绿脓杆菌制剂对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨绿脓杆菌制剂(pseudomonas aeruginosa vaccine,PA)对有转移潜能的人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 采用不同浓度的PA分别作用于MHCC97L细胞,观察细胞增殖、生长曲线、克隆形成率、流式细胞术分析(FCM)、侵袭、运动、迁移、VEGF和MMP2蛋白表达(ELISA法).结果 PA明显抑制MHCC97L细胞增殖和克隆形成,呈良好的剂量-效应关系.PA 48 h和72 h的IC50分别为3.1×108/ml和1. 9×108/ml.PA浓度为0.5×108/ml、1×108/ml和2×108/ml时,其细胞倍增时间依次增加,克隆形成率依次降低(P均＜0.01);FCM显示,G1期细胞比例随PA浓度增加而增加,S+G2期细胞比例随PA浓度增加而降低(P均＜0.01).PA浓度为1×108/ml时,穿过人工基底膜(侵袭实验)和上室底膜(运动实验)的细胞数(分别为4.8±1.3和8.8±2.2)明显低于对照组(8.6±2.1和15.6±1.2)(P均＜0.01);细胞经72 h培养后,对照组划痕逐渐愈合,1×108/ml的PA组细胞划痕依然明显.ELISA法检测发现,1×108/ml的PA组其VEGF蛋白和MMP2蛋白含量和对照组相比均无明显差异(P均＞0.05).结论 在一定条件下,绿脓杆菌制剂可抑制人肝癌MHCC97L细胞增殖和克隆形成,其作用部分是通过使细胞周期阻滞在G1期实现的;绿脓杆菌制剂可以明显抑制MHCC97L细胞的侵袭、运动和迁移能力,其作用和VEGF、MMP2蛋白分泌关系不明显.     

绿脓杆菌制剂对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

Objective To investigate the effects of Pseudomonas aeruginosa vaccine (PA) on proliferation and invasiveness of the hepatocellular carcinoma cell line MHCC97L with metastatic potential. Methods Proliferation, growth curve, plate efficiency, flow cytometry, transwell invasion assay, cell motility assay, scarification test, vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase-2 (MMP2) protein activity were evaluated after cells were treated with PA at various concentrations. Results PA can inhibit the proliferation and plate efficiency of MHCC97L cell markedly in a dose-dependent manner. The IC50 of cells treated with PA for 48 h and 72 h was 3.1 ×108/ml and 1.9 × 108/ml, respectively. The doubling time increased and plate efficiency decreased gradually when cells treated with 0.5 × 108/ml, 1 × 108/ml and 2 × 108/ml PA (P＜0.01). PA could induce cell cycle arrest at the G1 phase in a dose-dependent manner by flow cytometric analysis. The average amount of invading cell per field in cell invasion assay and motility assay were 4. 8 ± 1.3 and 8. 8±2.2 when cells treated with 1× 108/ml PA, which was significantly lower than that of control group (8. 6±2. 1 and 15. 6±1.2 ) (P＜0.01) Scarification test showed that the metastatic ability of cells treated with 1 × 108/ml PA significantly lower than that in the control group. Comparison between cells treated with 1 × 108/ml PA and control group, no remarkable difference was found regarding expression of VEGF and MMP2 in supernatant of cell culture. Conclusion PA can inhibit proliferation and plate efficiency of HCC cell line MHCC97L, which is in part mediated by the cell cycle arrest at the G1 phase. PA could inhibit invasiveness of HCC cell line MHCC97L, which is unrelated to the VEGF and MMP2 protein activity.     

