三维培养牙髓间充质细胞外泌体微小RNA表达谱分析

目的分析并比较二维(2D)与三维(3D)培养条件下人牙髓间充质细胞(DPSCs)外泌体(Exo)微小RNA (miRNA)的表达谱。方法2D与3D条件下分别培养DPSCs,提取细胞Exo,采用透射电子显微镜、蛋白质免疫印迹及纳米颗粒追踪分析等方法观察并鉴定;通过高通量测序筛选差异表达miRNA,采用Dr.Tom系统及TargetScan网站进行生物信息学分析及组织再生修复相关靶基因预测。结果 3D培养下收集的DPSC-Exo均呈现"茶托样"双层膜结构,CD63和CD9表达阳性,粒径分布符合外泌体特征,与2D培养的DPSC-Exo一致。高通量测序共计检测外泌体来源miRNA 253个,其中3D组表达222个,特有表达99个;与2D组相比,表达显著差异60个[︱log₂(3D/2D)︱≥1,Qvalue≤0.001]。差异miRNA主要参与的生物学过程与分子功能分别为细胞过程和结合;京都基因与基因组数据库(KEGG)通路富集分析显示在代谢通路有显著富集。miR-302的候选靶基因有成纤维细胞生长因子(FGF) 19和表皮生长因子受体等;miR-24-3p可能靶向神经元分化因子2、神经上皮细胞转化因子1、神经元分化因子1、神经元再生相关蛋白、FGF11、FGF结合蛋白3、FGF受体3、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)β多肽、PDGFRα多肽、血管生成素、胰岛素样生长因子结合蛋白5等,以发挥组织再生修复功能。结论相比2D培养,3D培养能调节DPSC-Exo部分miRNA表达量,上调一些与再生修复相关的miRNA,3D培养可考虑作为调节外泌体应用潜能的一种手段。     

基于转录组RNA测序分析牙髓炎中的核心基因

目的:筛选炎症牙髓与健康牙髓的差异表达基因.方法:对5例炎症牙髓样本和6例健康牙髓样本进行转录组RNA测序,筛选差异表达基因,进行生物信息学分析.结果:一共筛选出1216个差异表达基因,包括831个上调基因和385个下调基因.GO分析结果显示,差异基因主要富集于炎症反应、免疫反应和细胞粘附等功能;KEGG通路分析表明,差异基因主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、破骨细胞分化等炎症相关通路.基因集富集分析结果也富集于炎症反应通路、TNF-α信号通路以及IL6/JAK/STAT3信号通路.根据PPI网络中的节点连通度,共筛选出10个与牙髓炎相关的核心基因:PTPRC、ITGAM、CD86、IL10、TLR4、ITGB2、TYROBP、SPI1、LCP2、TLR2.结论:炎症牙髓与健康牙髓在整体基因表达上存在较显著的差异,差异表达基因大多富集于炎症和免疫反应的功能及信号通路,相关基因具有作为牙髓炎诊断生物标志物的潜在价值.     

应用RNA-Seq技术筛选唾液腺腺样囊性癌嗜神经侵袭相关差异表达基因

目的: 应用RNA-Seq技术分析与施万细胞共培养前、后的唾液腺腺样囊性癌细胞（SACC）的基因表达水平变化,明确嗜神经侵袭（perineural invasion,PNI）相关基因。 方法: 采用腺样囊性癌与SD大鼠施万细胞共培养模型,分析共培养前、后SACC细胞基因表达变化,对差异表达基因进行聚类分析、GO功能富集分析、KEGG通路富集分析,并采用qRT-PCR对其中6个关键差异表达基因进行验证。采用edgeR软件（3.12.1）进行表达差异显著性分析,将P≤0.05、差异表达倍数的绝对值大于1作为差异显著性标准。 结果: 在腺样囊性癌单独培养组与共培养组之间发现395个差异表达基因（P≤0.05,|logFC|≥1.0）,其中135个基因上调（34.2%）,260个基因下调（65.8%）。GO功能富集分析结果表明,这些PNI相关差异表达基因参与了血管再生、细胞外基质的组成、细胞增殖、凋亡和上皮形态发生;KEGG通路富集分析结果表明,这些基因参与组氨酸代谢、肿瘤坏死因子、趋化因子等细胞因子受体相互作用等重要生物学通路。利用qRT-PCR技术对其中6个关键基因进行验证,验证结果与RNA-Seq趋势一致。 结论: 得到了SACC嗜神经侵袭PNI的相关差异基因,为阐明SACC的嗜神经侵袭机制提供了实验依据。     

