两种GTF氨基催化区改良防龋质粒免疫小鼠的实验研究

目的：通过比较编码表兄链球菌葡糖基转移酶氨基催化区CAT不同形式基因序列的两种改良防龋质粒免疫BALB/c小鼠后激发的特异性抗体水平差异,初步评价不同形式CAT在DNA防龋疫苗中的应用潜力。方法：利用分子克隆技术构建两种改良防龋质粒,在靶向防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX中插入表兄链球菌OMZ176GTF-I CAT全基因序列构建pGJGAC/VAX;将基因公司合成的共计165bp的串联重复5次的GTF-I氨基催化区核心保守序列克隆到pGJA-P/VAX中构建pGJGA-5C/VAX。转染CHO细胞系,检测其表达。两种改良质粒经鼻腔滴注免疫BALB/c小鼠,检测血清和唾液中的特异性抗PAc,抗GLU和抗CAT抗体水平。结果：重组质粒的基因序列与预期相符。不同形式CAT基因序列的两种改良防龋质粒均可在真核细胞正确表达。pGJGAC/VAX和pGJGA-5C/VAX免疫动物后血清和唾液特异性抗PAc、抗GLU和抗CAT抗体均显著高于空载体pVAX1免疫组（P〈0.05）。第10、12和14周,pGJGAC/VAX免疫组小鼠的血清特异性抗CAT抗体显著高于pGJGA-5C/VAX组（P〈0.05）。两组间唾液特异性抗体未见显著性差异。pGJGA-5C/VAX在小鼠体内激发特异性抗体的速度较pGJGAC/VAX略快。结论：本实验构建的增加表兄链球菌GTF氨基催化区的两种改良防龋质粒,可在真核细胞中正确表达,两种质粒有效地诱导黏膜和系统体液免疫反应,pGJGAC/VAX和pGJGA-5C/VAX各有优势。     

DNA防龋疫苗联合蛋白质疫苗诱导小鼠免疫应答的研究

目的:研究以一种新型免疫策略即追加相应蛋白质抗原来加强免疫DNA疫苗的免疫效果。方法:重组质粒pCIA-P经鼻腔滴注途径免疫小鼠,并以其相应抗原rPAc蛋白或rPAc蛋白及黏膜佐剂rCTB经鼻腔滴注加强免疫,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平。结果:以rPAc蛋白或rPAc蛋白及黏膜佐剂rCTB加强免疫可显著提高唾液中IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体水平。并且以rPAc蛋白和黏膜佐剂rCTB加强免疫组产生了最高水平的唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体。结论:DNA防龋疫苗联合蛋白质疫苗可有效增强DNA防龋疫苗免疫效果。     

防龋基因疫苗pcDNA3-PAc不同途径免疫BALB/c小鼠的实验研究

目的:观察防龋基因疫苗pcDNA3- PAc经不同途径免疫BALB/c小鼠后的免疫效果.方法: 重组质粒pcDNA3- PAc经颌下腺区皮下注射、股四头肌注射和鼻腔黏膜滴注免疫BALB/c小鼠,共免疫2 次,每次间隔2 周.分别于首次免疫前1 d和免疫后第1、2、4 周采集血液和唾液样品,采用酶联免疫吸附方法检测血清特异性IgG抗体和唾液特异性IgA抗体.结果: 各实验组免疫后1 周血清和唾液中特异性抗体水平开始升高,第4 周时达最高水平.颌下腺区皮下注射免疫产生的唾液IgA和股四头肌注射免疫诱导的血清IgG抗体水平明显高于其它实验组(P<0.05).颌下腺区皮下注射免疫和鼻腔黏膜滴注免疫可诱导较高水平的唾液IgA和一定水平的血清IgG;股四头肌注射免疫诱导的血清特异性IgG抗体水平较高(P<0.05),而唾液IgA抗体水平不如颌下腺区皮下注射免疫和鼻腔黏膜滴注免疫(P<0.05).结论: 防龋基因疫苗pcDNA3- PAc能够诱导动物机体产生有效的系统免疫应答和黏膜免疫应答.     

