犬骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:研究犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在体外诱导分化为成骨细胞的方法和活性检测。方法:抽取犬骨髓3 mL,使用成骨条件培养液,贴壁法体外培养,将培养的第2、3代细胞进行透射电镜、流式细胞仪、生长曲线、碱性磷酸酶、Von Kossa和免疫组化等检测。结果:第2代细胞碱性磷酸酶染色呈阳性表达;第3代细胞Von Kossa染色、骨桥素、骨涎蛋白和骨钙蛋白呈阳性表达;第3代细胞透射电镜显示高尔基体和线粒体丰富;流式细胞仪检测显示第3代处于S期的细胞比例较第2代增加。结论:犬骨髓基质细胞在体外能定向诱导分化为成骨细胞。     

犬牙周膜细胞和骨髓基质细胞相互作用的体外实验研究

目的:研究牙周膜细胞(PDLCs)和骨髓基质细胞(BMSCs)共培养是否更利于牙周组织再生。方法 :用组织块法培养PDLCs,用全血贴壁法培养BMSCs,检测它们的成骨、成脂诱导分化能力。用Transwell小室共培养这两种细胞,通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测共培养后这两种细胞的增殖能力及部分基因的表达变化。结果:PDLCs和BMSCs具有多向分化潜能。共培养能促进它们各自增殖,上调Ⅰ型胶原(COLI)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)、骨钙素(OCN)、核心结合因子2(RUNX2)的表达。结论:PDLCs和BMSCs共同运用作为种子细胞可能更有利于牙周组织再生。     

不同浓度bFGF对犬骨髓基质细胞增殖、分化影响的实验研究

目的：研究不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factot,bFGF）对体外培养的beagle犬骨髓基质细胞（bone marrow stromal ceils，BMSCs）增殖和分化的影响。方法：体外培养第2代BMSCs的培养液中分别加入不同浓度（25、50、100、200ng／mL）的bFGF，连续6d倒置显微镜下动态观察BMSCs的形态和生长情况．行MTT比色、碱性磷酸酶（alkalin ephosphatase，ALP）活性定量检测、ALP和Von Kossa染色。结果：浓度为50ng／mL的bFGF可明显促进犬的BMSCs增殖（P〈0．05），但无显著促进犬BMSCs分化的作用（P〉0．051。结论：bFGF能有效促进犬BMSCs的增殖，且与bFGF剂量有关。     

颌骨骨髓基质细胞与牙周膜细胞的生物学特性比较

目的:比较颌骨骨髓基质细胞与牙周膜细胞的基本生物学特性。方法:分离颌骨来源骨髓基质细胞和牙周膜细胞,进行改良体外原代培养。倒置显微镜观察细胞生长及克隆形成情况;CCK-8检测细胞生长曲线;免疫荧光染色检测STR0-1表达;成脂诱导后检测脂滴形成,矿化诱导后检测碱性磷酸酶的变化并用RT-PCR检测7、14 d成骨相关基因OCN的表达水平。结果:两种细胞体外培养均呈成纤维样细胞外形,能克隆生长,均具有活跃的增殖能力;两种细胞STR0-1表达阳性;成脂诱导后可见脂滴形成;矿化诱导后骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性较强,而且OCN基因表达较早且较强。结论:颌骨来源骨髓基质细胞具有较强的增殖及成骨分化能力,具有干细胞特性,可能是有较大临床应用潜力的组织工程种子细胞。     

犬骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化及细胞片层的制备

目的分离培养犬骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）并向成骨细胞诱导分化,制备骨髓基质干细胞的细胞片层。方法密度梯度离心法分离犬骨髓基质干细胞,接种于DMEM成骨诱导培养基,向成骨细胞诱导分化,利用温度反应性培养皿的温度感应性,制备细胞片层。观察犬BMSCs、成骨细胞诱导分化及细胞片层形态学特点与生物学特性。结果分离培养出犬BMSCs,成功地向成骨细胞实现诱导分化,并观察到钙结节。利用温度反应性培养皿的温度感应性,收获了完整的细胞片层。结论细胞片层技术与传统的骨组织工程方法相结合,将有望构建出含板层骨结构的大块组织工程骨。     