口腔扁平苔藓差异表达MicroRNAs的筛选

目的:芯片筛选口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)损害黏膜中差异表达的miRNAs。方法:收集白纹型OLP损害黏膜和正常口腔黏膜各2例,抽提总RNA预扩增后运用Taqman低密度芯片(v2.0)测定人类667种miRNAs的表达谱,随后应用实时定量PCR在68例样本中进一步验证miR-27b的表达水平。采用miRNAs生物信息库预测miR-27b所对应的靶基因,对芯片数据进行统计学分析。结果:筛选获得30个OLP相关的miRNAs。相对于正常口腔黏膜,OLP损害黏膜中有18个miRNAs表达下调,12个上调。扩大样本量至68例验证miR-27b表达水平,结果与芯片实验一致。生物信息学分析得出miR-27b的预测靶基因中有10个与OLP发病有关。结论:筛选得到的OLP损害黏膜中差异表达的miRNAs可能与OLP的发生相关。     

牙周膜干细胞来源外泌体的生物学特性分析

目的 采用超速离心,分离牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）来源的外泌体,检测其生物学特性。方法 采用有限稀释法,体外分离、培养人PDLSCs。收集PDLSCs培养上清,采用梯度离心法分离、纯化外泌体。对PDLSCs来源的外泌体进行检测,透射电镜下观察外泌体形态;蛋白质印迹法检测外泌体表面标志CD9、CD63、CD81和TSG101的表达;纳米颗粒跟踪分析（nanosight tracing analysis,NTA）检测PDLSCs来源外泌体的产量及其粒径分布特征。结果 成功分离出PDLSCs来源的外泌体。透射电镜下可见,外泌体为碟形或椭圆形膜性结构,中央电子密度较低。免疫印迹结果显示,分离得到的囊泡表达外泌体特异性标志物CD9、CD63、CD81和TSG101。NTA显示,PDLSCs来源的外泌体浓度为（3.80±0.39）×10⁸颗粒/mL,粒径分布峰值在（119±12.1）nm。结论 采用梯度超速离心法可以得到PDLSCs来源的外泌体,其具有特征性的外泌体膜蛋白成分和形态特征。     

PD-L1、PD-L2 mRNA在OLP组织中的表达研究

目的:研究PD-L1和PD-L2 mRNA在OLP损害组织中的表达.方法:采用Real-time PCR方法,检测PD-L1和PD-L2 mRNA在20例OLP不伴异常增生、10例OLP伴轻度异常增生损害组织中的表达水平,并以10例健康人正常黏膜为对照.结果:PD-L1 mRNA在不伴异常增生组、伴轻度异常增生组的表达水平分别较正常对照组上调1.3倍、1.7倍,但3组之间均无显著性差异(p＞0.05).PD-L2 mRNA在不伴异常增生组的表达水平较正常对照组上调3.0倍,两者之间有显著性差异(p＜0.01);OLP伴轻度异常增生组的表达水平较正常对照组上调3.2倍,两者之间有显著性差异(p＜0.01);OLP不伴异常增生组与伴轻度异常增生组之间无显著性差异(p＞0.05).结论:PD-L2可能在OLP的发病机制中起重要作用,而PD-L1可能并未参与OLP的发病.     

