基因转染EPCs后能改进EPCs质量,移植后促血管新生能力增强,其效果优于未转染组。     

治疗性血管新生研究进展

基于内皮前体细胞(EPC)移植的治疗性血管新生，成为血管内皮功能紊乱和缺血性疾病的新的治疗措施，从20世纪70年代Folkman提出血管生成的概念，经过内皮细胞生长因子基因导入的治疗性血管新生到内皮前体细胞移植治疗性血管新生，对血管新生的认识发生了明显的变化。本文回顾了EPC移植的基础研究和临床试验研究，并对治疗性血管新生的临床应用前景进行了展望。源于骨髓／外周血／脐带血的EPC移植有可能成为缺血性疾病治疗的手段。     

自体骨髓CD34+干细胞移植治疗严重肢体缺血的实验研究

目的探讨自体骨髓干细胞移植是否能增加缺血肢体的新生血管形成。方法抽取5只犬骨髓20ml,经Ficoll分离单核细胞,免疫磁珠分离CD34+细胞,在体外经血管内皮细胞生长因子诱导分化为内皮细胞,并经vWF抗染色鉴定。建立犬双侧肢体缺血动物模型,将Dil荧光标记的内皮细胞植入缺血肢体中。结果CD34+干细胞移植4周后,激光共聚焦显微镜证实缺血肢体中移植的自体骨髓干细胞参与了新生血管形成;动脉造影见干细胞移植的肢体侧枝循环明显增加,微血管密度检测移植组也明显高于对照组(12.0±2.8vs.5.0±1.6/每高倍镜视野,t=4.17,P<0.05);干细胞移植的肢体ABI平均为0.58±0.14,对照肢体ABI平均为0.32±0.11,差异有统计学意义(t=2.95,P<0.05)。结论自体骨髓干细胞移植能有效的促进缺血组织内的新生血管形成。     

犬自体骨髓干细胞在缺血肢体中新生血管形成中的作用

目的:探讨犬自体骨髓干细胞在缺血组织的新生血管形成中的作用.方法:抽取犬骨髓,经免疫磁珠系统分离出CD 34细胞,体外扩增并向血管内皮细胞诱导分化;建立犬双下肢缺血动物模型,将诱导分化细胞移植入一侧缺血肢体中作为实验组,另一侧缺血肢体植入等体积的生理盐水作为自体对照组.移植后6周,检测缺血肢体中新生血管的形成.结果:细胞移植后6周,动脉造影显示实验组缺血肢体侧枝循环增加,明显多于对照组.微血管密度检测实验组为(14±2.3)个/高倍镜视野,明显高于对照组(6±2.1)个/高倍镜视野(P<0.05).激光共聚焦显微镜证实缺血肢体中移植的自体骨髓干细胞参与了新生血管形成.结论:自体骨髓干细胞移植可以促进缺血肢体组织中的新生血管形成.     

治疗性血管新生研究进展(文献综述)

基于内皮前体细胞 (EPC)移植的治疗性血管新生 ,成为血管内皮功能紊乱和缺血性疾病的新的治疗措施 ,从 2 0世纪 70年代Folkman提出血管生成的概念 ,经过内皮细胞生长因子基因导入的治疗性血管新生到内皮前体细胞移植治疗性血管新生 ,对血管新生的认识发生了明显的变化。本文回顾了EPC移植的基础研究和临床试验研究 ,并对治疗性血管新生的临床应用前景进行了展望。源于骨髓 /外周血 /脐带血的EPC移植有可能成为缺血性疾病治疗的手段     

应用转血管内皮生长因子基因治疗肢体缺血的研究

目的研究肌肉内转血管内皮生长因子(VEGF)基因治疗肢体缺血的可行性,比较各种治疗方法的疗效. 方法雄性新西兰大白兔50只,完全切除股动脉后随机分为3组.实验组为明胶海绵携载法转基因组(n=18)和肌肉内注射转基因组(n=18);只注射pcDNA3为对照组(n=14).通过直接注射法及明胶海绵携载法将构建的质粒pcDNA3-VEGF121基因转入缺血肌肉内,立即测定各组肢体髂内动脉血流量,在术后2天,1、2、3和4周应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定基因表达,术后30天通过测定缺血肢体髂内动脉血流量、动脉血管造影及组织学观察测定血管密度,评价侧支循环变化. 结果术后2天,转VEGF基因治疗的两实验组均测到基因表达,并均维持2周.术后立即测定的髂内动脉血流量各组间无明显差异.术后30天,缺血肢体髂内动脉血流量、肢体血管造影血管数目和肌肉组织血管密度转VEGF基因的两实验组均比对照组明显增高,差异有统计学意义(P<0.01),明胶海绵携载组较直接注射组亦有明显增高,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论肌肉内转VEGF基因治疗可促进急性缺血肢体侧支循环、改善血供,明胶海绵携载法较直接注射法有更好的疗效.     