应用骨髓基质细胞片层构建组织工程骨的实验研究

目的 探讨犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)片层在构建组织工程骨中的价值。方法 抽取犬髂骨骨髓,采用密度梯度离心法分离犬骨髓基质细胞(BMSCs)。制备犬同种异体脱钙骨基质(dermineralized bone matrix,DBM)。将人重组骨形态发生蛋白-2(recombination human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)复合到DBM上。将经成骨诱导的第3代细胞接种于温度反应性培养皿中,制备BMSCs细胞片层。用得到的BMSCs细胞片层包裹DBM/rhBMP-2/BMSCs复合体,植入犬左侧背阔肌肌筋膜下为实验组,以无BMSCs细胞片层包裹的DBM/rhBMP-2/BMSCs复合体植入犬右侧背阔肌肌筋膜下为对照组。术后8、12、16周取材行组织学观察,评价体内异位成骨的情况。结果 成骨面积实验组(对照组,两组差异有显著性(P<0.05)。术后16周,实验组有大量板层骨形成,有哈弗氏系统形成,骨髓腔内有红骨髓。对照组有板层骨形成,无哈弗氏系统形成,骨髓腔内无红骨髓。结论 BMSCs细胞片层可促进具有致密板层骨和哈弗氏系统的组织工程骨的形成。     

犬骨髓基质干细胞诱导为成骨细胞的实验研究

目的：研究骨髓基质干细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs)在体外培养，诱导后的成骨活性，探讨BMSCs作为骨组织工程种子细胞的可能性和可行性。方法：抽取成年犬骨髓，用梯度离心法获取单核细胞，经条件培养液体外诱导培养后，进行组织化学、免疫组化、原位杂交检测，并在透射电镜下观察其成骨活性。结果：第1代细胞Alkaline phosphatase(AKP)染色、Core-binding factor alpha subunit 1(Osf2/Cbfal)、Osteopotin(OPN),I型胶原的免疫细胞化学检测和I型胶原的原位杂交结果开始呈现阳性，第3代细胞Bone Sailoplain(BSP),Osteocalcin(OCN)免疫细胞化学染色开始呈现阳性，透射电镜显示细胞外有胶原分泌和钙盐沉积。结论：BMSCs不仅能大量扩增，且在一定条件下可向成骨细胞分化，是骨组织工程理想的种子细胞。     

釉基质蛋白对人骨髓基质细胞增殖和矿化的影响

目的:观察釉基质蛋白(enamelmatrix proteins,EMPs)对人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)细胞周期和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。方法:体外培养人骨髓基质细胞,以200μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。流式细胞仪检测EMPs对BMSCs细胞周期的影响,碱性磷酸酶试剂盒检测ALP的活性。结果:体外培养的人BMSCs生长良好,200μg/ml浓度的EMPs能提高细胞的ALP活性;影响细胞周期变化,EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%。结论:釉基质蛋白可促进人骨髓基质细胞的分化,影响细胞周期变化。     

雷诺昔芬对骨质疏松大鼠骨髓基质细胞的影响

目的:研究不同浓度的雷诺昔芬对骨质疏松大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)增殖及分化的影响。方法:构建Sprague-Dawley(SD)大鼠骨质疏松模型,培养假手术组(Sham-ovariectomized rats,Sham组)及手术组(ovariectomized rats,OVX组)大鼠BMSCs,取生长良好的第3、第4代BMSCs,加入不同浓度的雷诺昔芬作用后,以MTT法检测BMSCs的增殖,速率法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的含量。结果:Sham组大鼠第4代BMSCs较第3代增殖缓慢,ALP含量无明显变化;OVX组大鼠第4代BMSCs增殖能力增强,但ALP含量亦无明显变化。结论:OVX组BMSCs的增殖活力、成骨分化能力显著高于Sham组。雷诺昔芬可促进Sham组BMSCs的增殖,可促进OVX组BMSCs的增殖与分化。     

