应用牙周膜干细胞—牙囊干细胞复合细胞膜片同种异体移植修复比格犬牙周组织缺损的研究

目的 拟构建比格犬牙周缺损模型,观察牙周膜干细胞—牙囊干细胞复合细胞膜片修复牙周组织缺损的效果.方法 分离培养比格犬牙囊干细胞、牙周膜干细胞,制备牙囊干细胞细胞膜片、牙周膜干细胞细胞膜片以及以上2种细胞的复合细胞膜片,将膜片混合支架材料同种异体植入成年雄性健康比格犬牙周缺损模型,对照组只植入支架材料.分别于移植后1周、2周、4周、6周、8周、12周检测探诊深度、牙龈退缩、附着丧失情况.12周后观察分析牙周再生的组织形态学变化.结果 牙周临床检查及组织学形态学分析显示,3个膜片移植组牙周再生效果较对照组效果明显,其中复合细胞膜片移植组明显高于其余两个单一膜片移植组(P<0.05).结论 牙周膜干细胞—牙囊干细胞复合膜片同种异体移植更有利于修复比格犬牙周缺损.     

预培养比格犬干细胞的牙本质片复合牙周膜细胞膜片裸鼠体内移植研究

目的：探索预培养干细胞的牙本质片复合牙周膜细胞（PDLCs）膜片对牙周组织再生的可行性。方法：将比格犬牙根制成牙本质片,其上接种骨髓基质干细胞（BMSCs）或PDLCs,应用成骨诱导液或α-MEM培养液培养,电镜观察牙本质片表面细胞附着与基质形成情况。并构建细胞／牙片／膜片／煅烧陶瓷牛骨CBB复合体,裸鼠体内皮下移植,8周后取材HE染色观察。结果：预培养干细胞的牙本质片,电镜检测到表面有足够的细胞和细胞外基质分布。裸鼠体内结果显示牙本质片接种BMSCs或PDLCs经成骨诱导组可见类牙骨质基质形成,但无类牙周膜纤维,未经成骨诱导组无类牙骨质基质形成,但有明显的类牙周膜纤维样组织形成;空白组无类牙骨质基质及类牙周膜纤维样组织形成。结论：在牙本质片上预培养BMSCs或PDLCs,复合PDLC膜片和CBB后异位移植,有利于类牙周膜纤维的形成。加入成骨诱导液诱导,有利于基质的形成。     

人牙周韧带细胞膜片的体外实验研究

目的 观察体外培养人牙周韧带细胞(hPDLCs)的成骨、成脂能力;构建hPDLCs膜片并鉴定膜片细胞外基质的主要结构蛋白.方法 通过酶联组织块法分离并纯化培养hPDLCs;免疫细胞化学法鉴定hPDLCs来源及干细胞标志物STRO-1表达情况;取第2～4代细胞分别用成骨诱导培养基和成脂诱导培养基培养,茜素红及油红O染色检测hPDLCs的成骨、成脂能力;制备成熟的hPDLCs膜片,苏木素-伊红(HE)及免疫组织化学染色法鉴定膜片细胞外基质主要结构蛋白Ⅰ型胶原、层黏蛋白及纤连蛋白的表达情况.结果 经原代培养的hPDLCs抗波形蛋白染色阳性,干细胞标志物STRO-1染色阳性,证实hPDLCs来源于间充质并具有干细胞潜在分化能力;hPDLCs在诱导成骨、成脂分化培养14～16 d后,茜素红及油红O染色结果阳性提示hPDLCs具有良好的成骨及成脂分化能力;HE染色及免疫化学染色发现hPDLCs膜片高表达细胞外基质主要结构蛋白Ⅰ型胶原、层黏蛋白及纤连蛋白.结论 本研究从细胞分离培养,来源鉴定、多向分化潜能诱导及细胞膜片技术等方面证实PDLCs中存在成体干细胞,提示hPDLCs膜片能为牙周组织再生种子细胞提供新来源,可进一步深入研究.     

不同诱导环境对牙周膜干细胞膜片生物学特性的影响

目的:探讨不同诱导体系对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)膜片的构建以及生物学性能的影响。方法:分离培养大鼠发育期根端复合体(developing apical complex,DAC)细胞,隔天更换收集细胞培养液上清并过滤冻存(DAC条件培养液)。分离培养人PDLSCs,并扩增构建PDLSCs细胞膜片,利用DAC条件培养液和成骨诱导液分别诱导PDLSCs膜片5、10、15 d。通过倒置显微镜、HE染色、免疫组化、RT-PCR检测经过诱导的人PDLSCs细胞膜片形态学和功能学变化。结果:与成骨诱导相比,DAC诱导后膜片含有丰富短棒状细胞和大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM),细胞膜片ALP和periostin表达丰富,体外成骨基因表达更高。结论:与成骨诱导体系相比,DAC诱导体系更适合PDLSCs膜片的形成。     