肢体缺血大鼠骨髓内皮祖细胞的动员与组织血管新生的相关性研究

目的　探讨肢体缺血因素对骨髓内皮祖细胞 (EPC)的动员及肢体血管新生的影响。方法　切除、结扎单侧股总、股浅动脉建立大鼠后肢缺血模型 ,另设对照组。 1周后通过细胞培养 ,观察外周血EPC数量的变化 ,4周后检测缺血组织微血管密度 (MVD )及血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果　实验组外周血EPC (4 8.6± 7.5 )个 /mm2 较对照组 (2 3 .1± 4.3 )个 /mm2 明显增加 (P <0 .0 1) ;组织MVD (2 2 4.84± 5 .87)n/mm2 显著高于对照组 (13 6.3 0± 4.5 2 )n/mm2 (P <0 .0 1) ;实验组缺血组织VEGF表达明显增强 (吸光度值A :0 .162± 0 .0 18) ,对照组仅少量表达 (A :0 .0 5 5± 0 .0 0 6) ;外周血EPC与组织MVD、VEGF吸光度之间有非常显著相关 (P <0 .0 1)。结论　肢体缺血通过动员骨髓EPC ,促进缺血组织的新血管生成 ,改善局部供血 ,达到部分代偿目的。     

缺氧诱导因子转染内皮祖细胞治疗大鼠缺血后肢

目的 使用缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)转染内皮祖细胞(EPC)治疗大鼠后肢缺血,观察EPC、HIF-1α转染EPC对大鼠缺血后肢血管新生和肢体成活的影响.方法 制作SD大鼠后肢缺血模型,将动物随机分为3组,每组6只.将构建的HIF-1α基因真核表达载体转染入EPCs后通过尾静脉注射入大鼠体内,并与注射磷酸盐缓冲液(PBS)或EPC的大鼠进行比较,观察转染HIF-1α对新生血管形成的影响.结果 (1)EPC组、HIF组较PBS组肢体恢复率明显增加(P<0.05),EPC组肢体恢复率较HIF组差(P<0.05).(2)与PBS组比较,各时间点中EPC、HIF组微血管密度(MVD)均明显增多(P<0.05),HIF组较EPC组明显增高(P<0.05).(3)HIF组的HIF与血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达较PBS组、EPC组明显增多(P<0.05).PBS组Capase-3的表达较EPC组、HIF组明显增多(P<0.05).(4)术后7 d,各组的大鼠肢体灌注均明显降低,但EPC、HIF组细胞的血流灌注较PBS组多(P<0.01).术后14、21 d,与PBS对照组比较,HIF组的血流灌注恢复明显(P<0.01),EPC组血流灌注较HIF组少(P<0.05).结论 EPCs对大鼠缺血后肢的局部血管新生有明显促进作用,联合应用HIF-1α和EPCs有更优的治疗效果.     

干细胞移植治疗肢体缺血应趋向标准化

干细胞具有高度自我更新及多向分化潜能,特定条件下能增殖、分化为血管内皮祖细胞,促进缺血肢体的血管新生.干细胞移植治疗肢体缺血性疾病具有广阔的应用前景,开展相关的标准化研究具有重要的意义.     

腺相关病毒介导的血管内皮生长因子基因与内皮祖细胞联合治疗肢体缺血

目的探讨腺相关病毒(AAV)介导的人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因转染的兔骨髓内皮祖细胞(EPCs)自体移植对于移植细胞存活率和缺血肢体血管再生的影响。方法构建、制备携带hVEGF165基因或β-半乳糖苷酶(β-gal)基因的AAV载体AAV-hVEGF165和AAV- LacZ;用AAV—hVEGF165和AAV-LacZ分别转染体外培养的EPCs,得到AAV/VEGF-EPC和AAV/LacZ-EPC,用RT-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术检测外源基因的表达。分别用AAV/VEGF-EPC、AAV/LacZ-EPC和PBS自体移植于兔右下肢缺血的肌组织,28 d后行双侧肢体血流和免疫组织化学检测。结果AAV/VEGF—EPC和AAV/LacZ-EPC内可检测到外源基因的表达。AAV/VEGF—EPC、AAV/LacZ-EPC和PBS组患/健侧血流比值、毛细血管密度分别为0.73±0.21、0.64±0.13、0.45±0.10;(962±291)、(557±132)、(361±69)/mm2。AAV/VEGF-EPC和AAV/LacZ-EPC组移植成活的EPCs密度分别为(330±81)/mm2和(204±55)/mm2。结论AAV能够高效将外源基因转入EPCs,对其进行基因修饰。自体移植AAV-hVEGF165转染的EPCs可提高其移植存活率和增强其促进缺血肢体血管再生能力。