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相似文献
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1.
目的 以人毛囊隆突细胞为种子细胞体外构建组织工程复合皮,在体观察其功能性修复全层皮肤缺损的可行性。方法 胶原酶消化法体外分离培养人毛囊隆突细胞和毛乳头细胞,实验分为A、B两组。A组将毛囊隆突细胞与毛乳头细胞按1:2混合,接种于胶原包被的聚羟基乙酸纤维支架中;B组单纯接种相同数量的毛乳头细胞。而后覆盖角质形成细胞膜片,构成组织工程复合皮,移植于裸鼠全层皮肤缺损创面。观察创面愈合情况,分别于术后2、4、6周在光学显微镜下观察移植物组织学变化。结果 组织工程复合皮能够有效修复A、B两组裸鼠全层皮肤缺损。术后2周,A、B组创面均可见完整的表皮及真皮结构。术后4-6周,A组复合皮表皮层明显增厚并形成基膜的钉突,可见毛囊样结构;B组仅表皮层有所增厚但基膜平整,未见钉突和毛囊结构形成。结论 以聚羟基乙酸真皮基质为支架,用角质形成细胞、毛囊隆突细胞和毛乳头细胞共同构建的组织工程复合皮,可以有效修复裸鼠全层皮肤缺损。其中毛囊隆突细胞参与了创面解剖修复,同时可能引导组织结构和功能的修复。  相似文献   

2.
目的 采用免疫组织化学方法研究不同时期胚胎皮肤中的干细胞,分析皮肤干细胞的形态、分布特点及发育过程中在胎儿皮肤中的迁徙、增殖分化特征,探讨皮肤干细胞与皮肤发生发育的关系。方法 不同发育时期胎儿皮肤,取材、固定、制成石蜡切片,SP法检测整合素-β1、角蛋白19(K19)、K14、K10和PCNA的表达。结果 胚胎发育期可见整合素-β1阳性的细胞在基底层散在分布。随胎龄增加,整合素-β1表达减弱,表达范围减小。同时,胚胎发育的不同阶段K19均在表皮基底层强烈表达。表皮分层期后,K14阳性细胞从基底层向上延伸至亚基底层。而K10作为表皮终末分化细胞的标志,主要分布在表皮的中层和外层。此外,在毛囊发育过程中,胎皮表皮嵴的细胞相互聚集成团,形成毛囊初级原基,表达整合素-β1、K19、K14及PCNA为阳性。随着毛囊的形成、成熟,皮肤干细胞主要聚集在与表皮相延续的外根鞘、毛囊隆突部及毛母质,表达整合素-β1、K19、K14和PCNA为阳性。结论 (1)皮肤的发生、发育与角蛋白的程序性改变密切相关;(2)毛囊的发生、发育受到毛乳头的诱导作用。毛囊成熟期后,皮肤干细胞主要迁移至与表皮相延续的外根鞘、毛囊隆突部及毛母质等处。此外,还发现毛乳头及其周围组织内分布着单核样细胞表达整合素-β1、K19和K14为阳性。  相似文献   

3.
人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定   总被引:2,自引:1,他引:1  
李丹  李世荣  曹川 《中国美容医学》2007,16(10):1343-1346
目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法。方法:中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性粘附、分离和角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,检测细胞克隆形成率,免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达;以角质形成细胞作为对照。结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞组;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达。结论:运用Ⅳ型胶原粘附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养。  相似文献   

