转化生长因子-β1小干扰RNA对胃癌细胞生物学行为的影响

目的探讨载体介导的转化生长因子(TGF)-β1小干扰RNA(siRNA)对人胃癌细胞株SGC-7901生物学行为的影响。方法构建TGF-β1特异性siRNA真核表达载体。转染胃癌细胞72 h后,以半定量逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测细胞中TGF-β1的mRNA和蛋白表达的变化；以噻唑蓝(MTT)比色法、流式细胞术、细胞附壁试验和Miliicell小室测定细胞增殖、周期、体外黏附和侵袭力,并观察裸鼠体内成瘤性。结果与未处理组比较,TGF-β1-siRNA载体能明显下调TGF-β1 mRNA[(0．910±0．066)与(0．617±0．025)比较,P＜0．01]和蛋白[(120．00±8．72)与(41．00±5．57)比较,P＜0．01]。在胃癌细胞中的表达；细胞抑制率达30．18%,体外黏附、侵袭力下降,裸鼠体内成瘤性受到抑制。结论载体介导的TGF-β1 siRNA可显著下调TGF-β1在胃癌细胞中的表达,在一定程度上抑制其恶性生物学行为。     

RNA干扰抑制Cyr61表达对人脑胶质瘤细胞生物学行为的影响

目的 观察RNA干扰技术沉默Cyr61基因表达对人脑胶质瘤U251细胞生物学行为的影响.方法 针对Cyr61 mRNA的序列设计合成小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pRNAT-Cyr61重组质粒,转染人脑胶质瘤U251细胞;RT-PCR和Western blot检测其对U251细胞内源性Cyr61表达的影响;用噻唑蓝(MTT)比色法观察U251细胞体外增殖活性的变化;用Transwell 小室法检测U251细胞体外侵袭能力的改变;流式细胞仪检测U251细胞凋亡并用透射电镜观察凋亡后的细胞形态学变化.结果 pRNAT-Cyr61重组质粒在mRNA及蛋白水平分别显著抑制Cyi61基因表达,抑制率分别最高达到74.87%和78.23%;U251细胞的体外生长抑制率最高达68.15%,侵袭细胞数下降至(46.00±2.82)个;U251细胞凋亡率最高达53.16%.结论 pRNAT-Cyt61可抑制Cyr61在人脑胶质瘤U251细胞中的表达,并抑制细胞的增殖活性和侵袭能力,促进细胞凋亡.     

小干扰RNA靶向抑制Ezrin蛋白对人乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响

目的 探讨膜-细胞骨架联接蛋白Ezrin对人乳腺癌MCF-7细胞生长和侵袭能力的影响.方法 采用小干扰RNA方法下调人乳腺癌MCF-7细胞中Ezrin的表达,分别通过RT-PGR和Western blot检测siRNA下调Ezrin基因和蛋白表达的水平.并采用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪榆测细胞周期,Transwell实验检测细胞侵袭能力. 结果 RT-PCR和Western blot结果显示,RNA干扰后Ezrin基因蛋白水平均明显下调(F=41.97,P＜0.01),RNA干扰后MCF-7细胞G2-M期细胞比例下降(t=-5.997,P＜0.01);细胞凋亡增加(t=4.479,P＜0.01);细胞的侵袭能力下降,穿过人工基底膜的细胞数量明显减少(t=5.268,P＜0.01).结论 Ezrin在乳腺癌生长和侵袭转移过程中发挥重要作用.     

移植性大鼠恶性垂体腺瘤模型的建立及其生物学特性

目的　建立一种符合临床垂体腺瘤生物学特征的动物模型。方法　体外培养大鼠恶性垂体腺瘤细胞 (mGH3) ,通过立体定向将mGH3细胞 1× 1 0 9个 /L移植至大鼠 1侧侧脑室 ,病理检查移植瘤生长情况 ,放射免疫法监测循环中大鼠生长激素 (rGH)水平。结果　体外培养的mGH3细胞具有分泌rGH的能力 ,大鼠脑室内接种mGH3细胞后 3周 ,出现肢端肥大、尾巴增粗、毛发增多、结膜水肿等改变 ,荷瘤鼠平均生存 ( 4 4.2± 5.6)d ,肿瘤向周围脑组织浸润性生长 ,肿瘤细胞异形性明显 ,肿瘤新生血管丰富 ;从第 3周起大鼠循环中rGH水平逐渐升高直至死亡。结论　同种移植性大鼠恶性垂体腺瘤具有浸润性、高血运性和释放生长激素的能力 ,是一种较理想的垂体腺瘤动物模型     