加热联合吲哚美辛对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 观察水浴加热联合吲哚美辛对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 42℃水浴加热前2h加入0.2 mmol/L吲哚美辛,加热组不加药,对照组不加热、不加药,其他处理相同并在同一时间点观察.在不同的时间观察细胞增殖、生长曲线、克隆形成率、流式细胞术(FCM)分析细胞周期、侵袭、运动、血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶(MMP)-2蛋白表达[酶联免疫吸附试验(ELISA)法].结果 与对照组比较,加热+吲哚美辛明显抑制MHCC97L细胞增殖(P＜0.01),其最大抑制效应为加热后48 h(53.6％),细胞倍增时间延长了2.07倍;加热+吲哚美辛组48、96 h的细胞集落形成率均明显降低(P ＜0.01);FCM显示,吲哚美辛能逆转加热对细胞周期的影响,加热+吲哚美辛组48 h和96 h的G1期细胞比例均明显升高,S+G2期细胞比例均明显降低(P＜0.05).加热+吲哚美辛组48 h和96 h相同数量的细胞穿过人工基底膜到达Transwell小室膜背面的细胞平均数(侵袭实验)和穿过Transwell小室膜到达背面的MHCC97L细胞平均数(运动实验)均明显低于加热组(P＜0.01);ELISA法检测发现,加热+吲哚美辛组48、96 h的分泌量均明显低于加热组(P＜0.05).结论 吲哚美辛抑制体外加热后肝癌细胞的增殖,其作用和抑制细胞进入DNA合成期和分裂期有关;进一步抑制其侵袭运动能力,其作用和MMP-2、VEGF表达降低有关.     

消炎痛对人肝癌MHCC97L细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察消炎痛(Indomethacin)对有转移潜能的人肝癌MHCC97L细胞增殖和细胞周期的影响.方法 采用0.1、0.2、0.5 mmol/L消炎痛分别作用于MHCC97L细胞,观察细胞增殖、克隆形成率、形态学、生长曲线、流式细胞术分析(FCM).结果 消炎痛明显抑制MHCC97L细胞增殖和克隆形成,呈良好的剂量.效应关系.0.1、0.2、0.5 mmol/L消炎痛处理组细胞增殖抑制率依次升高,克隆形成率依次降低(P均<0.01),镜下可见明显的形态学改变.其中,0.5 mmol/L消炎痛组24、48、72 h细胞增殖抑制率分别为50.6%、47.1%、43.4%;集落形成率为(0.00±0.00)%.0.1、0.2、0.5 mmol/L消炎痛处理组细胞倍增时间分别为110.1、199.3、-614.2 h,与对照组(58.6 h)比较,0.1、0.2 mmol/L消炎痛处理组细胞倍增时间分别延长了2.17倍和3.40倍,而0.5mmol/L消炎痛处理组第6天的细胞均数[(3.4±0.4)×104个]少于初始细胞数(4×104个)结果细胞倍增时间为负值而无法计算.FCM显示,G1期细胞比例随消炎痛浓度增加而增加,S+G2期细胞比例随消炎痛浓度增加而降低(P均<0.01).结论 在一定条件下,消炎痛可抑制人肝癌MHCC97L细胞增殖和克隆形成,其作用部分是通过使细胞周期阻滞在G1期实现.     

野菊花提取物对人肝癌MHCC97H细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察中药野菊花提取物(chrysanthemum indicum extact,CIE)对人肝癌MHCC97H 细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制.方法 体外培养人肝癌MHCC97H细胞,以0.4、0.8、1.2 mg/ml的CIE(实验1、2、3组)作用于MHCC97H细胞,并设立空白对照组.分别于药物作用24、48、72 h时,应用MTT法检测细胞增殖情况.于药物作用24 h时,用AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡、Rhol23检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)变化;Western blot检测细胞色素C、Caspase-9、-3的蛋白表达.结果 三种浓度的CIE对MHCC97H细胞的增殖均有明显的抑制作用,且呈明显的时间和浓度依赖性.与对照组相比,各实验组MHCC97H细胞的凋亡率明显增高(P＜0.05),线粒体膜电位水平明显降低(P＜0.05),细胞色素C、Caspase-9和-3的蛋白表达显著增强(P＜0.05),以上各项均呈明显的量效关系.结论 野菊花提取物对肝癌MHCC97H的增殖具有抑制作用,这可能与药物诱导肝癌细胞凋亡有关.线粒体途径可能是CIE诱导MHCC97H细胞凋亡的主要机制之一.     