4.
人胎儿表皮干细胞的体外分离培养及基因转染   总被引:15,自引:5,他引:10  
目的:探讨人胎儿表皮干细胞体外分离培养的方法以及作为体外基因转染靶细胞的可行性。方法:利用Ⅳ型胶原快速贴附法分离人胎儿表皮干细胞,以人胎儿成纤维细胞条件培养液配制表皮干细胞培养基,通过角蛋白19(K19)和整合素β1免疫组化染色、细胞周期分析及克隆形成率测定,对培养细胞进行鉴定。采用脂质体介导法,以含血管内皮细胞生长因子165(VEFG165)基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(pcDNA3.1/VEGF165)转染培养细胞;采用病毒载体介导法,以含报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺相关病毒载体(raav/GFP)转染培养细胞。应用免疫组化染色及荧光显微镜观察检测转染效果。结果:人胎儿表皮干细胞呈明显克隆性生长、克隆形成率高,G1期细胞比例明显高于普通基底层角质细胞,K19和整合素β1免疫组化染色呈强阳性。pcDNA3.1/VEGF165转染的表皮干细胞VEGF165免疫组化染色阳性,raav/GFP转染的表皮干细胞呈现强荧光。结论:利用Ⅳ型胶原快速贴附法及人胎儿成纤维细胞条件培养基,可初步实现人胎儿表皮干细胞的分离培养。以质体为介导或以腺相关病毒为载体进行人胎儿表皮干细胞的体外基因转染是可行的。  相似文献   

5.
目的探讨绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的C57小鼠皮肤表皮和真皮细胞共移植诱导裸鼠毛囊重建的实验研究。方法取C57-GFP新生及成年小鼠分离表皮与真皮,分别制备成年小鼠原代真皮-表皮混合细胞(按1∶1比例混合)、成年小鼠原代真皮细胞、新生小鼠第3代真皮细胞,荧光显微镜观察细胞激发绿色荧光情况,免疫细胞化学检测培养的新生小鼠第3代真皮细胞毛囊干细胞标志。取Balb/c裸鼠,分别将成年小鼠原代真皮-表皮混合细胞(A组)、成年小鼠原代真皮细胞(B组)、新生小鼠第3代真皮细胞(C组)及生理盐水(D组)移植至裸鼠皮下,术后4、5、6周行大体观察,6周时取移植部位皮肤行GFP免疫组织化学染色观察各组毛囊形成情况。结果荧光显微镜观察示,分离、培养的C57-GFP新生及成年小鼠表皮及真皮细胞均能激发绿色荧光;免疫细胞化学检测培养的第3代真皮细胞中毛囊干细胞标志,显示波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白强阳性,表明细胞多为真皮鞘细胞;部分细胞表达毛乳头细胞标志CD133、多能聚糖及毛囊隆突部标志角蛋白15。裸鼠皮下移植实验:大体观察示A组可见接种部位皮下呈灰黑色,但未见毛发穿出皮肤表面;B、C、D组裸鼠皮肤均无着色。免疫组织化学染色示,A组形成新的、完整的毛囊结构或参与形成毛囊;B组GFP阳性细胞多表达于毛囊真皮鞘、外根鞘;C组GFP阳性细胞主要分布于毛囊真皮鞘、外根鞘、毛乳头,在汗腺中也有表达;D组GFP染色呈阴性。结论小鼠皮肤的表皮和真皮细胞在裸鼠体内相互作用可形成完整的毛囊结构,而仅移植新鲜分离或培养的真皮细胞则主要参与毛囊形成,无法形成完整的毛囊结构。  相似文献   

6.
目的观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)促进大鼠深Ⅱ°烫伤创面再上皮化作用及对表皮干细胞增殖和迁移的影响。方法66只Wistar大鼠随机分为A组(正常对照组,n=6)、B组(单纯烫伤组,n=30)、C组(bFGF治疗组,n=50)。利用大鼠5%深Ⅱ°烫伤模型,于伤后1、3、7、14和21d采取创面边缘皮肤标本,免疫组织化学染色技术检测创面边缘上皮及深层皮肤附件上皮整合素-β1(integrin-β1)、角蛋白19(K19)和PCNA以及上皮钙依赖性黏附素(E—cadherin)的表达情况。结果正常皮肤中,整合素-β1、角蛋白19、PCNA和E-cadherin表达主要集中在Wistar大鼠表皮层的基底部及毛囊球部。皮肤烫伤初期,以上指标变化不显著。7—14d时,整合素-β1和角蛋白19同时阳性表达的细胞有所增强,PCNA和E—cadherin的表达增强。当局部外用bFGF后,创伤初期(1—3d)组织中的表达差异无统计学意义(P〉0.05),7—14d,阳性表达角质形成细胞出现在创缘的棘层与颗粒层,毛囊根部的阳性标记细胞强于对照组。结论bFGF促进深Ⅱ°烫伤大鼠创面愈合与加速启动创缘表皮基底层的表皮干细胞以及皮肤附件上皮的迁移有关。  相似文献   

