小鼠骨髓干细胞向肝细胞转化的体外实验研究

目的建立以30 ng/ml FGF-4和30 ng/ml OSM为主的诱导培养体系,研究体外骨髓干细胞向肝细胞的转化过程中细胞形态、结构、功能的变化.方法建立以30ng/ml FGF,30ng/mlOSM为主的小鼠骨髓干细胞诱导培养体系.观察细胞形态和数量的变化;RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色检测肝细胞特异性标记物的表达;通过PAS糖原染色、白蛋白ELISA、尿素合成试验,检测细胞的合成和代谢功能.结果诱导12 d,观察到多极性的肝细胞样细胞,且逐渐增多、集落不断增大.在诱导过程中,不同的时间点可以分别检测到HNF-3βmRNA、ALBmRNA、CK18mRNA、TTRmRNA、G6-PasemRNA和TATmRNA的表达.诱导21 d,细胞表达HNF-3β、ALB、CK18蛋白;免疫荧光定位示ALB表达于胞浆和胞膜,而CK18表达于胞浆.诱导21 d,细胞胞浆内可见红染的糖原颗粒;在诱导过程中,不同的时间点检测到细胞分泌ALB、合成尿素的量的变化.结论我们建立的以30ng/ml FGF、30 ng/ml OSM为主的诱导培养体系,可以有效地促进骨髓干细胞体外定向转化为肝细胞.     

体外诱导小鼠骨髓干细胞转化为肝细胞的实验研究

目的模拟体内肝脏发生发育的环境和条件，建立以细胞因子为主的体外诱导培养体系，探讨骨髓干细胞体外转化肝细胞的可行性。方法获取小鼠骨髓干细胞，建立以细胞因子为细胞诱导的培养体系。在细胞培养过程中，观察细胞形态和数量，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测肝细胞特异性基因的表达。Western blot和流式细胞仪检测ALB和CK18在蛋白水平的表达情况。糖元染色法行细胞糖原染色、尿素合成试验检测细胞的合成和代谢功能。结果在诱导培养12d，可以观察到多极性的肝细胞样细胞。且细胞逐渐增多、集落不断增大。诱导细胞在培养7d开始表达AFP mRNA并维持到第21天。此后表达逐渐减弱；培养7天开始表达ALB mRNA和CK18 mRNA。随着培养时间的延长表达不断增强；培养14d开始表达TTR mRNA，随着培养时间的延长表达不断增强。通过Western blot检测，诱导21d的细胞表达ALB和CK18蛋白，流式细胞术分析ALB阳性细胞的比例为60．45％，CK18阳性细胞的比例为67％。诱导培养21d，细胞胞浆内可见红染的糖原颗粒；诱导培养6d，细胞开始合成尿素，尿素合成功能随诱导时间的延长而增强，于第15天达到高峰。结论我们建立的以细胞因子FGF、HGF、OSM、EGF为主的细胞诱导培养体系能促使骨髓干细胞定向转化为肝细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨HGF和EGF对骨髓间充质干细胞向肝细胞方向的诱导分化作用，探索出合适的诱导条件，为肝细胞移植、生物人工肝、组织工程构建等提供基础。方法：骨髓来自杂种犬的髂骨，采用全血贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞CD标记；用含HGF和EGF的α—MEM培养液进行诱导培养，并于诱导后7、14、21d留取细胞；用免疫组化检测AFP、CK18，免疫荧光检测ALB，PAS反应检测糖原；流式细胞仪检测细胞分化率。结果：分离的骨髓间充质干细胞表面CD13、CD34和CD45皆为阴性，CD29为阳性。诱导至7d出现AFP表达．14d表达增高，21d时表达下降。CK18、ALB和糖原14d时出现表达，并随时间延长表达逐渐增加：21d时ALB表达阳性率可达50％以上。结论：HGF和EGF有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用。     

