X-性染色体连锁凋亡抑制蛋白与口腔鳞癌细胞Tca8113化疗耐药的关系

目的研究X-性染色体连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）在口腔鳞癌细胞Tca8113中的表达水平,并探讨XIAP表达与Tca8113细胞对化疗药物耐药性之间的关系。方法用平阳霉素（PYM）间歇性加药,逐步递增剂量,采用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测药物处理前后细胞对PYM的敏感性,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测XIAP在药物处理前后的各Tca8113细胞组中的表达变化,并探讨XIAP与细胞耐药性的关系。结果Tca8113细胞在PYM间断作用下产生耐受,Tca8113-1-10组、Tca8113-10-10组耐药细胞对PYM的半数有效浓度（IC50）分别为（12.758±0.030）、（18.986±0.150）μg·mL-1。Tca8113-1-20、Tca8113-10-20组耐药细胞对PYM的IC50分别为（26.302±0.072）、（35.294±0.115）μg·mL-1。XAIP的表达水平与细胞对PYM的耐药有相关性（P<0.01）。结论XIAP在口腔鳞癌中的表达水平升高,可能与鳞癌的化疗耐药性有关,这可作为口腔鳞癌基因治疗的一个新靶点。     

慢病毒介导COX-2基因沉默对舌鳞癌Tca8113细胞株药物敏感性的影响

目的:研究COX-2基因沉默表达对舌鳞癌Tca8113细胞药物敏感性的影响。方法:运用RNA干扰技术,构建慢病毒介导的针对COX-2基因的干扰载体,以其感染舌鳞癌Tca8113细胞,沉默其COX-2表达;采用Western-blot方法检测正常细胞以及敲除目的基因细胞COX-2蛋白表达水平;运用MTT方法观察Tca8113细胞在COX-2基因沉默后对平阳霉素及顺铂敏感性的变化。结果:western-blot结果显示,感染慢病毒载体后的细胞COX-2蛋白表达显著下降;MTT结果显示,对相同浓度的平阳霉素和顺铂,COX-2基因沉默组细胞生长抑制率较对照组细胞高(P<0.05)。结论:运用慢病毒介导RNA干扰技术,成功建立稳定沉默COX-2的舌鳞癌细胞株,COX-2沉默后增强了Tca8113细胞对平阳霉素及顺铂的药物敏感性。     

三苯氧胺对人舌鳞癌细胞Tea8113的增殖抑制作用研究

目的：探讨三苯氧胺（Tamoxifen,TAM）对人舌鳞癌细胞系Tca8113的增殖抑制作用。方法：不同浓度TAM处理体外培养的人舌鳞癌细胞Tca8113,MTT法检测细胞增殖,倒置显微镜下观察细胞形态学变化。结果：在浓度为1、2、5、10μmol／L时,TAM呈现出剂量依赖性抑制人舌鳞癌细胞Tea8113的增殖作用。通过对三个不同浓度（2μmol／L、5μmol／L、10μmol／L）TAM实验组的抑制率进行比较,差异有统计学意义（P〈0．05）,细胞抑制率与药物浓度呈正相关。细胞超微结构显示,药物浓度与细胞结构呈剂量依赖关系。结论：TAM可显著抑制人舌鳞癌细胞Tea8113的增殖,其作用呈剂量依赖关系。     

平阳霉素-活性炭纳米微粒对口腔鳞癌细胞系Tca8113和BcaCD885细胞体外的杀伤作用

目的探讨平阳霉素-活性炭纳米微粒（PYM-CH-NP）对人舌鳞癌细胞系Tca8113和颊鳞癌细胞系Bca-CD885的药物敏感性。方法采用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测不同剂量的PYM-CH-NP和平阳霉素（PYM）在7个时间点（1～7 d）对Tca8113和BcaCD885的杀伤效应,计算各时间点2种剂型的半数抑癌率浓度值（IC50）、抑癌率和药物抗肿瘤作用强度的相对值（RAA）,选择药物作用后第5天观察量效关系。结果PYM-CH-NP和PYM对Tca8113和BcaCD885均有较强的抑癌作用,其抗癌效应与药物浓度和作用时间相关。结论改型后的PYM-CH-NP保留了PYM的抗癌活性,且具有缓释性,作用于肿瘤时可以维持周围有效的浓度和作用时间,有效地杀伤肿瘤细胞。     