7.
目的:通过观察不同阶段表皮干细胞表面感觉神经肽SP的受体NK1的表达特征与鼠毛囊发育间的相关性,研究表皮干细胞分化发育为毛囊时感觉神经肽的作用,为研究通过神经调控诱导表皮干细胞向毛囊分化奠定基础.方法:实验取胎龄12.5~13.5d胎鼠、1~2d新生鼠、成鼠三组皮肤标本,以β1整合素及K19双标阳性表达定位表皮干细胞,免疫组化方法定性、半定量分析NK1受体表达.结果:不同发育阶段鼠表皮干细胞表面均有NK1受体表达,其阳性表达率与ESC双标阳性表达率无明显差异;胎鼠及新生鼠NK1受体表达率同成鼠之间存在明显差异,提示鼠毛囊发生期前ESC的NK1受体表达明显高于毛囊静止期.结论:感觉神经肽在由ESC分化发育为毛囊过程中具有重要启动及调控作用.  相似文献   

8.
烫伤大鼠不同深度创面组织中表皮干细胞分布的初步研究   总被引:14,自引:1,他引:13  
目的初步观察烫伤大鼠不同深度创面组织中表皮干细胞的分布情况。方法将32只SD大鼠分别造成Ⅰ、浅Ⅱ、深Ⅱ和Ⅲ度烫伤,伤后24h取创面组织标本,制作切片。采用细菌蛋白一生物素标记法(LSAB)进行免疫组织化学染色,以α2、β1整合素及角蛋白10(K10)作为一抗,观察不同创面组织中表皮干细胞的表达和分布情况。结果Ⅰ度烧伤创面组织中,K10阳性细胞分布于表皮的棘细胞层、颗粒层、透明层,α2、β1整合素阳性细胞分布于表皮基底层,数量多。浅Ⅱ度创面中,α2、β1整合素阳性细胞位于残留的基底层和皮肤附属器(主要是毛囊)中,数量较少。深Ⅱ度创面中,α2、β1整合素阳性细胞仅存在于真皮深层健存的皮肤附属器中,数量很少。Ⅲ度创面中,罕见α2、β1整合素阳性细胞。结论表皮干细胞在烧伤创面中的分布与烧伤深度有关,残存的表皮干细胞可能是创伤修复过程中再上皮化的细胞来源。  相似文献   

9.
目的开发新的组织工程表皮替代物,利用毛囊干细胞-壳聚糖明胶膜片(Chitosan-gelatin membrane,CGM)进行修复裸鼠皮肤缺损的实验研究。方法将体外扩增培养的毛囊干细胞接种于CGM,构建组织工程表皮膜片,裸鼠背部作直径1cm的全层皮肤缺损,将毛囊干细胞-CGM复合物覆盖创面。回植后1周、4周和12周分别进行组织学和免疫组织化学检测。结果毛囊干细胞在CGM上生长良好。毛囊干细胞-CGM修复裸鼠后1周切片示创面有新生上皮覆盖,表皮分化良好,而对照组残留较大未愈创面。修复后4周和12周可见对照组收缩较实验组显著。结论体外构建的毛囊干细胞-CGM可以修复裸鼠皮肤缺损。  相似文献   

10.
毛囊作为一个重要的成体干细胞贮存区域,其富含的干细胞可分化形成毛囊及上皮的多种细胞,对维持毛发的周期性生长有重要作用。其中毛囊黑素干细胞起源于神经嵴,并迁移通过真皮和表皮最终停留在毛囊,目前研究已经表明它的生理功能包括两方面,一方面向上移行进入表皮形成表皮黑素单元;另一方面,在毛囊生长期,毛囊黑素干细胞周期性向下进入毛母质形成毛囊黑素单元。毛囊黑素干细胞在形成毛囊黑素单元过程中,主要受比邻的毛囊干细胞、角质形成细胞、毛乳头细胞、周边的基底膜成分及内在的转录因子等调控,这些细胞和基质蛋白通过不同的通路调节了毛囊黑素干细胞的分化和移行。  相似文献   