阳离子脂质体乳剂增强防龋疫苗黏膜免疫效果的研究

目的：观察阳离子脂质体增强防龋疫苗诱导的小鼠特异性IgG和唾液IgA抗体水平。方法：以阳离子脂质体乳剂分别包被防龋DNA疫苗（pGJA-P/VAX）和基因重组rPAc蛋白疫苗,用DNA初免,2周后蛋白加强免疫的策略滴鼻免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,分别收集初免后0、2、4、6、8、10、12、16周的血清和唾液,用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清和唾液中特异性抗体的水平。结果：制备的乳剂疫苗CLE/DNA和CLE/rPAc的粒径分别为134.6nm和230nm,ZETA电位为36mV和18.5mV,乳剂疫苗免疫小鼠后可以诱导血清特异IgG和唾液特异IgA产生,并且实验组（LE/DNA初免＋LE/rPAc加强免疫组）能产生较对照组（DNA初免＋rPAc加强免疫组）更持久的黏膜免疫反应,两组比较差异有显著性（P〈0.05）。结论：阳离子脂质体乳剂是有效的基因疫苗载体,与防龋疫苗（DNA和rPAc蛋白）合用免疫小鼠,可增强血清特异性IgG和唾液特异性IgA抗体水平,延长抗体维持时间,具有较好黏膜免疫反应增强作用。     

DNA防龋疫苗不同途径免疫BALB/c小鼠的实验研究

目的：观察编码pac结构基因A—P片段的重组质粒pCIA—P以不同途径免疫BALB／c小鼠后的特异性免疫反应。方法：重组质粒pCIA—P经鼻腔滴注和颌下腺区皮下腺注射两种途径免疫小鼠，ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。结果：滴鼻法和皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高，并持续数周。且滴鼻法比皮下注射法诱导唾液IgA型特异性抗体要早。结论：重组质粒pCIA—P是一种有效的免疫原，滴鼻法和颌下区皮下注射法接种防龋DNA疫苗都可有效诱导机体全身及局部黏膜免疫应答。而滴鼻法较皮下注射法能更早诱导局部黏膜免疫应答。     

防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX免疫小鼠后的抗DNA抗体检测

目的:检测防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX经鼻腔免疫和肌肉免疫后是否会产生抗DNA抗体。研究该疫苗是否会导致自身免疫性疾病。方法:提取纯化的质粒pGJA-P/VAX分别经鼻腔和肌肉免疫小鼠,于第0、2、4、8周取血清做抗DNA抗体检测实验(ELISA法)。结果:各实验组之间均无显著性差异,各组免疫前后及各组间比较(P>0.01)。结论:说明DNA疫苗pGJA-P/VAX及其载体pVAX1对小鼠均不会引起自身免疫反应,导致自身免疫病。     

牙龈卟啉单胞菌FimA蛋白和白细胞介素-15共表达质粒免疫小鼠的实验研究

目的观察重组质粒pIRES- fimA:IL15经滴鼻免疫BABL/c小鼠后诱导产生的血清和唾液抗体反应及白细胞介素- 15（IL- 15）对sIgA反应的调节作用。方法重组质粒pIRES- fimA:IL15与pIRES- fimA经滴鼻免疫和肌肉注射免疫BABL/c小鼠,以间接ELISA方法检测血清中IgG和唾液中sIgA抗体水平。结果重组质粒pIRES- fimA:IL15与pIRES- fimA经滴鼻免疫可诱导产生唾液sIgA反应,且该反应明显高于肌肉注射组,血清IgG水平与肌肉注射组无统计学差异。pIRES- fimA:IL15经滴鼻免疫产生的唾液sIgA滴度显著高于pIRES- fimA组,且有统计学差异（P<0.05）。结论滴鼻免疫可以作为抗牙龈卟啉单胞菌DNA疫苗有效的黏膜免疫途径,诱导循环和口腔局部抗体反应;IL- 15可以作为细胞因子佐剂通过滴鼻途径增强该疫苗诱导的sIgA反应强度。     

AddaVax经不同免疫途径对防龋疫苗的佐剂效应

目的：研究3种不同免疫途径下,防龋亚单位疫苗联合AddaVax佐剂接种小鼠所产生的免疫效果。方法：以rPAc与AddaVax混合物经鼻腔滴注、颊黏膜下注射及颈背部皮下注射等3种途径免疫小鼠,并以rPAc行鼻腔滴注免疫,ELISA法检测血清和唾液中的特异性抗体水平。结果：rPAc＋AddaVax皮下及颊黏膜下注射方式均可显著提高小鼠血清中抗PAcIgG水平;rPAc＋AddaVax颊黏膜下注射方式可有效提高小鼠唾液中抗PAcIgA水平。结论：rPAc与AddaVax联合经皮下及颊黏膜下注射方式可有效提高防龋疫苗的免疫效果。     

