蕾状期成釉器重建体外模型的建立

目的:研究小鼠下颌第一磨牙胚蕾状期:①牙间充质对牙胚上皮发生的控制作用;②原发釉结节对牙胚间充质的定义作用;③牙胚上皮细胞位置信息在牙齿发育中的作用.材料与方法:使用小鼠蕾状期下颌第一磨牙蕾状期牙胚,在体外利用胰蛋白酶解离后的牙间充质与混合牙胚上皮细胞进行了重组培养至14天.结果与结论:结果显示蕾状期牙胚上皮具有高度的可塑性,在丧失了全部位置信息后牙胚上皮细胞仍能在牙胚间充质的诱导下完成成釉器的重建及一系列的组织发生.这表明胚间充质在原釉结节形成时对牙胚上皮组织学发生具有可能的控制作用,即在原釉结节形成前在牙胚间充质中可能已存在有牙齿发生所需的全部信息.而在成釉器的体外重建过程中,牙胚间充质则起到了支架的作用.     

帽状期成釉器重建体外模型的建立

目的:建立帽状期成釉器体外重建模型.方法:取胚14 d小鼠下颌第一磨牙帽状期牙胚,在体外利用胰蛋白酶解离后的混合成牙上皮细胞与间充质进行重组培养.结果:培养24 h,混合成牙上皮开始重建至蕾状期,48～72 h原发釉结节形成,96 h牙尖开始形成,144 h成釉器发育进入钟状期.结论:帽状期混合成牙上皮细胞与间充质重组培养后成釉器获得迅速重建,牙齿发育得以继续进行.     

钟状期小鼠磨牙牙胚组织中蛋白聚糖类型的检测分析

目的:检测分析钟状期小鼠磨牙牙胚组织中蛋白聚糖的类型。方法:建立钟状期小鼠磨牙牙胚体外培养模型,用核素标记,凝胶层析,碱处理及酶消化的方法分析体外培的养牙胚组织中蛋白聚糖的类型。结果:体外培养的小鼠钟状期磨牙牙胚、成釉器与牙乳头中[35S]标记的大分子经Superose 6层析柱层析后,均得到3个洗脱峰。其中第1个洗脱峰经硫酸软骨素酶ABC消化后完全消失,第2、第3个洗脱峰在硫酸软骨素酶ABC消化后峰值降低,继续用乙酰肝素酶消化后则基本消失。只用硫酸角质素酶处理,上述3个洗脱峰均未发生改变。碱处理后3个洗脱峰均消失,并在有效分配系数Kd=0.47处出现1个新的洗脱峰。结论:小鼠钟状期磨牙牙胚、成釉器与牙乳头组织含有大分子硫酸软骨素蛋白聚糖、小分子硫酸软骨素蛋白聚糖以及硫酸乙酰肝素类蛋白聚糖,但不存在硫酸角质素蛋白聚糖。     

组蛋白去甲基化酶JMJD3在小鼠牙发育中的表达

目的 研究组蛋白去甲基化酶JMJD3在牙发育过程中的表达.方法 采用免疫组织化学方法观察小鼠胚胎E14~18天及出生后P1~P3磨牙牙胚中组蛋白去甲基化酶JMJD3的表达.结果 JMJD3表达于细胞核内,包括上皮性细胞和间充质细胞.在小鼠磨牙牙胚发育的蕾状期(E14)和帽状期(E16),JMJD3在牙蕾上皮,成釉器内釉细胞、外釉细胞、星网状细胞中弱表达.在小鼠磨牙牙胚发育的钟状期(E18),JMJD3在成釉器的外釉细胞层,内釉细胞层,中间层、星网状层及邻近间充质细胞内呈强阳性表达.在小鼠磨牙牙胚发育钟状晚期(P3), JMJD3在成釉细胞、成牙本质细胞及邻近间充质细胞呈强阳性表达.结论 JMJD3在小鼠牙发育过程中呈时空特异性表达,提示JMJD3参与小鼠磨牙的发育.     

乙酰基亚硝基脲对体外培养小鼠牙胚的作用研究

目的:观察化学致畸、致癌物乙酰基亚硝基脲(ethylnitrosourea,ENU)对体外培养牙胚发育、分化的影响.方法:通过体外牙胚器官培养模型观察培养液中不同浓度的ENU对17天胎龄的小鼠下颌第一磨牙牙胚形态发育的影响.结果:牙胚培养6天后,在含10%小牛血清的BGJb培养液中,牙胚的内釉上皮细胞分化为成釉细胞并分泌牙釉质基质,而其下方的牙乳头细胞分化为成牙本质细胞并分泌前期牙本质.当BGJb培养液中含0.025%ENU时,牙胚成釉器的星网层发生液化、囊性变.当BGJb培养液中含0.05%ENU时,牙胚发育受到抑制,其完整性被破坏,部分细胞溶解坏死.结论:一定量的ENU可使发育中的牙胚发生囊肿样变,过量的ENU对发育中的牙胚产生毒性作用.     