口腔黏膜下纤维性变发病相关基因的功能分析

目的：应用cDNA芯片技术研究口腔黏膜下纤维性变（oral submucous fibrosis,OSF）颊黏膜上皮组织和正常口腔颊黏膜组织基因的差异表达,并对差异表达基因进行gene ontology（GO）分析,为探讨OSF发病相关基因提供初步筛选资料。方法：对切取OSF和正常对照颊黏膜组织进行总RNA抽提,逆转录制备探针,纯化后与含有21571条基因的人类全基因组寡核苷酸芯片杂交,杂交后信号经扫描仪检测和计算机分析筛选OSF发病相关差异表达基因,并进行GO分析。结果：GO分析发现,2372条差异表达基因涉及细胞组成的基因群主要集中于细胞外基质和细胞骨架,与溶酶体囊胞、细胞小凹等蛋白相关基因多呈上调表达。结论：细胞外基质、细胞骨架、溶酶体囊胞、细胞小凹等蛋白相关基因群差异表达可能与OSF发病有关。     

羟氯喹治疗口腔扁平苔藓前后的唾液双向电泳研究

目的：比较口腔扁平苔藓（OLP）经羟氯喹治疗后,唾液中差异表达的蛋白质,探讨羟氯喹治疗OLP的可能作用机制。方法：采用固相pH梯度（immobilized pH gradient,IPG）双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）分离OLP经羟氯喹治疗三个月后唾液中的差异蛋白质,银染显色,Imagemaster图像分析软件分析差异蛋白质点。结果：①羟氯喹治疗OLP前和治疗后的唾液2-DE图谱的平均蛋白质点数分别为1894±183个和1920±341个,凝胶图谱分辨率、重复性较好;②通过Imagemaster图像分析比较治疗前后的唾液2-DE图谱,差异表达的蛋白质点数为21个,其中6个点在治疗3个月后高表达,15个点在治疗后低表达。结论：本研究建立了分辨率高且重复性较好的OLP治疗前后的唾液双向凝胶电泳图谱,发现存在差异表达的蛋白质,为进一步研究羟氯喹治疗OLP的作用机制奠定了基础。     

口腔扁平苔藓组织环状RNA表达谱的筛选与初步探讨

目的: 构建人口腔扁平苔藓（oral lichen planus,OLP）组织的环状RNA(circular RNA, circRNA)表达谱,筛选并验证口腔扁平苔藓组织中异常表达的circRNA,为疾病的诊断和治疗提供理论基础。方法: 选择2018年9月—12月就诊于上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔黏膜病科的口腔扁平苔藓初诊患者6例,同期健康志愿者6例,利用高通量测序技术对口腔扁平苔藓和正常口腔黏膜组织中RNA进行测序和鉴定分析,分析组间circRNA的表达差异,然后利用qRT-PCR对分析结果进行验证。采用 SPSS 24.0 软件包对数据进行统计学分析,最后应用生物信息学技术GO（Gene Ontology）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析差异基因的功能及相关通路。结果: 测序结果显示,与健康口腔黏膜组织相比,在口腔扁平苔藓组织中共检测出85种差异表达2倍以上的circRNA,其中66种高表达,19种低表达。分别取上调、下调最显著的3个circRNA,在更多样本中进行qRT-PCR验证,其结果与测序结果一致。结论: 口腔扁平苔藓组织与正常口腔黏膜组织之间存在差异表达的circRNAs,这些circRNAs可能参与口腔扁平苔藓的致病调控,是潜在的疾病新型诊断和治疗的生物学标志物。     