牙龈卟啉单胞菌基因疫苗pcDNA3.1(+)/kgpcd免疫原性研究

目的:研究重组质粒pcDNA3. 1( ) /kgpcd免疫原性,并观察目的基因编码的蛋白在小鼠肌肉及颌下腺组织中的原位表达情况。方法:重组质粒pcDNA3. 1 ( ) /kgpcd经肌肉注射和颌下腺区注射免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA方法检测免疫后BALB/c小鼠血清中IgG和唾液中sIgA抗体水平;用免疫组织化学染色观察目的基因编码的蛋白在小鼠组织中的表达。结果:重组质粒经肌肉注射免疫可产生高水平的特异性血清IgG抗体,颌下腺区注射可同时诱导高水平的唾液中sIgA和血清中IgG抗体;骨骼肌、颌下腺导管内、腺泡腔内可见阳性着色。结论:重组质粒pcDNA3. 1( ) /kgpcd经颌下腺注射可同时诱导黏膜免疫和全身免疫应答,可作为有效免疫原,这为免疫牙周炎模型定菌鼠实验提供了依据。     

重组亚单位和合成肽防龋疫苗的免疫效能

目的：比较重组亚单位rPAc防龋疫苗和合成肽疫苗诱导小鼠特异性体液免疫和黏膜免疫水平。方法：以rPAc疫苗和合成肽疫苗分别滴鼻免疫小鼠,2、4周后加强免疫,分别收集0、2、4、6、8、10、12周的血清和唾液,用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清和唾液中特异性抗体的水平。结果：以rPAc防龋疫苗免疫小鼠可产生较合成肽疫苗免疫小鼠更显著的黏膜免疫反应,两组比较差异有显著性（P〈0．05）。结论：重组亚单位rPAc防龋疫苗相对于合成肽疫苗具有更明显的黏膜免疫效果。     

Immunogenicity and persistence of a targeted anti-caries DNA vaccine

We have previously reported that a targeted anti-caries DNA vaccine, pGJA-P, induced accelerated and increased antibody responses compared with a non-targeted anti-caries DNA vaccine. Recently, pGJA-P/VAX, a new targeted anti-caries DNA vaccine for human trials, was constructed by replacing the pCI vector used in the construction of pGJA-P with pVAX1, the only vector authorized by the US Food and Drug Administration in clinical trials. Here, we report on our exploration of the kinetics of the antibody responses generated following pGJA-P/VAX immunization and the persistence of pGJA-P/VAX at both the inoculation site and the draining lymph nodes. Intranasal vaccination of mice with pGJA-P/VAX induced strong antibody responses that lasted for more than 6 months. Furthermore, pGJA-P/VAX could still be detected at both the inoculation site and the draining cervical lymph nodes 6 months after immunization. Thus, the persistent immune responses are likely due to the DNA depot in the host, which acts as a booster immunization.     

靶向防龋DNA疫苗在小鼠体内的存留时间分析

目的：观察靶向防龋DNA疫苗pG JA-P/VAX免疫小鼠后在免疫原位和引流淋巴结的存留时间。方法：靶向防龋DNA疫苗pG JA-P/VAX分别经肌肉注射和鼻黏膜滴注途径免疫BALB/c小鼠。免疫后1、3、6个月,取肌肉注射组注射局部的肌肉组织和腹股沟引流淋巴结,鼻黏膜滴注组鼻相关淋巴组织和颈部引流淋巴结,提取基因组DNA,以其为模板采用PCR方法扩增pG JA-P/VAX中的GLU序列。结果：免疫后1、3、6个月,在免疫局部组织和引流淋巴结的基因组DNA中均扩增得到870 bp的片段,测序证实该片段序列与GLU序列一致。结论：防龋DNA疫苗pG JA-P/VAX免疫小鼠后,可在免疫原位和引流淋巴结较长期存在。     