甲泼尼龙对人肝癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响

目的探讨甲泼尼龙(MP)对人肝癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响及机制。方法建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型20只,随机分为对照组、MP小剂量组、MP大剂量组。用药4周后观察裸鼠重量、肿瘤体积和重量、肿瘤组织切片透射电镜检查、放射免疫法测定血AFP浓度、荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达。结果MP大剂量组肿瘤重量(1.62±0.12)Vs(1.33±0.19)g、体积(0.63±0.05)Vs (0.56±0.05)cm3大于对照组,该组裸鼠血AFP浓度高于对照组(7.5±1.14 Vs(5.98±0.78)μg/L,VEGF mRNA、MMP-2 mRNA表达显著增加。结论MP大剂量可以上调VEGF mRNA、MMP- 2 mRNA的表达,促进肝癌细胞生长、转移,小剂量无影响。     

放射后肝癌细胞MMP-2表达、活性的变化及其对侵袭性的影响

目的 探讨放射后肝癌细胞侵袭潜能的变化及其机制.方法 以不同剂量(0、4、8Gy)高能X线照射人肝癌低转移潜能细胞株MHCC97L.明胶酶谱法检测放射后24、48、72、96 h细胞培养上清液金属蛋白酶(MMP)-2活性,细胞免疫荧光法检测放射后24、48和72 h细胞内MMP-2蛋白表达,Transwell法测定放射后48和96 h细胞的侵袭能力.结果 放射后细胞MMP-2蛋白分泌及活性增强并与放射剂量及时间相关,8 Gy放射后48 h MMP-2蛋白活性最高,达到对照组的2倍.0、4、8 Gy放射后48 h穿过transwell小室的细胞数分别为7.2±1.9、13.2±2.7和31.2±7.2(P＜0.05),放射后96 h组间差异无统计学意义.结论 放射后肝癌细胞侵袭潜能短暂增强,放射诱导细胞MMP-2分泌及活性增强是侵袭性增强的原因之一.     

加热对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

我们通过建立低转移潜能人肝癌细胞株MHCC97L[1]观察水浴加热对肝癌细胞体外增殖、侵袭运动能力的影响. 一、材料与方法 MHCC97L细胞培养瓶或培养板密封后浸没于42℃恒温水浴箱内加热,30min×2,间隔10min.     

绿脓杆菌制剂抑制肝细胞肝癌生长转移的实验研究

目的 观察绿脓杆菌制剂对裸鼠肝癌生长和转移的抑制作用.方法 将具有肺转移潜能的人MHCC97L肝癌组织块种植于BALB/c nu/nu雄性裸鼠肝脏,建立转移性人肝癌裸鼠原位模型.荷瘤裸鼠随机分为对照组、绿脓杆菌制剂腹腔注射组及皮下注射组.各组均于种植后第3天开始用药,于种植后第6周末处死动物,HE染色观察肿瘤组织坏死情况,荧光Tunel法检测肿瘤组织细胞凋亡情况,测量肿瘤体积,计算抑瘤率、肺转移灶数目及肺转移率.结果 对照组、绿脓杆菌制剂皮下注射组和腹腔注射组肿瘤体积分别为(3.12±0.85)cm~3、(1.90±0.87)cm~3(P>0.05)和(0.79±0.36)cm~3(P<0.05),肺转移率分别为66.7%、66.7%(P>0.05)和0(P<0.01),平均肺转移灶数目分别为2.40±1.85,1.2±0.75(P<0.05)和0(P<0.01),凋亡指数分别为(1.4±0.37)%、(4.1±1.7)%(P<0.05)和(10.3±0.40)%(P<0.01).与对照组比较,绿脓杆菌制剂皮下注射组和腹腔注射组的抑瘤率分别为39.1%和74.7%,腹腔注射组肿瘤组织坏死明显.结论 绿脓杆菌制剂腹腔注射可明显促进肝癌组织坏死及凋亡并抑制其生长和转移.     

高/低转移人肝癌细胞株MHCC97-H/L中侧群细胞分析

目的观察高／低转移人肝癌细胞株MHCC97-H／L是否存在侧群（SP）细胞并鉴定其致瘤性。方法MHCC97-H／L予Hoechst33342和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）荧光染色；流式细胞分选MHCC97．H／L中SP细胞，分选后细胞皮下接种非肥胖性糖尿病联合免疫缺陷（NOD／SCID）小鼠，观察成瘤情况。结果Hoechst33342和CFSE染色结果显示，MHCC97-H／L中未染色细胞分别为（4．02±0．02）％／（1．02±0．01）％，流式细胞分选结果示MHCC97-H／L中sP细胞为（4．88±0．66）％／（0．88±0．36）％，比例差异有统计学意义（P〈0．05）。体内成瘤实验显示，SP细胞只需1×10。个即可在NOD／SCID小鼠皮下成瘤（5／6），而1×10^6个非SP细胞均未成瘤（0／6）。结论高／低转移人肝癌细胞株MHCC97-H／L中均存在SP细胞亚群，但前者比例显著高于后者。肝癌SP细胞具有极高的致瘤性，并可能和肝癌转移潜能相关。     