特异性小干扰RNA靶向沉默KCNN4基因对LoVo细胞生物学影响

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对结肠癌细胞LoVo的KCNN4基因表达及其生物学行为的影响.方法 将实验分别空白对照组和实验转染组进行实验.合成针对KCNN4基因的特异性siRNA并转染至结肠癌细胞LoVo中,实时定量逆转录－聚合酶链式反应以及Western blot分别检测KCNN4mRNA以及蛋白的变化,CCK-8法检测LoVo细胞增殖的变化以及Transwell检测LoVo细胞增殖和侵袭的能力的变化.结果 成功合成KCNN4-siRNA并转染入LoVo细胞中.RT-PCR以及Western blot结果提示与对照组比较,KCNN4-siRNA可以明显抑制KCNN4mRNA以及蛋白的表达,抑制率分别为72.0％、49.6％ (P＜0.05).同时KCNN4-siRNA可以明显抑制LoVo细胞的增殖(P＜0.05).另外KCNN4-siRNA可以明显抑制LoVo细胞的迁移能力(45.23±3.52比66.42±1.47)和侵袭能力(28.13±1.64比42.78±2.33).结论 KNN4-siRNA可以有效抑制结肠癌LoVo细胞KCNN4基因的表达,从而有效的抑制肿瘤的增殖、迁移和侵袭.     

c-myc靶向小干扰RNA诱导乳腺癌细胞凋亡的作用

目的构建小干扰RNA(siRNA)表达载体,体外观察其诱导乳腺癌细胞凋亡效应。方法基因克隆技术构建人cmyc癌基因特异性siRNA表达载体,体外转染MCF7,48h后检测c-myc癌基因表达状况并观察MCF7凋亡诱导效应。结果(1)成功构建siRNA表体载体:pEGFP-C1/U61、pEGFP-C1/U62和pEGFP-C1/U63;(2)siRNA表达载体转染MCF748h后,pEGFP-C1/U62组显著抑制胞内c-myc表达(80%);(3)转染24h和48h后,pEGFP-C1/U62组凋亡率分别为11.01%和21.30%,明显高于对照组(P<0.01)。结论构建的cmyc靶向siRNA表达载体能显著下调cmyc在MCF7中的过表达,诱导乳腺癌细胞株MCF7凋亡。     

小干扰RNA特异性沉默c-myc基因对人胰腺癌SW1990细胞生物学影响

目的 观察小干扰RNA(siRNA)沉默c-myc基因的表达对人胰腺癌细胞株SW1990细胞生物学影响.方法 用siRNA沉默胰腺癌SW1990细胞中c-myc基因,用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)及Western blot技术检测c-myc mRNA及蛋白的表达量;噻唑蓝(MTT)法检测siRNA沉默c-myc基因对SW1990细胞增殖的影响;膜联蛋白V/碘化丙锭(Annexin V/PI)双染流式细胞术检测沉默c-myc基因细胞凋亡水平;Transwell细胞迁移实验检测siRNA沉默c-myc基因对SW1990细胞迁移能力的影响.结果 靶向c-myc的特异性siRNA可以高效抑制人胰腺癌SW1990细胞c-myc基因表达,在mRNA水平(0.263±0.048)较转染对照质粒组(0.970±0.012)明显降低,c-myc蛋白质表达量及细胞增值率均较转染对照质粒组明显降低;转染后48 h c-myc siRNA组细胞凋亡率为(19.90±2.09)％,明显高于siRNA阴性对照组(4.93±0.25)％和空白对照组(4.40±0.34)％;Transwell实验结果示细胞穿膜数c-myc siRNA组[(34.3±1.2)个]较siRNA-NC组[(68.3±5.8)个]和空白组[(72.3±1.2)个]均明显降低.结论 c-myc siRNA能够显著抑制c-myc基因在人胰腺癌SW1990细胞中的表达,降低细胞的增殖和迁移能力,促进细胞的凋亡.     