Flagellin enhances saliva IgA response and protection of anti-caries DNA vaccine

We and others have shown that anti-caries DNA vaccines, including pGJA-P/VAX, are promising for preventing dental caries. However, challenges remain because of the low immunogenicity of DNA vaccines. In this study, we used recombinant flagellin protein derived from Salmonella (FliC) as a mucosal adjuvant for anti-caries DNA vaccine (pGJA-P/VAX) and analyzed the effects of FliC protein on the serum PAc-specific IgG and saliva PAc-specific IgA antibody responses, the colonization of Streptococcus mutans (S. mutans) on rat teeth, and the formation of caries lesions. Our results showed that FliC promoted the production of PAc-specific IgG in serum and secretory IgA (S-IgA) in saliva of rats by intranasal immunization with pGJA-P/VAX plus FliC. Furthermore, we found that enhanced PAc-specific IgA responses in saliva were associated with the inhibition of S. mutans colonization of tooth surfaces and endowed better protection with significant fewer caries lesions. In conclusion, our study demonstrates that recombinant FliC could enhance specific IgA responses in saliva and protective ability of pGJA-P/VAX, providing an effective mucosal adjuvant candidate for intranasal immunization of an anti-caries DNA vaccine.     

细胞毒淋巴细胞相关抗原4靶向防龋DNA疫苗在细胞中的表达研究

目的采用绿色荧光蛋白标记技术,研究细胞毒淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）靶向DNA疫苗编码抗原在细胞中表达的一般形式,并探讨CTLA-4融合抗原片段大小对靶向DNA疫苗在细胞中表达水平的影响.方法从靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P中去掉A-P片段,构建出靶向防龋质粒pGJGLU;以pVAX1质粒骨架替代pGJA-P和pGJGLU质粒中的pCI载体骨架,构建出pGJA-P/VAX和pGJLU/VAX真核表达质粒;切下pGJGLU质粒的CTLA-4-Ig-GLU片段,克隆入pEGFP-N1中,获得pGJGLU/GFP质粒,转染CHO细胞,荧光显微镜下观察蛋白表达;将pGJA-P/VAX、pGJGLU/VAX和pGJGLU/GFP转染CHO细胞,以ELISA法检测培养上清液中融合蛋白的表达水平.结果pGJGLU/GFP转染细胞镜下表达特异性绿色荧光物质,呈颗粒状;pGJA-P/VAX、pGJGLU/VAX和pGJGLU/GFP 3种质粒可以表达融合蛋白并分泌到培养上清液中,且所表达的融合蛋白浓度不同,并以pGJGLU/VAX表达的水平最高.结论CTLA-4融合蛋白可以以分泌形式表达,CTLA-4靶向疫苗编码的融合抗原片段大小影响其在细胞中的表达分泌水平.     

靶向融合防龋DNA疫苗编码蛋白靶向于人树突状细胞的体外研究

目的：体外检测靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX1编码蛋白的生物学活性,研究蛋白是否具有靶向于抗原递呈细胞如树突状细胞的能力。方法：pGJA-P/VAX1和pVAX1分别转染真核细胞COS-7,收集并浓缩细胞培养上清。利用双抗夹心法,以人的IgG为标准品,检测上清及浓缩液中pGJA-P/VAX1编码蛋白的含量。体外培养人外周血来源的树突状细胞,与两种上清浓缩液孵育一段时间后,通过流式细胞术检测树突状细胞是否结合编码蛋白。实验分A、B、C组,A组树突状细胞与VAX1浓缩液作用,B组中树突状细胞与GJA-P/VAX1浓缩液作用,C组中树突状细胞表面B7分子首先被B7-1和B7-2的单克隆抗体封闭,然后与GJA-P/VAX1浓缩液作用。结果：pGJA-P/VAX1转染细胞后,培养上清的浓缩液中蛋白浓度相当于0.22μg/mL人的IgG。而pVAX1转染上清及浓缩液均未有蛋白检出。流式结果显示B组细胞平均荧光强度及细胞表面编码蛋白阳性率明显高于A组和C组。B组相对A组和C组,细胞直方图峰向右偏移。A、C两组细胞平均荧光强度近似,且两组细胞直方图近乎重合。结论：靶向融合防龋DNA疫苗编码的融合蛋白保持了CTLA-4的活性,可通过B7分子靶向结合树突状细胞。     