细胞因子诱导小鼠骨髓间充质干细胞跨越分化肝细胞的研究

目的 探索骨髓问充质干细胞(MSCs)体外跨越分化为肝细胞的诱导体系.方法 从单核细胞中分离间充质干细胞,用添加20 ng/ml HGF、10 ng/ml FGF-4、10 ng/ml OSM和10%NBS的IMDM培养液诱导间充质干细胞向肝细胞分化.结果 经细胞因子诱导的细胞出现肝细胞样变化,随诱导时间延长体积逐渐增大、形态往上皮样转变,胞浆丰富,出现双核或多核细胞.RT-PCR和免疫荧光检测结果显示,AFP在诱导初期表达,在诱导后期表达下降;CKl8、ALB和TAT的表达与诱导时间呈线性关系.第20天达到表达高峰;诱导20 d后免疫荧光检测,AFP、CKl8、ALB和TAT均为阳性;诱导20 d细胞的PAS糖原合成反应呈阳性,即具备糖原合成和储存的肝细胞特有功能.结论 HGF、FGF-4和OSM三种细胞因子组合,可诱导小鼠间充质干细胞向肝细胞分化,该结果为间充质干细胞跨越分化肝细胞的分子机制探讨和临床应用打下了基础.     

肝细胞生长因子联合成纤维细胞生长因子-4诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的实验研究

目的探讨肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）联合成纤维细胞生长因子4（fibroblast growth factor-4，FGF4）诱导人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，HMSCs）向肝细胞方向分化的能力。方法分别用HGF、FGF4、HGF＋FGF4诱导HMSCs分化为肝样细胞。在不同分化阶段用免疫细胞化学染色法检测甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）和细胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）；免疫荧光细胞化学染色法检测AFP、白蛋白（albumin，ALB）的表达；RT—PCR检测AFP和ALB mRNA表达的情况。结果HMSCs经诱导向肝样细胞转化。免疫细胞化学染色各诱导组均可检测出AFP和CK18表达，图像分析表明HGF＋FGF4联合诱导分化的AFP、CK18阳性率最高，HGF次之，FGF4则较弱；免疫荧光细胞化学染色发现各诱导组AFP、ALB均为阳性表达；各诱导组RT—PCR均可检测出AFP和ALBmRNA的表达，而阴性对照组则没有表达。结论HGF、FGF4、HGF＋FGF4均能诱导HMSCs分化为肝样细胞，分化的肝样细胞能分泌肝细胞特异性产物AFP、ALB、CK18等。以HGF＋FGF4诱导HMSCs分化为肝样细胞的阳性率最高。     

骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的诱导条件，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法分离小鼠骨髓间充质干细胞，在特定肝细胞培养液中用肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)定向诱导。在倒置显微镜下观察细胞形态。应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经HGF和EGF诱导7d后变为肝细胞样圆形；2周后免疫荧光染色可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白。结论骨髓间充质干细胞在特定条件诱导下可以向肝细胞方向分化。有可能作为肝组织工程的种子细胞来源。     

三种细胞因子组合诱导小鼠骨髓单个核细胞分化为肝细胞

目的 探索小鼠骨髓来源的单个核细胞向肝细胞分化的诱导条件。方法 通过密度梯度离心的方法获得小鼠骨髓来源的单个核细胞；在含有100g／L新生牛血清的IMDM培养液中添加细胞因子HGF20 ng／ml、FGF-4 10 ng／ml和OSM 10 ng／ml，诱导骨髓来源的单个核细胞向肝细胞分化。结果 小鼠骨髓单个核细胞在3种细胞因子的诱导下，随着时间的延长，体积逐渐增大、形态上向上皮样细胞转变，胞浆丰富，出现双核或多核细胞；半定量RT-PCR的结果显示，甲胎蛋白（AFP）和细胞角蛋白19（CK19）的表达量在诱导初期首先增加，在诱导后期逐渐减少，而白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK18）以及酪胺酸胺基转移酶（TAT）的表达与诱导时间呈线性关系；免疫荧光检测诱导3周后的细胞，AFP、CK19、CK18和ALB均为阳性表达；诱导3周的细胞PAS糖原合成反应星阳性，说明已经具备糖元合成和储存这一肝细胞的特征性功能。结论 培养液中添加3种细胞因子（HGF、FGF-4和OSM）组合可以诱导小鼠单个核细胞向肝细胞分化。     

人骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中白蛋白的表达研究

目的观察在体外诱导人骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中自蛋白的表达特征。方法从手术切除弃置的人肋骨骨髓中分离基质细胞,在含有肝细胞生长因子(HGF)、淋巴细胞抑制因子(UF)、纤维母细胞生长因子(FGF)等条件培养基中培养细胞。应用免疫荧光方法在共聚焦显微镜下观察肝细胞特异性白蛋白染色;同时,于诱导培养后多时间点测定培养细胞产生的白蛋白水平。结果人骨髓来源的基质干细胞在条件培养基中经诱导后,分化为成熟附壁细胞;细胞胞浆内肝细胞特异性标志物白蛋白呈阳性染色;已分化细胞合成并分泌白蛋白,其表达水平随细胞分化显示时间依赖性变化特征。结论人骨髓基质干细胞经诱导培养后可向成熟肝细胞分化并具有合成和分泌白蛋白功能,可以作为临床肝细胞移植及生物人工肝等治疗终末期肝病的重要肝细胞来源。     

以海藻酸三维支架构建骨髓间充质干细胞源性生物人工肝组织的实验研究

目的 以骨髓间质干细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)为种子细胞,以海藻酸三维支架为载体,研究两者的相容性及其构建生物人工肝组织的可能性.方法 将大鼠BMSC接种于海藻酸三维支架上,采用倒置相差显微镜、扫描电镜分别检测BMSC的黏附、生长与增殖情况,评价两者的相容性;同时以表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维生长因子4(FGF-4)等细胞因子混合液诱导BMSC向肝细胞分化,检测培养液内尿素氮和白蛋白含量,RT-PCR检测培养细胞ALB和AFP基因的表达,糖原染色及免疫荧光法检测细胞糖原合成功能和CK-18的表达. 结果大鼠BMSC在海藻酸三维支架上能正常地黏附、生长和增殖;于海藻酸三维支架内加入诱导液作用于BMSC后,培养液内尿素和ALB的含量逐渐上升,RT-PCR检测到培养细胞有AFP和ALB基因的表达,同时被诱导的细胞具有糖原储存的功能并表达CK-18.结论 海藻酸三维支架与大鼠BMSC具有良好的相容性;以EGF、HGF、FGF-4等细胞因子混合液为诱导因子,能在海藻酸三维支架上成功诱导BMSC向肝细胞分化;海藻酸三维支架和BMSC可望成为肝脏组织工程理想的种子细胞和细胞载体.     

人骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化的进一步研究

目的：探索骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）向肝细胞诱导的最有效方法,并对诱导后的细胞进行鉴定。方法：取健康成人的适量骨髓,采用梯度密度离心法分离BM-MSCs并行贴壁培养,扩增至第3代,取第3代细胞分3组分别进行诱导。A组：肝细胞生长因子（HGF）＋表皮生长因子（EGF）;B组：肝细胞生长因子（HGF）＋成纤维生长因子（FGF）;C组：肝细胞生长因子（HGF）＋表皮生长因子（HGF）＋成纤维生长因子（HGF）。分别进行培养,诱导前通过流式细胞仪分析细胞表面标志CD44、CD90的表达率对培养的BM-MSCs进行鉴定,诱导后通过RT-PCR、免疫组织化学法、糖原染色检测鉴定其诱导分化情况。结果：本文通过建立从人骨髓中分离、培养、扩增、传代、纯化BM-MSCs,定向诱导分化,使其成功向肝样细胞转化,图像分析表明C组鼠抗人白蛋白单克隆抗体（ALB）表达最为明显。结论：证明3种组合均可成功将骨髓间充质干细胞向肝样细胞诱导分化,均能分泌肝细胞特异性标记如鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体（AFP）、ALB、糖原,其中C组效果最为突出。     

Propagation of adult rat bone marrow-derived hepatocyte-like cells by serial passages in vitro

Previously, we found that hepatocyte growth factor receptor (c-Met)-and alpha-fetoprotein (AFP)-expressing cells were present in adult rat bone marrow, and that these cells also expressed hematopoietic stem cell markers, such as CD34, Thy-1, and c-Kit. When bone marrow cells were cultured in a hepatocyte growth medium (HGM) with HGF and EGF, colonies composed of polygonal cells resembling mature hepatocytes appeared by 2 weeks and grew very slowly because of overgrowth of stromal cells. At days 34-41, 2-mm2 sheets of hepatocyte-like cells were cut out of their colonies by scratching with an injection needle under observation with a phase contrast microscope, transferred into wells of 24-well plates, and cultured in the HGM medium in the presence or absence of HGF and EGF. When cells reached confluence, cells were detached with trypsin and EDTA and transferred step by step into bigger culture vessels. Thus, hepatocyte-like cells were expanded 1000-fold during less than 4 months. These cells were immunocytochemically stained for albumin and also for AFP and the hematopoietic stem cell markers described above, showing characteristics of oval cells. By RT-PCR, we detected mRNAs of tryptophan-2,3-dioxygenase and tyrosine aminotransferase, markers of hepatocytes at a terminal differentiation stage. The present culture system may be useful for supply of hepatocyte resources for cell transplantation therapy.     