11.
P物质在表皮干细胞向毛囊迁移分化中的作用   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的 了解P物质(SP)在表皮干细胞(ESC)向毛囊迁移分化中的作用并探讨其机制。方法 将体外培养的ESC以角蛋白19(K19)及β1整合素免疫染色法确认其为所需的ESC。采用5-溴-2-尿嘧啶脱氧核苷(BrdU)标记ESC,将SP加入已标记的ESC培养液中,根据所加SP的浓度分为10^-5 mol/LSP组、10^-6mol/L SP组、10^-7mol/L SP组。并将加入SP的各组ESC悬液0.3ml注射到裸鼠背部真皮内,于首次注射后4、7、10、14d分别再注射1次,剂量、部位同前。对照组除不使用SP外,其余处理相同。各组于首次注射后28d在无菌条件下取注射区皮肤及远离注射区的正常皮肤组织,行免疫组织化学染色,电子显微镜下观察裸鼠皮肤组织学特点,行皮肤毛囊计数。结果 注射后,10^-5 mol/L SP组可见散在的毛囊,部分毛囊发育不全。10^-6mol/L SP组、10^-7mol/L SP组真皮深层及皮下组织中,可见大量的组织结构清晰的毛囊,部分毛囊的毛根部位可见棕黄色BrdU阳性颗粒,多数毛囊的外毛根鞘部位可见棕黄色β连环蛋白阳性颗粒以及极少量发育不全的毛囊,毛囊计数[(1.9±1.2)、(1.3±0.8)个]均少于对照组[(10.5±1.2)个,P〈0.01]。对照组真皮深层和皮下组织的毛囊发育不全,表皮层中可见棕黄色BrdU阳性颗粒和β连环蛋白阳性颗粒。结论 SP可诱导基底层的ESC向毛囊迁移,其诱导效应与SP浓度有关,并促使ESC内β连环蛋白的表达增高,诱导其向毛囊分化。  相似文献   

12.
目的 研究小鼠皮肤毛囊细胞注射移植的再生机制及影响因素.方法 取3~5dC57BL/6J近交系小鼠背部皮肤,Dispase酶消化后剥离表皮,将真皮剪成小块置胶原酶中,过滤、低速离心、密度梯度离心后收集毛囊并制备单细胞悬液,经Dio标记后以不同的浓度和细胞组合进行皮内和皮下注射移植,并于移植后2、4d,以及1、3、6周观察其变化.结果 小鼠毛囊细胞皮内注射移植后4d,注射部位轻微隆起,外表呈灰色,镜下可见大量再生的毛囊,毛球部呈黑色,无明显毛干.移植后1周,注射点均可见明显隆起,外表呈现黑色,镜下可见大量毛囊伴有明显的黑色毛干,局部见密集分布的血管,管径增粗.移植后3周小鼠皮内注射部位形成一个含有灰白色内容物的囊肿,镜下可见密集的黑色毛发,冷冻切片荧光检测见明亮绿色荧光.移植后6周,见囊内充满大量毛干,镜下可见大量脱落的杵状毛干及处于生长期的毛囊.而毛囊细胞皮下注射移植3周后,皮下仅散乱分布大小不等的灰白色囊肿,新生毛囊数量少,方向杂乱.毛囊细胞经过培养或移植数目低于1×105个时无新生毛囊形成.结论 毛囊细胞注射移植后能自发聚集,协同发育成新的毛囊.新生毛囊具有正常的生长周期.毛囊重建的效果不仅取决于所移植的细胞类型,同时还受到移植部位和细胞数量的影响.  相似文献   