兔骨髓间充质干细胞膜片特性及优势研究

目的:探讨兔骨髓间充质干细胞(rBMMSCs)膜片的基本生物学特性及其在组织工程应用中的优势. 方法:从日本大耳白兔提取原代骨髓培养rBMMSCs,采用简单制备方法构建rBMMSCs细胞膜片,大体、HE染色观察, MTT、成骨成脂诱导检测膜片增殖分化能力,RT-PCR检测膜片相关优势基因的表达情况. 结果:成功分离rBMMSCs,诱导10-14d后获得白色膜状细胞膜片,并可用无菌眼科镊提拉. 镜下观察细胞呈梭形重叠生长,HE染色显示细胞间紧密连接并有大量细胞外基质(ECM)分泌;MTT显示膜片细胞密度随时间增加;成骨成脂诱导结果显示其分化能力明显优于普通培养的rBMMSCs;RT-PCR结果显示,与rBMMSCs相比,细胞膜片高表达ColⅠ和Fn.结论:rBMMSCs细胞膜片相比普通培养的rBMMSCs,在组织工程应用中更具优势.     

牙周膜干细胞膜片的构建及其生物学特性的研究

目的:探讨牙周膜干细胞膜片的构建及其生物学特性.方法:采用胶原酶消化人牙周膜组织,获得牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs),经体外鉴定、扩增后构建PDLSCs细胞膜片,并通过倒置显微镜、HE染色、扫描电镜(SEM)对PDLSCs细胞膜片形态学进行检测.此外,细胞膜...     

复层牙周膜细胞膜片组织再生的实验性研究

目的:制备复层牙周膜干细胞膜片(MUCPs)与单层牙周膜干细胞膜片(MCPs),并评价其生物学活性和组织再生能力。方法:将构建的2种细胞膜片通过免疫组化和扫描电镜等方法观察其生物学活性。再将2种膜片分别与2种支架材料陶瓷牛骨(CBB)与预处理牙本质片(TDM)复合构建不同的生物性牙根,植入裸鼠皮下,观察组织再生情况。结果:体外结果显示MUCPs高表达Col-I、COL-III、Fibronectin、Laminin等细胞外基质的结构蛋白。体内结果显示在复层细胞膜片组可以观察到再生出更明显的类似于牙周复合组织的矿化沉积和牙周膜样纤维。结论:MUCPs具有更为良好的生物学活性和组织再生能力,将为临床牙周组织缺损的治疗提供一种新的治疗方法。     

牙本质支架体外诱导兔骨髓干细胞分化

目的：探讨将人牙本质作为组织工程支架的可行性,采用不同的方式处理牙本质片,观察牙本质片处理后诱导兔骨髓基质干细胞贴壁附着生长的规律及成骨分化潜能。方法：将兔的骨髓基质干细胞分别接种于经机械去除前期牙本质加EDTA-柠檬酸脱矿处理（A组）,标准根管预备-EDTA处理（B组）的牙本质片上,体外培养1周,扫描电镜观察细胞与牙本质片的附着情况,碱性磷酸酶、茜素红及Vonkossa染色观察兔骨髓基质干细胞成骨分化。结果：兔骨髓基质细胞附着在2种方式处理的牙本质片上生长良好,贴附紧密。B组牙本质片上细胞碱性磷酸酶表达阳性率高达80％,茜素红、Vonkossa染色观察到钙结节数量多于A组。结论：经标准根管预备一EDTA处理的人牙本质能有效促进骨髓基质干细胞增殖及成骨分化,可能成为一种理想的成骨生物支架,并为牙体牙髓疾病的治疗提供了新的思路。广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻1012400lA一42）     

miR-20a 对人炎症牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的：研究 miR-20a 对人炎症牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法：分离培养人牙周膜干细胞后用 qRT-PCR检测 miR-20a 的表达,并且在瞬时转染 miR-20a mimics 和 inhibitor 后成骨诱导,用茜素红染色,Western Blot 和 PCR 的方法检测成骨能力的改变。结果：人炎症牙周膜干细胞中 miR-20a 表达降低,转染 mimics 后成骨能力升高,转染 inhibitor 后成骨能力降低。结论：miR-20a 可以促进人炎症牙周膜干细胞成骨分化。     

miR-335对牙囊干细胞成骨分化能力的影响

目的 体外研究大鼠牙囊干细胞成骨分化能力,以及miR 335对牙囊干细胞成骨分化能力的影响。 方法 双向差速法体外分离培养大鼠牙囊干细胞,进行成骨诱导。用茜素红染色检测成骨分化的能力,进而用qRT-PCR检测miR-335的表达,并且在瞬时转染miR-335 mimics和inhibitor后成骨诱导,用PCR和Western Blot的方法检测成骨能力的改变。 结果 双向差速法培养的牙囊干细胞具有成骨样细胞分化能力。成骨诱导的牙囊干细胞中miR-335表达降低,转染mimics后成骨能力降低,转染inhibitor后成骨能力升高。 结论 在体外条件miR-335可以抑制牙囊干细胞成骨分化。     