不同来源骨髓间充质干细胞成骨能力的比较

目的 比较人不同来源骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)的骨向分化能力,为骨组织工程筛选种子细胞提供一定的理论基础.方法 体外组织块培养法和有限稀释法培养颌骨来源骨髓间充质干细胞(jaw bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,JMMSCs);骨髓穿刺法和密度梯度离心法培养长骨来源骨髓间充质干细胞(bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs).流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记,成骨分化诱导后茜素红染色检测细胞矿化能力,成骨分化诱导后qRT-PCR及Western Blot检测细胞成骨相关分子:Runx2、1型胶原(Collagen Type 1,COL-1)、OCN.结果 JMMSCs和BMMSCs均阳性表达CD90、CD105,阴性表达CD34、CD14、CD45.成骨分化诱导21 d后,茜素红染色显示JMMSCs矿化能力强于BMMSCs.成骨诱导7 d、14 d、21 d后,JMMSCs成骨相关分子在基因和蛋白水平上均强于BMMSCs.结论 与BMMSCs相比,JMMSCs成骨分化能力较强,颌骨骨髓可能更适于用作骨组织工程的成体干细胞来源.     

大鼠颌骨与胫骨骨髓基质细胞生物学特性和基因表达差异的比较

目的 :比较大鼠颌骨来源骨髓基质细胞(M-BMSCs)与胫骨来源骨髓基质细胞(T-BMSCs)生物学特性的差异。方法:体外通过全骨髓贴壁法,分离和培养SD大鼠M-BMSCs和T-BMSCs,取第3代细胞用于:1流式细胞检测鉴定表面标志;2MTT、细胞周期、克隆形成率检测细胞增殖能力差异;3成骨、成脂诱导及染色检测细胞多项分化潜能;4碱性磷酸酶(ALP)活性、染色、免疫荧光染色检测细胞成骨活性的差异;5荧光定量PCR检测Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、Col I的表达差异和成骨诱导后各基因的表达变化。结果:1 M-BMSCs和T-BMSCs阳性表达CD29、CD44,阴性表达CD45;2MTT、细胞周期检测、克隆形成率显示T-BMSCs细胞增殖能力较高;3M-BMSCs在成骨诱导后矿化能力更强;而T-BMSCs成脂诱导形成脂滴的能力更强;4M-BMSCs表达ALP的水平更高;5荧光定量PCR示2种细胞的Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、ColⅠ表达存在差异。结论:体外培养的M-BMSCs和TBMSCs有着不同的生物学特点,其相关基因Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、ColⅠ的表达上存在差异。     

兔骨髓基质细胞的体外成骨定向诱导培养

目的:体外分离培养兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs),并向成骨定向诱导培养,为骨组织工程提供适宜的种子细胞。方法:抽取新西兰白兔的骨髓,体外分离纯化得到BMSCs,并利用条件培养液将其向成骨定向诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化情况;使用碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色的方法,鉴定其成骨性能;用MTT法描绘标准细胞浓度-OD值曲线。结果:BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖;经ALP和VonKossa染色证实其有成骨潜能;标准BMSCs细胞浓度-OD值曲线显示细胞浓度和OD值呈线性正相关。结论:可以通过在体外分离纯化骨髓并诱导培养,获得足够数量、有成骨潜能的BMSCs作为骨组织工程的种子细胞。     

甲状旁腺素对共培养的髁突软骨细胞和BMSCs成骨分化的影响

目的:研究甲状旁腺素(PTH)在持续性或间歇性作用方式下对共培养的髁突软骨细胞和BMSCs分化和骨质形成的影响.方法:根据PTH应用方式不同分为3组:PTH持续应用组、PTH间歇应用组、空白对照组.用茜素红染色检测培养6 d和14 d后,各组细胞矿化结节的形成情况;用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性,应用Western blot和Real-time PCR检测BMSCs成骨分化、骨形成相关蛋白和基因mRNA.结果:PTH间歇应用组在6 d和14 d时形成的矿化结节数量最多,而PTH持续性应用组形成的矿化结节在3组中数量最少.经过6 d和14 d的PTH作用,PTH间歇应用组的ALP活性,RUNX2、BSP和MMP13蛋白,成骨分化标志物RUNX2,ALP和骨形成相关基因OCN及OSX的表达,均明显高于PTH持续应用组和空白对照组(P<0.05).PTH持续应用组COL2a1的mRNA及成骨抑制基因SOST mRNA的表达量明显高于PTH间歇应用组(P<0.05).结论:间歇性应用PTH可明显促进共培养体系的成骨向分化及骨质形成,而持续性应用PTH则抑制该过程.     