重组人乳铁蛋白对口腔癌细胞周期及周期因子表达影响的实验研究

目的：探讨重组人乳铁蛋白（Recombinate human lactoferrin,rhLF）对口腔癌Tea8113细胞周期及周期调控因子cyclinD1、p19和p27基因表达的影响。方法：分别采用流式细胞仪和RT—PCR方法分析细胞周期及周期调控因子cyclinD1,p19和p27的mRNA水平。结果：50μg／mL、100gg／mLrhLF作用Tca8113细胞后,细胞增殖减慢,G0／G1期细胞明显增多,与对照组相比差异具有统计学意义（P〈0．05）;Tca8113细胞的cyclinDlmRNA表达下降显著,50μg／mL和25μg／mL rhLF实验组与对照组相比差异具有统计学意义（P〈0．05）;p19和p27mRNA表达水平的变化不明显。结论：rhLF通过下调口腔癌细胞周期蛋白cyclinD1的表达来调控周期阻滞,为乳铁蛋白用于肿瘤的预防及治疗提供实验基础。     

替尼泊苷诱导Tca8113细胞凋亡及细胞周期阻滞的实验观察

目的：检测替尼泊苷(teniposide，VM-26)的体外抗肿瘤增殖效果并探索其作用机制。方法：以不同浓度的VM-26体外作用Tca8113细胞，应用MTT方法、流式细胞仪、透射电镜和荧光染色等分别检测细胞的生长抑制率、凋亡率及细胞周期分布。使用SAS6．12软件进行单因素方差分析。结果：VM-26和CDDP对Tca8113细胞的半数抑制浓度分别为0．35μg／ml和1．1μg／ml。透射电镜观察细胞形态发生典型的凋亡表现，5.0μg/ml和0．15μg／ml的VM-26作用72h，细胞凋亡率分别为81．01％和17．38％，而细胞周期则分别被阻滞在S期和G2／M期。结论：VM-26可以显著诱导口腔鳞癌细胞凋亡并抑制细胞生长，不同剂量的VM-26对口腔鳞癌细胞周期阻滞的阶段不同。     

Tca8113细胞系耐药性的实验研究

目的：建立耐顺铂（CDDP）人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113/CDDP,对其耐药特性进行研究,方法：应用间歇性加药,逐步递增剂量,体外连续透导培养方法,获得Tca8113耐药细胞,采用MTT法,琼脂糖凝胶电泳和免疫组化法对细胞增增时间、裸鼠成瘤性、化疗药敏感性,P-gp和GST－π蛋白表达进行研究。结果：初步建成耐CCDP的人舌鳞癌细胞系（Tca8113／CDDP）,其耐CDDP浓度为10μmol/L。该细胞同时对卫猛（Vm-26)、博来霉素（BLM）、长春地辛、（VDS）、表阿霉素（E－ADM）、泰素（Taxol)等化疗药物产生交叉耐药。连续传代1月后,倍增时间从29．9h降至16．7h,具有裸鼠成瘤性,瘤体倍增加速。CDDP作用Tca8113细胞后,电泳显示有凋亡细胞特有的“梯状”条带,耐药细胞Tca8113／CDDP则无。P－gp（P－糖蛋白）及GST－π表达量升高,表明MDR－1mRNA表达水平增高,结论：CDDP能致Tca8113细胞耐药性。Tca8113／CDDP细胞系具有多药耐药特性,GSH／GST解毒系统可能与Tca8113／CDDP耐药性的产生。     