VK2对肝癌细胞株MHCC97H的抑制作用

目的 观察VK2对MHCC97H细胞在生长、黏附、侵袭、凋亡以及Caspase-3活性的影响.方法 噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长;体外细胞黏附及侵袭实验检测细胞的黏附和侵袭能力;Annexin V-FITC Apoptosis Detection K和Caspase-3 Fluorescent Assay试剂盒分别检测细胞的凋亡及Caspase-3活性.结果 当VK2浓度从10-7mol/L增加到10-4mol/L时,细胞生长抑制率由12.5%增加到59.7%(P＜0.01).VK2对细胞的黏附抑制能力呈剂量依赖关系(P＜0.01);100μmol/L的VK2作用细胞3 h后,细胞对Fibronectin黏附抑制率为69.9%.作用48 h后,细胞侵袭抑制率为65.5%(P＜0.01);作用6 h后,细胞凋亡率为(28.5±1.6)%,与此同时,细胞Caspase-3活性为(226.0±6.4),与对照组(92.0±5.8)比较差异有统计学意义(P＜0.01);预先加入Caspase-3抑制剂(Z-VAD-FMK)后,Caspase-3活性无明显变化90.0±4.3(P＞0.05).结论 VK2对体外培养的MHCC97H细胞具有抑制生长、抑制黏附、抑制侵袭和诱导凋亡作用;Caspase-3参与了细胞凋亡的调控.     

人肝癌细胞系MHCC97中趋化因子差异表达研究

目的 检测人肝癌细胞系MHCC97-L和MHCC97-H中趋化因子的mRNA表达水平,了解不同转移潜能的癌细胞系在组成性表达趋化因子方面的异同,寻找影响癌细胞生长、侵袭和转移的关键性趋化因子。方法 收获不加任何刺激的转移性由低到高的人肝癌细胞MHCC97-L和MHCC97-H。AGPC法提取总RNA,以持家基因GAPDH为对照,逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)分析C、CC、CXC和CX3C族趋化因子代表的XCL1(Ltn)、CCL5(RANTES)、CXCL8(IL-8)、CX3CL1(Fkn)等的mRNA水平。结果 代表不同家族的4种趋化因子基因在两种细胞系中均呈组成性表达,但XCL1和CCL5在两种细胞系中的表达差异有显著性(P=0.021,P=0.042)。结论 肝癌细胞可组成性地表达目前所知的4个家族的趋化因子,其表达水平可因癌细胞的转移潜能不同而异,提示具有不同结构特征的趋化因子可能以自分泌或旁分泌方式参与癌细胞生长及转移的调节,进一步阐明这些趋化因子产生的意义及其调控机制是有必要的。     

骨化三醇加碘油抑制人肝癌MHCC97细胞的研究

目的探讨骨化三醇加碘油对MHCC97肝癌细胞增殖能力的影响及其对肝细胞生长因子（HGF）及受体c-met表达的调控作用。方法分别用10^-6～10^-9mol/L的骨化三醇、0.5%的碘油＋10^-6mol/L浓度的骨化三醇及单用0.5%的碘油处理人肝癌MHC97-H、MHC97-L细胞系,分别作用48、72、96h后,MTT法检测细胞的增殖能力。用骨化三醇、碘油＋骨化三醇处理细胞72h后,酶联免疫法（ELISA）定量测定细胞上清HGF浓度;逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测肝癌细胞内维生素D受体（VDR）及c-met mRNA表达。结果MHCC97-H、L两株细胞系均有维生素D受体（VDR）表达。骨化三醇对MHCC97-H、L两株细胞均有不同程度的增生抑制作用,以10^-6mol/L骨化三醇的浓度抑制效果最好,72h效果最佳。第4天碘油加骨化三醇对细胞增生的抑制作用强于单用骨化三醇。MHCC97-H、L细胞均有HGF的分泌,单用骨化三醇处理细胞后,HGF水平下降不明显,而加碘油作用于MHCC97-H细胞后,HGF水平下降明显（P=0.043）。两株细胞均表达c-met mRNA,而用骨化三醇处理细胞后,c-met mRNA表达明显减弱。结论骨化三醇抑制人肝癌细胞MHCC97的增生,骨化三醇对HGF/c-met表达的抑制作用可能是其抗肝癌机制之一;溶于碘油中的骨化三醇能发挥更为持久、有效的作用。     