13.
Hair follicle cells contribute to wound healing, skin circulation, and skin diseases including skin cancer, and hair transplantation is a useful technique to study the participation of hair follicle cells in skin homeostasis and wound healing. Although hair follicle transplantation is a well‐established human hair‐restoration procedure, follicular transplantation techniques in animals have a number of shortcomings and have not been well described or optimized. To facilitate the study of follicular stem and progenitor cells and their interaction with surrounding skin, we have established a new murine transplantation model, similar to follicular unit transplantation in humans. Vibrissae from GFP transgenic mice were harvested, flip‐side microdissected, and implanted individually into needle hole incisions in the back skin of immune‐deficient nude mice. Grafts were evaluated histologically and the growth of transplanted vibrissae was observed. Transplanted follicles cycled spontaneously and newly formed hair shafts emerged from the skin after 2 weeks. Ninety percent of grafted vibrissae produced a hair shaft at 6 weeks. After pluck‐induced follicle cycling, growth rates were equivalent to ungrafted vibrissae. Transplanted vibrissae with GFP‐positive cells were easily identified in histological sections. We established a follicular vibrissa transplantation method that recapitulates human follicular unit transplantation. This method has several advantages over current protocols for animal hair transplantation. The method requires no suturing and minimizes the damage to donor follicles and recipient skin. Vibrissae are easier to microdissect and transplant than pelage follicles and, once transplanted, are readily distinguished from host pelage hair. This facilitates measurement of hair growth. Flip‐side hair follicle microdissection precisely separates donor follicular tissue from interfollicular tissue and donor cells remain confined to hair follicles. This makes it possible to differentiate migration of hair follicle cells from interfollicular epidermis in lineage tracing wound experiments using genetically labeled donor follicles.  相似文献   

14.
This study is to constitute a composite skin substitute with epidermal stem cells (ESCs) and fibroblasts on collagen sponge. ESCs were selected by rapid attachment to collagen IV for 10 min. Collagen was extracted from rat's tail. The matrix lattice was fabricated by freeze-dryer and cross-linked with glutaraldehyde. Fibroblasts were inoculated on collagen sponge and cultured for 1 week prior to inoculation of ESCs. Having cultured for 2 weeks in submerged culture, the bioengineered tissue was raised to the air-liquid interface and cultured for 2 weeks. The artificial skin was then grafted onto full skin loss wounds of nude mice. Collagen sponge membrane lacking cell inoculation and an artificial skin with epidermal cells (ECs) and fibroblasts were used as controls. The wounds were observed daily. Tissue samples were harvested and examined by means of histology, immunohistochemistry and electron microscopy. The wounds in the test group healed at a significantly faster rate than controls, with good skin appearance and minimal scar formation. The control group showed delayed wound healing and intensive wound contraction as compared to the test group. Thus the skin substitute with ESCs seemed to be a good equivalent.  相似文献   

15.
微囊化人头皮毛乳头细胞移植诱导毛发形成   总被引:5,自引:0,他引:5  
目的探索微囊化人头皮毛乳头细胞(以下简称毛乳头细胞)对裸鼠背部皮肤毛囊形成的诱导作用。方法胶原酶消化法体外分离、培养毛乳头细胞,再将毛乳头细胞以海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine—alginate,APA)微囊包裹,以胶原凝胶作为载体,植入裸鼠背部皮下;移植空囊、游离毛乳头细胞各作为对照。观察移植部位毛发生长情况,利用组织学方法观测所形成的毛囊结构。结果微囊化毛乳头细胞皮下移植4周后,裸鼠背部移植区有白色、浓密、分布均匀的毛发长出。局部组织切片见大量发育完整的毛囊结构;而空囊及游离毛乳头细胞移植均未能诱导出上述现象。结论聚集性生长的微囊化毛乳头细胞能够保持诱导皮肤毛囊形成的作用,且这种作用无种属特异性。  相似文献   