核因子-κB传导通路与舌癌细胞平阳霉素化疗敏感性的关系

的 探讨核因子-κB（NF-κB）/p65信号传导通路与Tca8113细胞平阳霉素化疗敏感性的关系。方法 以脂质体为载体，转染2 mg/L的p65反义寡核苷酸于Tca8113细胞 后，8 mg/L的平阳霉素处理细胞，3 h、6 h后免疫组化、Western blot法检测细胞核内p65形态和含量变化，48 h后MTT法检测细胞抑制率。结果 平阳霉素能激活细胞内的NF-κB/p65信号传导通路，而p65反义寡核苷酸转染能明显抑制该信号通路，在6 h时胞核内p65含量显著减少（P<0.05），48 h时细胞抑制率明显提高（P<0.05）。结论 抑制NF-κB/p65信号传导通路能够提高Tca8113细胞平阳霉素化疗敏感性。     

银杏酸对口腔鳞癌多药耐药的影响

目的以卡铂（CBP）和平阳霉素（PYM）为诱导物,构建耐药细胞株Tca8113/CBP和Tca8113/PYM,再通过银杏酸（GAs）与化疗药物联用探讨银杏酸对耐药细胞多药耐药（MDR）的影响。方法免疫组织化学检测P-糖蛋白（P-gp）的表达,MTT法确定耐药细胞的耐药指数;不同质量浓度的GAs作用于耐药细胞及亲本细胞,通过MTT法检测对它们的增殖抑制效应,确定GAs的无细胞毒性质量浓度并观察GAs对耐药细胞的逆转作用;GAs与耐药细胞联用诱导细胞一段时间后,再次通过MTT法检测其耐药指数。结果免疫组织化学结果显示,耐药细胞的P-gp阳性表达率明显高于亲本细胞,MTT法确定GAs的无细胞毒性质量浓度为10 μg·mL-1;GAs对Tca8113/CBP和Tca8113/PYM细胞的逆转倍数分别是2.94和2.43,与GAs联用前Tca8113/CBP和Tca8113/PYM细胞的耐药指数分别是3.24和11.9,联用后的耐药指数分别是2.18和4.43。结论本实验成功诱导出了耐药细胞株Tca8113/CBP和Tca8113/PYM,并将银杏酸与化疗药物联用,进一步证实了两者的共用能够增强对Tca8113/CBP和Tca8113/PYM细胞的增殖抑制作用,无细胞毒质量浓度的GAs对Tca8113/CBP和Tca8113/PYM细胞的耐药性有部分逆转作用,且共用一段时间后耐药细胞的MDR水平有所下降。     

siRNA干扰MDR1逆转口腔舌癌耐药性表型的实验研究

目的：探讨MDR1siRNA对人舌癌耐药细胞株TCA8113多药耐药性的影响。方法：以人舌癌耐药细胞株TCA8113/DDP为靶细胞,将针对MDR1基因合成,并已鉴定和测序后的siRNA分子利用脂质体介导转染TCA8113/DDP细胞,采用G418筛选克隆细胞,RT-PCR检测MDR1基因mRNA表达,免疫组织化学法测定P-糖蛋白（P-gp）表达;MTT比色法检测TCA8113/DDP细胞对顺铂（DDP）、卡铂（CBP）、平阳霉素（PYM）的敏感性。结果：经转染成功的阳性克隆细胞TCA8113/DDP的MDR1mRNA和P-gp的表达均被抑制。TCA8113人舌癌耐药细胞顺铂（DDP）、卡铂（CBP）、平阳霉素（PYM）的IC50分别降至3.43μmol/L,1.72μmol/L和1.05μmol/L（P〈0.01）。结论：稳定转染含编码MDR1siRNA的质粒载体能特异性地阻抑人舌癌多药耐药细胞TCA8113细胞MDR1基因的表达,逆转其对抗癌药物的耐受性。     