小干扰RNA对LNcap细胞CXCR4基因表达的影响

目的:研究小干扰RNA(siRNA)对LNcap细胞中CXC趋化因子4(CXCR4)基因表达的影响。方法:用针对CXCR4基因的siRNA表达质粒pSilencer-CXCR4转染人前列腺癌细胞株LNcap细胞,用RT-PCR方法检测其CXCR4基因表达水平的变化。结果:重组体pSilencer-CXCR4转染LNcap细胞后,能明显抑制CXCR4基因的表达;转染48 h后,其表达水平下降75%,与空白对照组和阴性对照组比较,其差异有统计学意义(P<0.01)。结论:利用RNA干扰技术能有效抑制靶基因的表达,为下一步有关CXCR4的研究奠定一定的基础。     

抗血小板衍生生长因子小干扰RNA表达质粒构建及其对肝星状细胞的影响

目的 研究靶向PDGF-B链的小干扰RNA(siRNA)对肝星状细胞(HSCs)细胞外基质分泌的影响.方法 根据PDGF-B链序列设计合成siRNA序列,将siRNA序列插入pSilencer 3.1-H1hygro质粒,酶切后测序鉴定;PDGF-B链siRNA表达质粒转染HSCs,潮霉素筛选阳性细胞株,RT-PCR和Western blot分别检测PDGF Mrna和蛋白的表达;将各组筛选的阳性HSCs细胞株培养,MTT观察各组细胞增殖,放射免疫法检测HSCs细胞株上清液中透明质酸和Ⅲ型前胶原的表达. 结果 成功构建3种表达PDGF-B链siRNA表达质粒,RT-PCR和Western blot结果表明各siRNA表达质粒阳性HSCs细胞PDGF Mrna和蛋白表达均有明显抑制.PDGF-B链siRNA表达质粒HSCs细胞组较对照组能明显降低HSCs增殖,下调透明质酸和Ⅲ型前胶原表达.结论 靶向PDGF-B链的siRNA能降低HSCs增殖和分泌细胞外基质的能力,具有抗纤维化治疗的潜力.     

小干扰RNA引发多药耐药乳腺癌细胞内MDR1基因沉默的研究

目的　研究小干扰RNA(siRNA)抑制耐药乳腺癌细胞系MDR1基因表达的可行性。方法　选用耐阿霉素人乳腺癌细胞系MCF7/ADR及其药物敏感细胞系MCF7作为研究对象。将预先设计的siRNA包装入质粒载体 ,然后转化质粒到大肠杆菌中 ,经过克隆、扩增、纯化后转染到MCF7/ADR细胞中 ,10 0mg/L潮霉素筛选 2周 ,用流式细胞术从蛋白水平检测P gp的表达率 ,及作实时定量聚合酶链式反应从基因转录水平检测MDR1基因的表达率。结果　流式细胞术检测结果显示 ,MCF7/ADR细胞经特异性siRNA作用后P gp的表达率由99.8%下降到 12 .3 % ;作为阳性对照的转染过GFP基因的LA795细胞的GFP蛋白表达率由 74.8%下降到 10 .6%。实时相对定量PCR检测结果显示 ,MCF7/ADR细胞经特异性siRNA作用后其Ct值由 2 5 .2 2增加到 3 0 .64。结论　siRNA能抑制人乳腺癌多耐药细胞系MCF7/ADR内MDR1基因表达 ,从而为逆转肿瘤细胞的耐药性提供了一种新的方法。     

小分子干扰RNA沉默人结直肠癌HT-29细胞TCF21基因对Kiss-1基因表达的影响

目的 观察小于扰RNA(siRNA)沉默结直肠癌HT-29细胞TCF21基因对Kiss-1基因表达的影响,以及细胞增殖、侵袭及迁移能力等生物学行为的变化.方法 利用脂质体lipofectamineTM 2000将siRNA稳定转染结直肠癌HT-29细胞,实验分为干扰组、阴性对照组、空白对照组;应用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)与Western blot技术检测TCF21与Kiss-1基因mRNA与蛋白的表达水平,分别采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法和Transwell小室法检测干扰前后细胞增殖、侵袭与迁移能力的变化.结果 siRNA干扰后成功沉默了HT-29细胞TCF21基因的表达,Kiss-1基因mRNA的表达量为0.58 ±0.02,较对照组的1.00±0.00明显降低(P＜0.05),蛋白表达量为0.3491±0.0009,与对照组比较(0.8485 ±0.0016)亦出现明显下降(P＜0.05),同时细胞增殖、侵袭及迁移能力均明显增强(P＜0.01).结论 沉默TCF21基因的表达可以下调结直肠癌细胞Kiss-1基因的表达水平,并导致相应生物学行为的变化,因此TC F21基因可能是Kiss-1基因的上游调控因子.     