体内外人脂肪间充质干细胞向肝样细胞分化的实验研究

目的 分离、培养人脂肪间充质干细胞(hADSCs),研究其在体内外向类肝样细胞转化的能力.方法 采用Ⅰ型胶原酶消化皮下脂肪,贴壁分选去除造血细胞的方法获得较纯的干细胞.通过对形态观察、表面分子鉴定、透射电镜内部结构扫描以及成脂、成骨定向诱导对脂肪间充质干细胞进行鉴定.用EGF、FGF、OSM、HGF、TSA细胞因子体外诱导hADSCs向肝样细胞分化.尾静脉输注hADSCs至急性肝损伤裸鼠,观察hADSCs在裸鼠肝脏内定植、向肝样细胞分化情况,以及hADSCs对裸鼠肝损伤的保护作用.结果 分离获得的细胞呈长梭形贴壁生长,低表达CD34、CD45,高表达CD73、CD90、CD105,具有多向分化潜能.诱导细胞表现出肝样细胞形态,表达AFP、alb,并且和肝细胞一样具有吸脂性.体内诱导:移植细胞在裸鼠体内生存、分布,并且细胞表达人alb,细胞体积较裸鼠肝脏细胞大,形态不均一,与人肝脏细胞形态有差异.同时研究发现hADSCs可改善急性肝损伤裸鼠肝功能,降低转氨酶.结论 人脂肪间充质干细胞可在体内外向肝样细胞分化,分化的细胞具有肝细胞样生物学性状.hADSCs对裸鼠急性肝损伤具有一定的治疗作用.

Abstract：

Objective To isolate and culture human adipose derived mesenchynal stem cells (hADSCs) and study the potential of hADSCs to differentiate into hepatocyte-like cells. Methods To ensure the removal of contaminating hematopoietic cells, hADSCs were selected based on plastic adherence. Cell surface antigen was confirmed by flow cytometry; ultramicrostructure was detected by transmission electron microscopy; adipogenic and osteogenic differentiation of hADSCs was analyzed by oil Red O staining and yon Kossa staining. hADSCs were exposed to differentiation medium containing EGF,FGF,OSM, HGF,TSA in vitro. 10% CCl4 (100 μ1/20 g body weight )was injected into immune-deficient BALB/c-nu mice and hADSCs (5 × 105 cells) were simultaneously administrated from the tail vein. Blood samples were collected and concentration of aminotransferase and direct bilirubin were detected. Administration without hADSCs was used as a control. One month later, we sacrificed the mice and liver sections were examined by histochemical immunofluorescence with human ALB specific antibodies. Results hADSCs exhibited fibroblast-like morphology, and expressed CD73, CD90,CD105, and were lacking of CD34 and CD45. Adipogenic and osteogenic differentiation showed that hADSCs have the capacity of multidifferentiation. The differentiated cells showed hepatocyte-like cell morphologies and hepatocyte-specific markers including albumin (alb) and α-fetoprotein (AFP). The bioactivity assays revealed that these hepatocyte-like cells could uptake low-density lipoprotein (LDL).Histochemical immunofluorescence showed that hADSCs were incorporated into injured livers. Some human alb-positive cells were found in liver sections after implantation of undifferentiated hADSCs. Transaminase activity in the experimental group was lower than in the control group. Conclution hADSCs can differentiated into functional hepatocyte-like cells and can relieve CCl4 induced BALB/c-nu acute liver injury.     