LE-pGJA-P/VAX黏膜递呈系统的制备及其理化性质评价

目的:制备LE-pGJA-P/VAX黏膜递呈系统,并对其理化和生物学性质进行检测。方法:利用中试生产的pGJA-P/VAX质粒通过与脂质体LE溶液直接混合制备LE-pGJA-P/VAX复合物,通过琼脂糖凝胶电泳阻滞实验和激光粒度仪检测该复合物的理化性质,并将其体外转染CHO细胞检测是否能体外表达目的蛋白。结果:制备的LE-pGJA-P/VAX复合物平均粒径为50nm,ZETA电位为14.5mV,体外转染CHO细胞48h后,经细胞免疫荧光染色,转染组可见细胞浆红色荧光染色,提示可有效表达质粒编码的PAc蛋白,而裸质粒转染组则未见明显红色荧光。结论:LE-pGJA-P/VAX复合物表面电荷均匀,粒径小,且粒径分布范围窄,符合纳米粒子特征,可在体外表达编码蛋白,提示该递呈系统可用于防龋DNA疫苗的黏膜递呈,为后续增强防龋DNA疫苗经鼻腔黏膜途径投递的免疫效能奠定基础。     

靶向融合防龋DNA疫苗免疫田鼠的实验研究

目的 :以定菌田鼠为动物模型 ,经不同免疫途径 ,比较 3种防龋DNA疫苗 [pGLUA -P(以 pCI为载体 ) ,pGJA -P(以 pCI为载体 ) ,pGJA -P(以 pVAX为载体 ) ]的免疫防龋效果。 方法 :将 96只田鼠随机分为 12组 ,接种变形链球菌并给予致龋饲料 ,按 6因素 (3种质粒 ,2种空载体 ,生理盐水 ) 2水平 (肌肉 ,粘膜途径 )析因设计方案免疫田鼠 ,采用ELISA方法检测各组田鼠血清IgG和唾液IgA水平 ,参照Keyes经典计分标准进行龋齿计分 ,观察各组田鼠磨牙患龋情况和一般安全性指标。结果 :疫苗免疫组特异性抗Pac血清IgG和唾液IgA抗体水平均显著高于非疫苗免疫组 (P <0 .0 1) ,而龋齿记分显著低于非疫苗免疫组 (P <0 .0 1)。同一接种途径中 ,不同质粒刺激机体产生的抗体水平不同 ,同种质粒 ,经不同途径接种诱导机体产生抗体水平也不同 ,其中以鼻粘膜免疫接种pGJA-P(以 pCI为载体 ) ,pGJA -P(以pVAX为载体 )组的唾液抗Pac的sIgA水平高 ,龋齿记分低 ,与其它实验组比较差异有显著性 (P <0 .0 1)。结论 :靶向融合防龋DNA疫苗能够激发机体产生免疫反应 ,经粘膜免疫可诱导较高的唾液抗Pac的sIgA ,并且有效的控制龋齿的发生和发展。     

抗STAT3shRNA对树突状细胞成熟影响研究及其靶向防龋DNA疫苗构建

目的: 研究以慢病毒为载体的抗小鼠STAT3 shRNA对树突状细胞(DC)成熟的影响,构建抗STAT3 shRNA树突状细胞靶向防龋DNA 疫苗。方法: 制备抗小鼠STAT3 shRNA慢病毒,体外转染树突状细胞系DC2.4,用Western杂交检测抑制STAT3表达的效果;用流式细胞术检测CD40、CD80和CD86表达;在抑制DC2.4的STAT3表达后,用LPS刺激,流式细胞术检测其对DCs成熟的影响;将针对STAT3的特异性shRNA整合入DC靶向防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX,转染HEK-293细胞检测抑制STAT3表达效果。结果: 抗STAT3 shRNA慢病毒转染DC2.4后,可明显抑制STAT3表达,并增加DC表面标记物CD40、CD80和CD86的表达;用LPS刺激后,CD40、CD80和CD86表达进一步增强;抗STAT3 shRNA DC靶向防龋DNA疫苗转染HEK-293细胞后可以抑制STAT3表达。结论: 小鼠抗STAT3 shRNA慢病毒可有效抑制DC2.4 STAT3的表达,STAT3沉默后可促进DC2.4成熟。成功构建抗STAT3 shRNA DC靶向防龋DNA疫苗。