β-连环蛋白和E-钙粘蛋白在小鼠磨牙牙胚发育中的研究

目的研究β-连环蛋白(β-catenin,β-cat)和E-钙粘蛋白(E-cadherin,E-cad)在小鼠磨牙牙胚发育过程中的表达分布和意义。方法取胚胎13,15,16天(E13,E15,E16)和出生后1天、5天(P1,P5)的ICR小鼠,制备含上颌第一磨牙的各阶段牙胚发育标本,免疫组化二步法检测β-cat和E-cad在牙胚发育不同时期的表达。结果E13天牙胚处于蕾状期,E15天为帽状期,E16天为钟状早期,P1天处于钟状中期,P5天为钟状晚期。β-cat和E-cad在牙齿发育的各个阶段表达具有时空特异性,前者在各个阶段的成釉器上皮和其下方间充质中均表达,后者在釉质形成之前仅表达于成釉器上皮,之后在成牙本质细胞中也有表达。结论β-连环蛋白和E-钙粘蛋白参与牙胚发育的细胞形成与分化,表明细胞粘附和Wnt信号途径对牙胚发育具有调控作用。     

FGF2对体外培养牙胚冠部形态的调控作用

目的：观察FGF2对体外培养的小鼠第一磨牙牙胚冠部形态分化发育的影响。方法：取18d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚，置于含外源性FGF2的半固态培养基表面，组织学观察FGF2对体外培养的牙胚发育的影响。结果：经10μg/ml FGF2作用的磨牙胚培养9d后形成高耸的牙乳头尖，牙胚体积增大，牙尖及邻近部位牙乳头细胞分化为柱状或高柱状的成牙本质细胞，排列整齐，并有基质开始沉积，细胞分化程度、数量均高于对照组。结论：FGF2具有诱导牙胚组织细胞分化的功能。     

新基因mcpr1在小鼠牙胚发育中的时空表达和意义

目的:探讨mcpr1在牙胚发生过程中的可能作用。方法:采用免疫组化LsAB法观察MCPR1在小鼠牙胚发育各个时期的表达分布及其变化情况。结果:MCPR1在小鼠牙胚各个时期均有表达,但各期分布模式有所不同,帽状期开始在成釉器上皮细胞表达,在釉结节内亦呈现强阳性表达,在分化成熟的成牙本质细胞及成釉细胞内呈现出强阳性表达。结论:mcpr1可能通过上皮-间充质之间的信号传递及相关基因的相互调控,参与成釉器的成熟及牙胚的发育。     

跨膜蛋白Syndecan-1在不同发育时期小鼠磨牙组织中的表达

目的以小鼠磨牙为发育模型，研究其不同发育时期跨膜蛋白Syndecan- 1的表达特点，进而分析Syndecan-1在牙齿发育中的作用。方法取不同胎龄的胎鼠，制作其下颌第一磨牙的切片，进行免疫荧光染色，并在荧光显微镜下观察Syndecan- 1的表达情况。结果Syndecan- 1的表达随牙胚发育的时期不同而变化：蕾状期时在牙源性上皮和间充质中有弱的阳性分布，帽状期时成釉器上皮阳性表达减弱，而牙乳头及周围的间充质的阳性反应明显增强，钟状期时成釉器上皮又呈阳性表达，并以在中间细胞层的反应更为强烈，而牙乳头间充质的染色则很弱，同时前成釉细胞以及下方的成牙本质细胞的顶端也呈Syndecan- 1的阳性表达。结论Syndecan- 1参与了成釉器和牙乳头的发育和分化过程的调节，并与牙胚细胞的增殖以及成釉细胞和成牙本质细胞的分化相关。     

半固态培养基法培养鼠磨牙牙胚的实验观察

目的 :观察体外培养的鼠磨牙牙胚发育过程的组织学变化。方法 :用 16d胎龄的昆明小鼠下颌第一磨牙牙胚置于RPMI- 16 40半固态培养基上培养 ,常规组织学观察。结果 :体外培养的牙胚可由帽状期进入钟状期 ,出现成牙本质细胞和成釉细胞的分化及前期牙本质的形成。结论 :半固态培养基法培养牙胚可保持其发育过程。     

Inhibition of apoptosis in early tooth development alters tooth shape and size

Apoptosis plays important roles in various stages of organogenesis. In this study, we hypothesized that apoptosis would play an important role in tooth morphogenesis. We examined the role of apoptosis in early tooth development by using a caspase inhibitor, z-VAD-fmk, concomitant with in vitro organ culture and tooth germ transplantation into the kidney capsule. Inhibition of apoptosis at the early cap stage did not disrupt the cell proliferation level when compared with controls. However, the macroscopic morphology of mice molar teeth exhibited dramatic alterations after the inhibition of apoptosis. Crown height was reduced, and mesiodistal diameter was increased in a concentration-dependent manner with z-VAD-fmk treatment. Overall, apoptosis in the enamel knot would be necessary for the proper formation of molar teeth, including appropriate shape and size.     