负压与BMSCs膜片促进细胞定植和体内成骨的探讨

目的:研究经过负压处理的TCP支架材料与细胞复合后的体内成骨能力。方法:将TCP支架材料负压处理,和骨髓基质细胞(BMSCs)细胞共培养一段时间后,成骨诱导2周,电镜下观察支架材料和细胞复合情况。再将该复合物与BMSCS细胞膜片复合,植入到裸鼠皮下,8周后作组织切片,HE染色和Masson染色,观察其体内成骨能力。结果:负压(有细胞)+膜片组异位移植8周后,内部可见大量胶原纤维和成骨纤维,在团块样组织内部可见大量成骨细胞,并有血管形成。对照组仅有个别细胞密集区,胶原纤维和成骨纤维较少。空白组未见类似情况。结论:经过负压+骨髓基质细胞膜片处理的TCP支架材料,在体内有成骨潜能。     

脂肪干细胞复合成骨性干细胞膜片用于修复兔颅骨缺损的实验研究

目的　细胞膜片技术已经被证实了可以成功用于多种组织再生,我们前期实验证明了脂肪干细胞（ADSCs）可以显著促进成骨性细胞膜片（BMSCs sheet）的异位成骨能力。因此,本实验的目的是验证ADSCs能否促进成骨性BMSCs膜片的骨缺损修复能力。方法：ADSCs和BMSCs分别取自同一个供体的腹股沟和髂骨骨松质,通过连续成骨诱导的方法制备成骨性BMSCs膜片,并分析BMSCs膜片的特性;然后将ADSCs复合在BMSCs膜片上,构架ADSCs-BMSCs膜片复合体,移植到兔颅骨缺损模型,单纯BMSCs膜片和颅骨缺损组作为对照。移植八周后,Micro-CT扫描和组织学分析其骨修复再生情况。结果：BMSCs膜片由含有大量矿化结节的多层细胞膜片构成;移植八周后,相比于对照组,实验组新生组织骨密度更高,新生矿化组织量也更多,同时新生骨组织/总新生组织体积（BV/TV）的比值也更高,表明ADSCs显著提高了BMSCs膜片的骨缺损修复能力。结论：ADSCs复合BMSCs膜片可以明显促进兔颅骨缺损的骨再生修复,该方法为促进骨修复重建提供了一种新的方法。     

根尖牙乳头干细胞细胞膜片构建及其成骨/成牙本质分化性能研究

目的:构建根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla, SCAP）细胞膜片,并对其组织学形态和成骨/成牙本质分化性能进行研究,为SCAP细胞膜片应用于年轻恒牙牙髓再生提供实验基础。方法:分离年轻恒牙第三磨牙牙乳头,进行SCAP原代培养。采用流式细胞术检测SCAP表面标志物,茜素红S染色检测其成骨/成牙本质分化。取第3代SCAP,膜片诱导液连续培养14 d,形成细胞膜片。对SCAP细胞膜片进行H-E染色,组织学观察;流式细胞术检测SCAP细胞膜片的细胞周期变化;实时定量PCR（qRT-PCR）检测细胞膜片中Runx2、ALP、Col-I基因表达;Western印迹法检测细胞膜片Runx2、ALP蛋白表达水平。采用SPSS17.0软件包对实验结果进行统计学分析,两样本细胞周期检测和qRT-PCR基因检测均数的比较采用t检验。结果:组织学H-E染色显示,SCAP细胞膜片由5~6层细胞组成,细胞量大,细胞之间排列紧密,且富含细胞外基质。SCAP细胞膜片细胞周期G2+S期所占比例较低,而G1期比例较高,提示SCAP细胞膜片增殖性能受到显著抑制（P<0.05）。同时,qRT-PCR和Western印迹法结果显示,与SCAP相比,SCAP细胞膜片成骨/成牙本质分化能力显著升高（P<0.05）。结论:SCAP细胞膜片富含细胞外基质,且成骨/成牙本质分化能力高于单纯SCAP,SCAP细胞膜片应用于牙髓再生更具有优势。     