犬自体血清培养骨髓基质细胞的实验研究

目的:探讨犬自体血清培养骨髓基质细胞的可行性方法:获取犬自体血清,配制成含10%和20%自体血清的培养液,与含10%胎牛血清的培养液在相同条件下培养犬骨髓基质细胞(BMSCs)。通过倒置显微镜下观察细胞形态,细胞计数以及MTT法对细胞增殖情况进行检测。并且对第2代细胞用3种不同血清成分培养液(均加入β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及地塞米松)进行成骨诱导分化,采用免疫组化检测碱性磷酸酶及钙结节形成。对检测到的量化数据做统计学分析,比较各组间的差异,以评价不同血清成分培养液对细胞增殖分化的影响。结果:3组细胞的生长及形态无明显差别,经过诱导培养均能形成钙结节。对3组间量化检测做统计学分析,各组间差异无统计学意义。结论:制备的犬自体血清能完全替代胎牛血清对骨髓基质细胞进行诱导培养。     

BMSC—HA／TCP修复牙槽骨缺损后牙齿移动的实验研究

目的：探讨小型猪牙齿在牙槽骨缺损修复区的移动情况。方法：选用6只实验用小型猪（8-10个月龄），在一侧前磨牙近中造成直径为15mm，高为10mm圆柱状的骨缺损区。获取小型猪的自体骨髓基质细胞，分离培养并诱导为成骨样细胞。将小型猪自体骨髓基质干细胞与生物复合体（60％羟基磷灰石＋40％磷酸三钙）复合后，种植到骨缺损区。另一侧作为对照侧。术后14W用60g力牵引双侧第一前磨牙近中移动。于12W后测量双侧前磨牙的移动距离。进行配对t检验比较。结果：6只小型猪两侧第一前磨牙近中移动平均距离的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：应用细胞支架构建方式，可修复小型猪的上颌骨缺损，修复后不会对牙齿移动产生不良影响。     

冻存骨髓基质细胞和胶原膜在裸鼠体内的成骨研究

目的：研究经超低温冻存后的骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）和支架材料胶原膜BME-10X复合体植入裸鼠体内的成骨情况.方法：体外分离培养Beagle犬 BMSCs,冻存二代生长状况良好的BMSCs.12个月后,复苏冻存的BMSCs,并在体外构建BMSCs和0.5 cm×0.5 cm大小的BME-10X复合体.将胶原膜＋BMSCs＋矿化诱导培养液、胶原膜＋BMSCs＋基础培养液、单纯胶原膜＋矿化诱导培养液培养5 d后,植入裸鼠体内,并于术后第4、8、12周取出标本,进行大体观察和组织病理学分析.结果：单纯胶原膜＋诱导培养液组在植入胶原膜后,胶原膜边界清晰,膜边缘及内部基本没有细胞生长;在胶原膜＋BMSCs＋基础培养液组,术后第4周可见,胶原膜内有细胞长入,并有细小的条索状新生胶原形成,随着时间的延长,支架胶原逐渐分解,新形成的条索状胶原纤维变粗大;在胶原膜＋BMSCs＋矿化诱导培养液组,植入后也可见支架胶原的分解和更多的细胞生长,大量新生的胶原形成类骨质样组织.结论：冻存BMSCs复苏后进行体外培养扩增与诱导分化,并在在体内环境下复合胶原支架材料,仍然具有较强成骨能力.     

氯化镧对体外培养的犬骨髓基质细胞增殖的影响

目的:观察3种浓度的氯化镧(LaCl3,La3+)对体外培养的犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的影响。方法:用5.564×102、5.564、5.564×10-2μg/mL3种浓度的La3+干预第3代BMSCs,设空白对照组和50ng/mLBMP-2干预的阳性对照组。通过MTT法、碱性磷酸酶半定量检测分析La3+对BMSCs的影响。结果:5.564μg/mL La3+干预组BMSCs在第6、7天表现出较高的生长趋势;碱性磷酸酶半定量检测发现5.564μg/mL La3+干预组OD值均数明显高于另两个实验组均数(P<0.05)。结论:5.564μg/mL浓度的La3+可促进BMSCs增殖。