体外诱导Tca8113细胞产生耐药性的分析

目的探讨Tca8113细胞长期接触卡铂以后耐药性表达情况。方法以Tca8113细胞系为研究对象，采用间歇性加药，逐步递增剂量，体外连续培养诱导其产生耐药性。用MTT法检测细胞耐药指数，LsAB免疫组化法检测耐药蛋白P糖蛋白- 170（Pgp- 170）、谷胱苷肽S转移酶- π（GST- π）、多药抗药性相关蛋白（MRP）和拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）的表达，RT- PCR检测多药耐药基因（MDR）、MRP和GST- π的表达。结果诱导后Tca8113/卡铂（CBP）对氨甲喋呤（MTX）、CBP、平阳霉素（PYM）、长春新碱（VCR）的抗药性明显升高，但对5- 氟尿嘧啶（5- FU）抗药性增加不明显。在免疫组化和RT- PCR中Pgp- 170、MRP和GST- π表达升高，TopoⅡ表达降低。结论Tca8113细胞系在卡铂长期刺激的环境中多种耐药相关蛋白表达上升，表明肿瘤细胞的耐药现象受到多种基因的调节。Tca8113/CBP可以作为一个肿瘤耐药研究的平台。     

RNA干扰双泛素对舌鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响

目的 应用RNA干扰技术抑制人舌鳞状细胞癌细胞株Tca8113中双泛素(diubiquitin)的表达,探讨双泛素表达下调对舌鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响.方法 构建针对双泛素特异性小干扰RNA( small interfering RNA,siRNA)真核表达载体pU-双泛素-siRNA,将其转染至Tca8113细胞,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法检测转染后的Tca8113细胞中双泛素的表达.通过流式细胞仪分析siRNA对舌鳞状细胞癌细胞周期的影响,并通过细胞侵袭能力实验观察siRNA对Tca8113细胞恶性生物学行为的变化.结果 siRNA干扰Tca8113细胞后,双泛素的表达无论是在mRNA水平还是在蛋白质水平均显著下降[mRNA:实验组(0.36±0.03)、空白对照组(0.92±0.07)、空载体组(0.95±0.05);蛋白:实验组(0.39±0.04)、空白对照组(0.64±0.05)、空载体组(0.69±0.05)](P＜0.05),细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降(P＜0.05).结论 通过RNAi技术阻断双泛素的表达,可抑制Tca8113细胞的生长、增殖、侵袭,提示双泛素在舌鳞状细胞癌的发生、发展过程中起重要作用.     

神经钙黏素表达下调对舌鳞状细胞癌细胞生物学能力的影响

目的 研究神经钙黏素(N-cadherin)表达下调对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、细胞周期、凋亡以及迁移的影响,并探讨其可能的分子机制.方法 利用LipofectamineTM2000将神经钙黏素siRNA转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,将细胞分为3组:①未处理组;②对照siRNA组;③神经钙黏素siRNA组.分别收集转染后48 h的细胞,采用新型的细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK)8试剂分析转染神经钙黏素siRNA后对细胞增殖能力的影响;运用流式细胞术检测下调神经钙黏素表达对Tca8113细胞周期及细胞凋亡的影响;采用Boyden 小室实验分析下调神经钙黏素对舌鳞状细胞癌细胞Tca8113细胞迁移能力的影响;进一步采用蛋白质印迹法检测神经钙黏素表达下调对细胞增殖、细胞周期以及细胞迁移相关基因表达的影响.结果 神经钙黏素siRNA能明显下调舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中神经钙黏素蛋白的表达,并显著抑制Tca8113细胞的增殖(P<0.05).细胞周期结果显示,神经钙黏素siRNA组中在G0/G1的细胞比率[(65.41±0.92)%]明显高于未处理组[(41.59±1.43)%]和对照siRNA组[(43.70±2.08)%],差异有统计学意义(F=216.839,P＝0.000).神经钙黏素siRNA组中细胞凋亡的比率[(25.66±1.36)%]明显高于未处理组[(2.38±0.14)%]和对照siRNA组[(2.81±0.12)%],差异有统计学意义(F=850.364,P=0.000).Boyden 小室体外侵袭实验结果表明,与未处理组和对照siRNA组相比,神经钙黏素siRNA组中Tca8113细胞的迁移能力显著下降,差异有统计学意义(F=140.858,P=0.000).蛋白质印迹法结果表明,与未处理组和对照siRNA组相比,神经钙黏素siRNA组中的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)2和MMP-9明显下调,而p21明显上调,且差异有统计学意义(P<0.05).结论 神经钙黏素在舌鳞状细胞癌的发生发展中可能具有重要的作用.