扁平苔藓患者血清及唾液中IL-1O的表达及相关性研究

目的：探讨口腔扁平苔藓（OLP）患者唾液及血清中白细胞介素-10 （IL-10）的表达情况及其相关性,以进一步了解OLP患者唾液代替血液作为生物学样本来研究OLP中IL-10的可行性.方法：实验分3组：OLP糜烂组15例,OLP非糜烂组15例,正常对照组15例.采用ELISA法分别检测3组对象血清和唾液中IL-10的含量,对结果进行统计分析.结果：OLP糜烂组血清中IL-10水平为（30.11±3.02） pg/mL,明显高于非糜烂组（19.03±3.33） pg/mL和正常对照组（16.43±2.19） pg/mL,差异有统计学意义（P ＜0.05）;OLP糜烂组唾液中IL-10平均水平为（10.05 ±3.12） pg/mL明显高于非糜烂组（5.50±1.1） pg/mL和正常对照组（4.47±1.7） pg/mL,差异有统计学意义（P＜0.05）;两实验组血清和唾液中IL-10水平成正相关,（r=0.731,P＜0.01）.结论：实验组血清和唾液中IL-10水平高度相关,可以通过检查唾液替代检查血液来研究OLP中IL-10的水平.     

Differential Expression of Long Noncoding RNAs in Normal and Inflamed Human Dental Pulp

Introduction

Dental pulp inflammation is an excellent model for the interaction between tissue inflammation and regenerative processes. It is worthwhile to better understand molecular signaling of repair and regeneration in inflammatory processes. Emerging evidence suggests that long noncoding RNA (lncRNA) participates in immune system inflammatory processes. Here we investigate the expression of lncRNAs in pulpitis, the inflammation of dental pulp tissue, and identify lncRNAs that possibly participate in inflammation responses and odontogenesis.

大鼠正畸牙移动中NF-κB通路相关差异基因的GO分析

目的:利用基因表达谱芯片对正畸加力组与正常大鼠牙齿牙周组织的基因表达谱进行对比分析,筛选差异基因并进行GO分析。方法:将6只SD大鼠随机分为加力组和对照组,加力组建立大鼠正畸牙齿移动模型。根据预实验结果,分别在0 h、12 h处死大鼠,并截取上颌第一磨牙及外周约1 mm的牙周组织,提取总RNA,进行全基因组表达谱芯片检测,对差异表达基因进行GO分析,并运用RT-qPCR对芯片结果进行验证。结果:芯片结果显示,共筛选到463条差异基因,其中实验组与对照组相比250个基因表达上调,213个基因表达下调,在差异基因中涉及到NF-κB信号通路的基因有8个,均表达上调。GO分析涉及到1189个不同的功能分类。结论:正畸加力12h后牙齿牙周组织中与炎症反应相关的基因和与中性粒细胞趋化相关的基因表达上调。     

口腔扁平苔藓基因表达谱中差异表达基因初步探讨

目的筛选口腔扁平苔藓组织中的差异表达基因,并对其进行功能分类。方法用4 000种人类基因多聚酶链反应产物制成BiostarH- 40s型表达谱芯片,分离纯化正常口腔黏膜组织和口腔扁平苔藓病变组织mRNA,制备表达谱探针,用ScanArray 4000 荧光扫描仪扫描芯片荧光信号图像,分析正常口腔黏膜组织和口腔扁平苔藓组织之间差异表达的基因。结果1）在4 000条基因中,有213条基因表达差异,其中122条基因表达上调,91条基因表达下调。2）在表达上调基因中,功能分类主要包括免疫相关基因、代谢相关基因、癌基因、细胞因子、细胞信号和传递蛋白。3）在表达下调基因中,功能分类主要包括DNA结合、转录和转录因子、细胞信号和传递蛋白、免疫相关基因、细胞因子、代谢相关基因。结论口腔扁平苔藓的发生、发展过程中存在着多条不同功能基因表达调控的改变。     