HGF／Met通路对肝癌细胞株MHCC97-H干细胞样表型的影响

目的观察HGF／Met通路对肝癌细胞株MHCC97-H干细胞样表型的影响,探讨其可能的作用机制。方法体外培养肝癌细胞株Huh7和MHCC97-H,采用细胞免疫荧光染色技术筛选高表达Met的肝癌细胞株MHCC97-H,将其分为4组：空白组（不做处理）、HGF刺激组（50μg/L HGF）、抑制组（50μg／LHGF＋1mol／LHGF抑制剂PHA665752）和表皮生长因子（EGF）／成纤维细胞生长因子（FGF）刺激组（50μg/LHGF＋20μg/LEGF＋20μg/LFGF）。Westernblot检测前3组MHCC97-H细胞中Met和磷酸化Met（p-Met）蛋白的表达。培养24h后光镜下观察前3组细胞形态学变化。克隆球形成实验检测4组细胞克隆球形成能力。荧光实时定量PCR检测空白组和HGF刺激组不同时间点（2、4、8、16、24h）MHCC97-H细胞中多能干细胞相关基因表达变化。计量资料采用x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析和重复测量的方差分析,两两比较采用LSD—t检验。结果细胞免疫荧光染色检测结果显示：肝癌细胞株MHCC97-H与Huh7细胞比较．前者高表达Met,将其作为后续研究对象。Westernblot检测结果显示：空白组、HGF刺激组和抑制组细胞中Met蛋白的相对表达量分别为0．44±0．04、0．37±0．03和0．41±0．04,3组比较,差异无统计学意义（F=2．31,P〉0．05）。而3组细胞中p-Met蛋白的相对表达量分别为0．020±0．010、0．070±0．020和0．010±0．000,3组比较,差异有统计学意义（F=34．11,P〈0．05）,其中HGF刺激组p-Met蛋白的表达水平高于空白组和抑制组（t=3．87,5．20,P〈0．05）。HGF刺激组MHCC97-H细胞形态呈现长梭状问质样改变,而抑制组和空白组细胞形态相似,呈上皮样。克隆球形成实验结果表明：空白组、HGF刺激组、抑制组和EGF／FGF刺激组克隆球数目分别为0、（35．0±6．3）个、（4．3±1．5）个和（54．3±2．5）个,4组比较,差异有统计学意义（F：511．28,P〈0．05）,其中HGF刺激组克隆球数目多于空白组和抑制组（t=9．62,8．21,P〈0．05）,而少于EGF／FGF刺激组（t=4．93,P〈0．05）。实时定量PCR检测结果显示：空白组和HGF刺激组不同时间点（2、4、8、16、24h）C—myemRNA相对表达量分别为1．00±0．11、1．68±0．09、1．08±0．24、1．18±0．13、0．78±0．14、1．06±0．04;Klf4mRNA分另1为1．00±0．20、1．43±0．16、0．87±0．28、1．19±0．29、2．17±0．43、1．41±0．06;Oct4mRNA分别为1．00±0．12、0．54±0．12、0．69±0．19、1．08±0．12、1．62±0．30、0．97±0．11,空白组和HGF刺激组不同时间点上述各指标比较,差异均有统计学意义（F=13．64,8．52,13．56,P〈0．05）;HGF刺激组2hc—myemRNA相对表达量达到峰值,与空白组比较,约升高了1．68倍（t=8．29,P〈0．05）,HGF刺激组16hK]f4mttNA相对表达量达到峰值,与空白组比较,约升高了2．17倍（t=4．27,P〈0．05）,HGF刺激组16hOct4mRNA相对表达量达到峰值,与空白组比较,约升高了1．62倍（t=3．32,P〈0．05）。结论HGF／Met通路的活化能够诱导肝癌细胞MHCC97-H的干细胞样表型转化,其可能作用机制是通过增加多能干细胞相关基因的表达而实现的。