Abstract：

Objective To investigate the effect of downregulation of N-cadherin expression on cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis and cell migration in tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 cells. Methods N-cadherin siRNA was transfected into tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 cells and Tca8113 cells were divided into three groups: untreated group, control siRNA group and N-cadherin siRNA group. The cells were harvested 48 h after transfection with N-cadherin siRNA. Cell proliferation of Tca8113 cells was examined by cell counting kit(CCK)-8 after transfection with N-cadherin, and the effects of downregulation of N-cadherin on cell cycle and cell apoptosis of Tca8113 cells were investigated by flow cytometry.The effect of downregulation of N-cadherin expression on cell migration of Tca8113 cells was observed by Boyden chamber experiment, and further expression changes of gene-related cell proliferation, cell cycle and cell migration were detected by Western blotting. Results N-cadherin siRNA downregulated the N-cadherin expression and significantly inhibited cell proliferation of Tca8113 cells (P<0.05). The results of cell cycle revealed that the percentage of G0/G1 phase in N-cadherin group [(65.41±0.92) %] was significantly higher than that in untreated group [(41.59±1.43)%] or control siRNA group [(43.70±2.08)%], and there was significant difference among the three groups (F=216.839,P＝0.000).The percentage of cell apoptosis in N-cadherin group [(25.66±1.36)%] was significantly higher than that in untreated group [(2.38±0.14)%] or control siRNA group [(2.81±0.12)%], and there was significant difference among the three groups (F=850.364,P=0.000). The cell number migrated into memebrane in N-cadherin group was significantly lower than that in untreated group and control siRNA group, and there was significant difference among the three groups (F=140.858,P=0.000). Further, compared with untreated group and control siRNA group, the expressions of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 proteins were significantly downregulated and expression of p21 protein was significantly upregulated (P<0.05). Conclusions N-cadherin may play a role in occurrence and development of tongue squamous cell carcinoma.     

平阳霉素抑制舌鳞癌细胞系的量效和时效关系及可能的抗癌机制

目的:探讨平阳霉素体外抑制口腔鳞癌细胞系的量效和时效关系及可能的抗癌机制。方法:用不同浓度的平阳霉素培养人舌鳞癌细胞系Tca8113不同时间,以MTT法和荧光显微镜观察细胞增殖抑制情况,流式细胞术分析细胞凋亡率。结果:MTT法和荧光观察显示:不同浓度平阳霉素组间细胞生长抑制率有显著差异(P<0.05),浓度越高,抗增殖效应越明显;随药物作用时间延长,肿瘤细胞生长受抑制递增(P<0.05)。流式细胞术显示:凋亡率随药物浓度增加而增加,但与作用时间长短无关。低浓度药物无法诱导细胞凋亡。结论:平阳霉素在体外能明显抑制人舌鳞癌细胞系Tca8113生长,并具有浓度和时间依赖性。其抗癌机制可能包括细胞毒作用和启动程序化死亡信号等。     

二氢卟吩e6光动力学疗法对人舌鳞癌细胞株Tca8113的杀伤作用

目的：探讨二氢卟吩e6 （Ce6）光动力学疗法（Ce6-PDT）对体外培养人舌鳞癌Tca8113细胞的杀伤作用.方法：向体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞中加入Ce6,浓度分别为5、10、20、50和100μg/ml,孵育1.5h,予波长630nm半导体激光照射,照射的功率密度为100mW/cm2,能量密度分别为0.5、1、2、5、10和15J/cm2,继续孵育6h,用MTS比色法测定细胞存活率.结果：（1）不受光照的条件下,较低浓度Ce6（＜10μg/ml）与细胞共同培养而对细胞的毒性较小,Ce6浓度为20μg/ml时对细胞的杀伤率约为10％.（2）光照条件下,Ce6-PDT能有效地杀伤体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞,其杀伤作用与Ce6浓度及光照剂量正相关,呈浓度/剂量依赖性（P＜0.01）.结论：Ce62PDT能有效地杀伤体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞;Ce6在较大浓度下对细胞有毒性.     