16.
BACKGROUND: Stem cells in healthy epidermis have the capacity to produce structures, such as interfollicular epidermis, hair follicle, and sebaceous glands. Embryonic stem (ES) cells can be induced to differentiate into epidermal stem cells in vitro. These ESCs (epidermal or epidermoid stem cells derived from ES cells) have the potential to be an ideal replacement of those stem cells destroyed in severe injury, such as in deep and extensive burn. The aim of this study was to follow the fate of murine ESCs which were seeded in a syngeneic dermal equivalent and implanted into syngeneic recipient mice subcutaneously. METHODS: ES cells were induced in vitro to differentiate into ESCs. Stained with a fluorescent dye Hoechst 33342, these ESCs were seeded into a fibroblast-collagen-gelatin sponge complex, functioning as a dermal equivalent model, and then implanted subcutaneously into 129/J mice, which were syngeneic to these stem cells. RESULTS: These ESCs were clearly visible in the implant by fluorescent microscopy 3 weeks or longer after implantation. These cells remained viable, differentiating into hair follicle-like structures, glandular structures, and gave rise to additional structures resembling native dermis. A number of markers were expressed in the differentiated structures, including CD29 (integrin beta1 subunit) and cytokeratin 18 (CK18). No apparent rejection or severe side effects were observed at least during the 10 weeks following implantation. CONCLUSIONS: Now that ESCs can survive in vivo in this dermal equivalent model and differentiate into hair follicle-like structures as well as glandular structures, it is feasible to use these cells as seed cells in studies to fabricate dermal equivalents that have the potential to develop dermal appendages.  相似文献   

17.
目的探讨简单快捷地获得大量人毛囊隆突细胞并保持其干细胞特性的方法,观察其向皮脂腺细胞分化的可行性。方法用传统的器械分离法(简称传统法)和改进的消化分离法(简称改良法)对人胎儿毛囊隆突细胞进行分离培养,比较两种方法的细胞获得效率和细胞生长特性。在对毛囊隆突细胞进行诱导培养后,行抗上皮膜抗原(EMA)抗体免疫组织化学染色,以检测细胞EMA的表达情况。噻唑蓝(MTT)法检测细胞克隆形成率。用亲和素-生物索复合物(ABC)标记法行毛囊隆突细胞角蛋白19(K19)染色。结果传统法每小时可获得8~10个毛囊隆突,贴壁48h后有细胞长出,贴壁率为40%~50%,培养14d左右传代;改良法每小时可获得毛囊隆突100个左右,接种后12h即可贴壁并有细胞长出,贴壁率30%,细胞生长迅速,7d左右即可传代。毛囊隆突细胞诱导培养7d后,细胞体积变大,随着时间延长,细胞进一步变大,细胞质中有脂滴样颗粒围绕在核的周围,细胞形状不规则。诱导培养14d后,抗EMA抗体免疫组织化学染色呈阳性表达。改良法的细胞克隆形成率为(18.2±2.1)%,明显高于传统法[(12.7±3.4)%,P<0.05]。毛囊隆突细胞K19免疫组织化学染色呈阳性,其细胞分布满视野,细胞质内含有大量棕色颗粒。结论改良法可以获得大量毛囊隆突细胞并保持其干细胞特性,在体外诱导条件下,具有向皮脂腺细胞分化的潜能。  相似文献   

18.
毛乳头细胞诱导毛囊形成的研究   总被引:11,自引:0,他引:11  
目的 探讨培养的毛乳头细胞在体内外条件下诱导毛囊形成的可能性。方法 采用酶消化法获得毛乳头细胞、真皮鞘细胞、毛囊上、下段及球部细胞,进行毛囊组织工程重建,或用游离细胞混合移植于棵鼠,组织学观察毛囊形成情况。结果 毛囊间表皮细胞、毛囊上段上皮细胞、下段上皮细胞和球部细胞在间质细胞凝胶上均可形成双层结构的组织工程皮肤,在真皮鞘细胞胶原凝胶上毛囊的上、下段上皮细胞形成了毛囊结构,移植于棵鼠后8周毛乳头细胞胶原凝胶诱导毛囊上、下段细胞形成了毛囊。低代毛乳头细胞与毛囊上皮细胞混合移植形成了数量较多、结构典型的毛囊,并有肉眼可见的毛发纤维产生。结论 毛囊的真皮成分细胞即毛乳头细胞、真皮鞘细胞在体内、外均具有诱导毛囊形成的能力,通过与毛囊上皮细胞之间的相互作用,可诱导毛囊形成。  相似文献   

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