Regulating the role of bone morphogenetic protein 4 in tooth bioengineering.

PURPOSE: Culture of the whole organ and regulation of its development using biologic and engineering principles can be used to produce structures and organs for reconstructing defects. The application of these bioengineering approaches in artificial tooth development may be the alternative way to replace missing dentition. MATERIALS AND METHODS: For the artificial bioengineering of a mouse tooth, tooth buds were dissected and transplanted into the diastema of the developing mandible. The mandiblular primordia containing transplanted tooth buds were culture in vitro and in vivo using a bioengineering method. In addition, to regulate the development of tooth germs, bone morphogenetic protein 4 (BMP4) or its antagonist, Noggin was administered. RESULTS: After the period of in vitro and in vivo culture, the transplanted tooth germ in the diastema showed tooth development with supportive structure formation. In the BMP-treated group, the bioengineered tooth was observed with increased maturation of cusp and enamel matrix. However, in the Noggin-treated tooth germs, the developing molar had a crater-like appearance with the immature development of the cusp and suppressed formation of the enamel matrix. CONCLUSIONS: This study confirmed that tooth germ transplantation in the diastema and culture with administration of BMP4 could lead to the mature development of the dental structures. In addition, these results suggest the possibility of bioengineering the tooth in morphogenesis and differentiation even in the toothless area.     

Notch1在小鼠下颌第一磨牙牙胚发育中的表达

目的探讨Notch1在小鼠下颌第一磨牙胚胎发育过程中的组织学分布。方法制作ICR小鼠下颌第一磨牙不同发育阶段的冰冻组织切片,对小鼠下颌第一磨牙自牙胚发育起始期至出生后2天不同发育阶段组织的Notch1分布情况进行免疫组织化学染色。结果 Notch1在小鼠下颌第一磨牙牙胚发育起始期和蕾状期牙板上皮上方或其包绕的口腔上皮中表达,在牙板上皮中没有表达。自帽状期至钟状期,Notch1在牙胚的中间层表达,而在内釉上皮中无表达。至牙釉质和牙本质分泌期,Notch1仍在颈环部位的中间层表达。此外,Notch1还在牙胚发育不同时期的间充质、牙乳头和早期牙髓中表达。结论 Notch1可能在小鼠下颌第一磨牙发育过程中的牙上皮特别是内釉上皮的细胞分化,以及牙囊和牙乳头细胞分化及分化完成后的牙髓干细胞的稳定性方面有重要作用。     

大鼠牙乳头与成釉器重组肾被膜下种植的研究

目的：观察大鼠牙乳头对成釉器上皮的诱导作用。方法：出生后7dSD大鼠下颌第一磨牙根部的牙乳头与出生后2d的第二磨牙成釉器分别重组，出生后2d冠部牙乳头与成釉器重组为对照组。体外培养2d后种植于成年大鼠肾被膜下，1周，4周后取材，组织学观察上皮分化情况和硬组织形成情况。结果：1周后实验组重组体生成薄层的牙本质结构，内侧成牙本质细胞排列整齐，牙源性上皮未分化成成釉细胞，而有大量的骨样物质生成，对照组形成较为完整的牙冠结构。4周后，实验组重组体形成类牙根形态但仍无釉质形成。结论：根部牙乳头不具有促进成釉上皮分化的能力。     

Shh反义核酸对体外培养小鼠牙胚发育的影响

目的 用Shh反义寡脱氧核苷酸（ODN）抑制体外培养小鼠牙胚中Shh的翻译，观察该抑制反应对牙胚生长及矿化的影响。方法 培养牙胚取自胎龄为E17．5d昆明小鼠下颌第一磨牙，利用简易Trowell支架，建立小鼠牙胚体外培养模型，实验共分为三组：反义ODN组；正义ODN组及空白对照组，核酸浓度为30μmol/L。体外分别培养10d后，进行HE染色、von Kossa染色。结果 蛋白印迹结果显示所应用的反义核酸阻断了牙胚中Shh的表达。HE、von Kossa染色结果显示：培养10d，S-ODN组与空白对照牙胚进入钟状晚期，细胞分化，并可见分泌的基质带；钙磷酸盐在成牙本质细胞与成釉细胞间的基质中沉积。AS-ODN组牙胚培养10d，牙胚进入钟状期，但牙胚体积明显变小，牙尖形态发育不良，成牙本质细胞排列紊乱，但仍可见高柱状分泌期细胞；von Kossa染色未见明显钙磷酸盐沉积。结论 Shh反义核酸减缓体外培养牙胚的发育，可能通过对成牙本质细胞分泌功能的影响而影响牙胚的矿化。