EGCG对舌鳞癌Tca8113细胞增殖与凋亡的实验研究

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用。方法:采用CCK-8法检测不同浓度的EGCG(0、10、20、40、80mg/L)对Tca8113细胞的体外增殖抑制作用;采用流式细胞术及DAPI荧光染色法检测EGCG对Tca8113细胞凋亡的影响。结果:CCK-8法检测显示EGCG对Tca8113细胞有明显增殖抑制作用并呈现时间及浓度依赖性(P<0.01);流式细胞仪结果显示,经10mg/L EGCG处理的Tca8113细胞凋亡率还不能认为与对照组有区别,其余EGCG处理组细胞凋亡率均高于对照组并呈现时间及浓度依赖性(P<0.01);DAPI染色在免疫荧光显微镜下可见典型的细胞核皱缩及凋亡小体等。结论:EGCG对Tca8113细胞具有明显的增殖抑制及诱导凋亡作用,且呈现时间及浓度依赖性。     

平阳霉素磁控缓释微球体内外抗肿瘤作用的实验研究

观察了自制的平阳霉素磁性明胶微球对人舌癌Ｔｃａ８１１３细胞株的体外杀伤作用及对人舌癌裸鼠移植瘤的治疗效果，结果表明，平阳霉素磁性明胶微球才游离平阳霉素均具有杀伤肿瘤细胞的作用，二者之间无显著性差异（Ｐ〉０．０５），体内实验中，平阳霉素磁明胶微球对人舌癌移植有明显的抑制作用，抑瘤率为８５．３３％，明显高于游离平阳霉素（３５．９％），而对正常组织中的毒副作用明显减轻。     

苯丁酸钠对人舌鳞状细胞癌细胞凋亡影响机制的探讨

目的 探讨苯丁酸钠对人舌鳞状细胞癌Tca8113和TCSSA细胞株的生长、凋亡的影响及其分子机制,为临床治疗提供理论依据.方法 应用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测苯丁酸钠对人舌鳞状细胞癌细胞株的抑制作用,采用流式细胞仪研究苯丁酸钠对人舌鳞状细胞癌细胞株的细胞周期阻滞和诱导凋亡作用,应用蛋白质印迹法和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测p21和生存素基因的转录和表达.结果 苯丁酸钠对两种细胞株增殖均有明显的抑制作用;流式细胞仪检测显示苯丁酸钠诱导细胞株G1期阻滞,碘化丙啶-异硫氰酸荧光素标记的磷脂酰结合蛋白双标结果表明,苯丁酸钠能诱导细胞株凋亡,使p21的mRNA及蛋白质表达升高,与对照组比较,Tca8113细胞株的p21 mRNA及蛋白质分别增加0.09±0.08和0.72±0.10,TCSSA细胞株的p21mRNA及蛋白质分别增加1.34 4±0.12和1.56±0.09(P<0.05).生存索的mRNA及蛋白质表达下降.与对照组比较,Tca8113细胞株的生存素mRNA及蛋白质分别降低1.10±0.05和1.14±1.10,TCSSA细胞株的生存素mRNA及蛋白质分别降低1.02±0.08和0.94±0.09(P<0.05).苯丁酸钠诱导p21表达上升和生存素表达下降,二者的mRNA水平变化呈显著负相关(rs=-0.532,P<0.001),蛋白表达变化同样呈显著负相关(rs=-0.564,P<0.001).结论 苯丁酸钠能抑制人舌鳞状细胞癌细胞株增殖,诱导细胞G1期阻滞和细胞凋亡.