菲立磁标记大鼠骨髓基质干细胞对其生物活性的影响

目的 观察菲立磁(Feridex)标记对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)的增殖及向肝细胞分化能力的影响,探讨Feridex标记大鼠BMSCs的最佳标记方案.方法 SD大鼠BMSCs按Fefi-dex浓度11.2、14.0、16.8、19.6mg/L分组并进行标记,设空白对照组(无Feridex标记的BMSCs).采用普鲁士兰染色和透射电镜鉴定Feridex标记后各组BMSCs的标记效率.噻唑蓝(MTY)比色法检测Feridex标记后各组BMSCs的增殖水平.逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测Feridex标记后各组BMSCs经肝细胞生长因子(HGF)、表皮细胞生长因子(EGF)共同诱导后ALB和AFP基因的表达水平.结果 11.2、14.0、16.8、19.6 mg/L组的标记率分别为71%、83%、91%、96%.16.8 ms/L和19.6 mg/L组的标记率显著高于11.2 ms/L和14 mg/L组(P<0.05).11.2、14.0、16.8 mg/L组的细胞增殖水平及诱导后ALB、AFP基因表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),而19.6 mg/L组的细胞增殖水平及诱导后ALB、AFP基因表达水平显著低于空白对照组(P<0.05).结论 Fefidex浓度16.8mg/L可能是Feridex标记BMSCs最适标记浓度,该浓度既能使Fefidex对BMSCs的标记达到较理想效果,同时不影响BMSCs的增殖及向肝细胞分化的能力.     

Hepatocyte differentiation from embryonic stem cells and umbilical cord blood cells

With the development of regeneration medicine, many researchers have attempted hepatic differentiation from nonhepatic-origin cell sources. The differentiation of embryonic stem (ES) cells into hepatocyte-like cells has been reported in several papers. Mouse ES cells have shown a potential to develop into hepatocyte-like cells in vitro on the basis of hepatic gene expression after adding several growth factors. We transplanted cultured embryoid body (EB) cells (male) into female mice. A liver specimen of the recipient was examined by immunohistochemical staining for albumin and fluorescence in situ hybridization for the Y chromosome after transplantation. Both Y chromosome- and albumin-positive cells were recognized in the recipient female liver, and were considered to be hepatocyte-like cells derived from ES cells containing the Y chromosome. Many groups, including ourselves, have studied hepatocyte-like cell differentiation from umbilical cord blood cells (UBCs). We cultured nucleated cells isolated from UBCs. Using immunostaining, ALB-positive and CK-19-positive cells were recognized in the culture. Dual staining of ALB and CK-19 demonstrated that ALB was coexpresed with CK-19, suggesting the existence of hepatic progenitors. In this review, we consider recent studies of the differentiation of hepatocytes from nonhepatic origins, especially ES cells and umbilical cord blood.     

脐血CD34+细胞体外诱导肝样细胞的研究

目的 探讨通过细胞因子及其组合体外诱导脐血CD34^＋细胞转分化成肝样细胞的效果。方法 采用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞（mononuclear cell，MNC），从MNC中获得富集CD34^＋细胞。选用人白血病抑制因子、制瘤素M、bFGF、aFGF、肝细胞生长因子、EGF及干细胞生长因子7种细胞因子，浓度分别为10、10、10、10、20、20和50ng／mL，设计了49种细胞因子组合，分别采用这些细胞因子组合体外培养脐血CD34^＋细胞，培养周期为28d。以新鲜脐血CD34^＋细胞作为对照。每7天检测诱导后细胞中细胞角蛋白19（cytokemtin19，CK-19）、CK-18、谷氨酰胺合成酶（glutamme synthetase，GS）、人血清白蛋白（albumin，ALB）以及甲胎蛋白（a-fetoprotem，AFP）的mRNA转录情况，并应用免疫荧光法、过碘酸-雪夫（periodic acid-schiff，PAS）染色与吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）染色法检测细胞分泌ALB、合成糖原以及解毒能力，以此判断是否存在脐血CD34^＋细胞体外向肝样细胞的转分化。结果 在经细胞因子诱导后的CD34^＋细胞中均可检测到人肝细胞所能表达的CK-19、CK-18和GS的mRNA条带，未能检测出肝细胞特征性的ALB与AFP的mRNA条带；而新鲜脐血CD34^＋细胞中以上5种蛋白的mRNA均未能检出。免疫荧光染色观察示诱导前后的细胞中均未能检测到ALB的表达，且均不能有效吞噬ICG染料。PAS反应检测结果显示，经细胞因子诱导后的细胞紫红色糖原沉积区域较新鲜脐血CD34^＋细胞增大，出现紫红色区域的细胞增多。结论 脐血CD34^＋细胞体外经细胞因子组合诱导后，虽有肝细胞相关蛋白mRNA表达，但未能转分化为肝样细胞。