小分子干扰RNA对胃癌MGC803细胞E2F-1表达及其生物学行为的影响

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对胃癌MGC803细胞E2F-1基因表达及其生物学行为的影响.方法 将实验组(E2F-1-siRNA)和阴性对照组(negative control-siRNA)转染进MGC803细胞,48 h后采用实时定量聚合酶链反应(PCR)及Western blot技术分别检测E2F-1 mRNA及蛋白的表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测MGC803细胞增殖的变化,流式细胞仪检测MGC803细胞周期变化.结果 E2F-1-siRNA有效抑制胃癌细胞E2F-1 mRNA和蛋白的表达并且影响MGC803细胞的增殖,与阴性对照组及未转染组细胞比较mRNA降低了84.8%和85.3%(F=14.35,P＜0.05),蛋白降低T77.2%和79.6%,MGC803细胞增殖分别抑制了69.0%和81.6%,差异有统计学意义(F=170.18,P＜0.05);同时E2F-1-siRNA促使更多MGC803细胞DNA含量聚集于G2/M期附近,G2/M期DNA含量比例为(54.98±3.46)%,与阴性对照组(44.70±3.82)%和未转染组(31.47±2.12)%比较,差异有统计学意义(F=88.90,P＜0.05).结论 E2F-1-siRNA可以有效抑制人胃癌MGC803细胞E2F-1 mRNA及蛋白的表达,使G1 期细胞的DNA含量下调,细胞分裂停滞在G2/M期附近,抑制胃癌细胞的增殖.     

小干扰RNA沉默Y盒结合蛋白-1基因对肺腺癌A549细胞株表皮生长因子受体表达的影响

目的 观察Y盒结合蛋白-1(YB-1)小干扰RNA (siRNA)对肺腺癌A549细胞株表皮生长因子受体(EGFR)的影响.方法 针对YB-1 mRNA设计特异性siRNA及Control siRNA序列转染至A549细胞株,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测空白组、单纯Lipofectamine 2000处理组、Control siRNA组及YB-1 siRNA组细胞中YB-1和EGFR在mRNA和蛋白水平的表达;通过噻唑蓝(MTT)、侵袭实验观察各组细胞的生物学行为变化.结果 RT-PCR和Western blot结果显示实验组YB-1与EGFR的mRNA和蛋白表达降低(分别为0.3820±0.0094、0.4690±0.0032和0.1820±0.0073、0.4210±0.0049),与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).MTT检测转染72 h后YB-1 siRNA组吸光度值为1.34 ±0.11,同时转染48 h后YB-1 siRNA组侵袭能力较对照组明显降低(P＜0.05).结论 YB-1 siRNA能抑制肺腺癌A549细胞株中EGFR的表达,影响肿瘤增殖和侵袭能力.     

肿瘤靶向性细胞穿膜肽介导小分子干扰RNA对肝癌细胞的抑制作用

目的 观察以基质金属蛋白酶为靶点的肿瘤靶向性细胞穿膜肽介导小干扰RNA(siRNA)进入肝癌并对肝癌细胞SMMC-7721起一定抑制作用.方法 以体外培养的肝癌细胞SMMC-7721为研究对象,将细胞分为实验组和对照组,实验组加入siRNA质粒/穿膜肽复合物,对照组加入空质粒/穿膜肽复合物,培养48 h后收集两组细胞,流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测SiRNA质粒/穿膜肽复合物对细胞增殖的抑制作用.结果 实验组与对照组比较G1期细胞所占比例增多(实验组75.14％、对照组62.55％),G2期细胞比例减少(实验组11.39％、对照组12.14％)、S期细胞比例减少(实验组13.47％、对照组25.31％),说明经穿膜肽质粒复合物处理后细胞被阻滞在G1期,实验组细胞hTERT mRNA的表达量约为未对照组的74％,即实验组mRNA表达水平下调约26％.肝癌细胞经穿膜肽复合物处理48 h后MTT法测细胞增殖抑制率为34.82％.结论 肿瘤靶向性细胞穿膜肽可介导siRNA进入肝癌细胞并可对肝癌细胞起一定的抑制作用.     