口腔鳞状细胞癌组织中差异微小RNA/mRNA表达谱的对接研究

目的 构建分析口腔鳞状细胞癌（OSCC）中差异表达的微小RNA（miRNA）和mRNA表达谱,初步预测与OSCC发生和发展相关的 miRNA和mRNA。方法 运用高通量深度测序技术构建 miRNA和mRNA表达谱,通过 Gene Ontology功能显著性富集分析预测与OSCC细胞周期、增殖、分化和凋亡相关的miRNA和mRNA。结果 共发现77个miRNA和1 298个mRNA显著性差异表达,富集分析显示与OSCC细胞周期、增殖、分化和凋亡相关的 miRNA共73个,且一个 miRNA可调控多个 mRNA。结论 OSCC中差异表达的 miRNA和mRNA对OSCC的发生和发展有潜在的作用。     

口腔鳞状细胞癌预后相关基因标志物的分析

［摘要］ 目的 通过生物信息分析途径对口腔鳞状细胞癌患者与正常人群的差异基因进行分析,从分子水平探讨关键基因以及参与的信号通路,初步探索口腔鳞状细胞癌发生、发展的基因标志物。方法 从公共数据库基因表达数据库（GEO）中下载口腔鳞状细胞癌的相关芯片数据（GSE3524和GSE6631）,筛选出口腔鳞状细胞癌组织和对照组织表达有显著差异的基因。并对其功能及预后进行分析。结果 共筛选出129个差异表达基因,其中表达上调45个,下调84个,对其进行基因本体、京都基因与基因组百科全书和蛋白互作网络分析,发现分泌型焦磷酸蛋白（secreted phosphoprotein 1, SPP1）、金属基质蛋白酶（matrix metalloproteinase 1,MMP1）、丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin family E member 1,SERPINE1）、纤溶酶原激活剂（plasminogen activator urokinase,PLAU）处于基因核心节点位置。同时,根据这些关键基因表达水平的高低对口腔鳞状细胞癌患者进行分组,高表达组患者生存时间均低于低表达组,差异有统计学意义（PSPP1=0.045、PMMP1=0.046、PSERPINE1=0.0024和PPLAU=0.00049）。结论 基因组学分析方法筛选出的关键基因和信号通路有助于研究口腔鳞状细胞癌发生、发展的机制,也进一步为治疗靶点及预后分子标志物的选择提供了依据。     

前扣带回皮质层中牙移动疼痛相关蛋白质组学研究

目的研究正畸牙移动中前扣带回皮质层（ACC）的蛋白质组学表达,筛选牙移动疼痛相关的目标蛋白,探讨ACC在疼痛传导和形成中的作用。 方法30只雄性SD大鼠建立实验性牙移动模型后,根据行为学观测结果分组。实验组进行加力,对照组仅进行乙醚麻醉,24 h后进行行为学观测并取ACC组织,根据行为学观测结果选取4标样本进行蛋白质组学研究。ACC组织在提取蛋白并胰酶消化后,经串联质谱标记（TMT）试剂标记,进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测,并对差异表达蛋白进行生物信息学分析,进行基因本体（GO）注释,GO功能聚类分析,基因和基因组学京都百科全书（KEGG）代谢通路注释及功能聚类分析。 结果本实验共鉴定并定量3374种蛋白,其中表达上调蛋白12种、表达下调蛋白109种。GO注释和功能聚类分析中从生物过程、细胞组成、分子功能三个方面阐述了大鼠在实验性牙移动应力下发生的一系列应激反应及代谢调节。KEGG注释及功能聚类分析表明与炎症相关通路花生四烯酸通路及JAK-STAT信号通路表达下调,且差异具有统计学意义。花生四烯酸通路的前列腺素E合成酶（PGES）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）、环氧化物水解酶2（EPHX2）,JAK-STAT信号通路的信号转导和转录因子1（STAT1）、STAT2显著下调,可能与炎症性疼痛的发生、发展密切相关。 结论TMT技术是组织蛋白质组学研究的有效方法。ACC在牙移动疼痛形成和调节中发挥重要作用,其中花生四烯酸通路、JAK-STAT信号通路可能是牙移动疼痛的关键信号通路。本实验为进一步探讨牙移动疼痛关键蛋白提供了重要的实验依据。