水溶性脂聚体可运载N-甲基-D-天冬氨酸受体2B小干涉RNA治疗慢性炎性疼痛

目的 慢性炎性疼痛的基因治疗缺乏安全且高效的载体,本实验探讨了低分子量聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)和胆固醇组成的水溶性脂聚体(water-soluble lipopolymer,WSLP)运载N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(N-Methyl-D-aspartic acid receptor 2B,NR2B)小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)治疗大鼠慢性炎性疼痛的可行性. 方法 将WSLP直接与靶向NR2B的siRNA连接形成WSLP/siRNA复合物,乱序siRNA作为对照(WSLP/scRNA);然后检测鞘内注射WSLP/siRNA对完全弗氏佐剂(freund's adjuvant complete,CFA)炎性痛模型大鼠脊髓背角(spinal cord doral horn,SCDH)NR2B蛋白表达的影响,并且测定鞘内注射此复合物后炎性痛大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)及热缩足反射持续时间(thermal withdrawal duration,TWD)的变化. 结果 WSLP/siRNA注射后3d,炎性疼痛大鼠SCDH NR2B蛋白水平的表达与CFA组比较显著下降58％(P＜0.01),WSLP/scRNA及PEI/siRNA注射后NR2B的表达无明显变化(P＞0.05).WSLP/siRNA鞘内注射后3、4d及5d炎性痛大鼠的MWT [(3 d:(9.2±1.3);4 d:(9.8±1.2);5 d:(9.5±1.2)]较CFA组[(3 d:(4.6±1.2);4 d:(4.9±1.8);5 d:(5.0±1.8)]显著增高(P＜0.01),TWD[(3 d:(3.27±0.32)s;4 d:(3.83±0.49)s;5 d:(3.57±0.33)s]较CFA组[(3 d:(6.71±0.45)s;4 d:(6.97±0.54)s;5 d:(6.63±0.38)s]显著缩短(P＜0.01),WSLP/scRNA及PEI/siRNA均无此治疗作用(P＞0.05). 结论 WSLP可有效运载siRNA抑制CFA所致慢性炎性痛大鼠NR2B的过度表达,从而对炎性疼痛大鼠具有治疗作用.     

筛选有效抑制血管内皮细胞小窝蛋白-1表达的小干扰RNA及其毒性检测

目的 筛选有效抑制血管内皮细胞小窝蛋白-1(Caveolin-1)表达的小干扰RNA(small interferenceRNA,siRNA)序列,并检测转染复合物的细胞毒性. 方法 设计合成针对Caveolin-1的siRNA 3条(siRNA422,siRNA548,siRNA710)及1条带绿色荧光标记的通用阴性对照FAM-siRNA.在siRNAFect介导下转染血管内皮细胞.用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)测定转染后血管内皮细胞中Caveolin-1 mRNA的表达,Western blot方法测定干扰后Caveolin-1蛋白表达,比较抑制率,筛选出有效抑制Caveolin-1表达的siRNA.采用磺基罗丹明B法(sulforhodamineB,SRB)分析转染复合物的细胞毒性. 结果 ①在siRNAFect相同剂量下,siRNA 20、30 nmol/L组或40 nmol/L组转染效率均达到85％以上(P＜0.01);②siRNAFect 1.3μl复合10 nmol/L或20 nmol/L siRNA组细胞存活率均达到80％以上(P＜0.05);③siRNA548对EA.hy926细胞Caveolin-1基因mRNA抑制效果最明显(P＜0.01);④与阴性对照组及siRNA422、siRNA710相比较,siRNA548干扰血管内皮细胞48 h后,Caveolin-1蛋白的表达量最低(P＜0.01). 结论 ①siRNA548对血管内皮细胞Caveolin-1表达的抑制效果最大.②siRNA浓度20 nmol/L复合siRNAFect 1.3μl转染效率高,细胞毒性低,适合转染.