miR-203介导TNFα调控牙周膜干细胞成骨分化

目的:体外研究miR-203介导TNFα调控人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cell,hPDLSCs)成骨分化能力及其分子机制.方法:qPCR检测人牙周膜干细胞成骨诱导前后TNFα和成骨基因的表达;qPCR及茜素红染色检测TNFα对牙周膜干细胞成骨分化能力及miR-203表达的影响;分别转染miR-203沉默及过表达模拟物,qPCR及ELISA实验检测hPDLSCs中TNFα的表达水平,茜素红染色观察miR-203 inhibitor及TNFα作用下牙周膜干细胞成骨分化能力的变化;生物信息学分析TNFα为miR-203的潜在靶基因,通过双荧光素酶报告实验进行验证.结果:成骨诱导后牙周膜干细胞中TNFα的表达水平明显下调,而成骨基因的表达水平显著升高;qPCR及茜素红染色结果显示TNF α可抑制牙周膜干细胞成骨分化并上调miR-203的表达;miR-203 inhibitor可显著逆转TNF α对牙周膜干细胞成骨分化的抑制作用;沉默miR-203后hPDLSCs中TNFα的表达水平上调,而过表达miR-203后则TNFα的表达下调;双荧光素酶报告实验结果显示TNFα为miR-203的靶基因.结论:miR-203可介导TNFα负向调控牙周膜干细胞成骨分化,提示miR-203在牙周炎组织损伤修复过程中发挥着重要作用.     

同一个体来源正常与炎性牙周膜干细胞生物学性能的比较

目的：比较同一个体来源正常与炎性牙周膜干细胞的生物学性能。方法：分别分离培养同一个体来源正常牙周膜干细胞（hPDLSCs）及炎性牙周膜干细胞（i－hPDLSCs）。流式细胞仪鉴定两种干细胞表面抗原标记;MTT法、克隆形成率检测并比较两者的增殖能力;茜素红染色及油红O染色检测并比较其分化能力;RT－PCR检测成骨相关基因COL－1、Runx－2、BSP－mRNA及成脂相关基因LPL与PPAR γmRNA的表达水平。结果：i－hPDLSCs及hPDLSCs均具有间充质干细胞特性,i－hPDLSCs增殖能力强于hPDLSCs,但分化能力明显弱于hPDLSCs（P＜0．05）;两者成脂能力比较无统计学差异（P＞0．05）。结论：炎症微环境对牙周膜干细胞的生物学性能有一定的影响。     

基质细胞衍生因子-1对炎症和正常来源的人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 通过体外培养炎症来源的人牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常来源的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）,比较基质细胞衍生因子-1（SDF-1）对于两种来源细胞的成骨分化作用。方法 采用组织块酶消化法原代培养iPDLSCs 和hPDLSCs,经有限稀释法纯化,通过流式细胞仪对干细胞表面标记物检测鉴定后,对其进行成骨诱导;MTT法检测并比较SDF-1对两种来源的细胞增殖能力的影响;茜素红染色检测SDF-1作用于两种来源的细胞后钙化骨量的表达;碱性磷酸酶法比较SDF-1作用于两者的成骨分化能力;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测SDF-1作用于两种牙周膜干细胞前后成骨相关基因表达水平的变化。结果 两种来源的牙周膜细胞经纯化后均阳性表达干细胞标记物。hPDLSCs较iPDLSCs增殖能力高;两种细胞经SDF-1成骨诱导培养后,成骨相关基因的表达水平均较诱导前明显上调（P<0.05）,SDF-1在50、200 ng·mL ^-1时分别对iPDLSCs和hPDLSCs细胞成骨分化作用最明显（P<0.05）。结论 正常来源和炎症来源的人牙周膜干细胞均具有成骨分化能力,SDF-1可增强两种来源的牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

基质细胞衍生因子-1对炎症和正常来源的 人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 通过体外培养炎症来源的人牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常来源的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）,比较基质细胞衍生因子-1（SDF-1）对于两种来源细胞的成骨分化作用。方法 采用组织块酶消化法原代培养iPDLSCs 和hPDLSCs,经有限稀释法纯化,通过流式细胞仪对干细胞表面标记物检测鉴定后,对其进行成骨诱导;MTT法检测并比较SDF-1对两种来源的细胞增殖能力的影响;茜素红染色检测SDF-1作用于两种来源的细胞后钙化骨量的表达;碱性磷酸酶法比较SDF-1作用于两者的成骨分化能力;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测SDF-1作用于两种牙周膜干细胞前后成骨相关基因表达水平的变化。结果 两种来源的牙周膜细胞经纯化后均阳性表达干细胞标记物。hPDLSCs较iPDLSCs增殖能力高;两种细胞经SDF-1成骨诱导培养后,成骨相关基因的表达水平均较诱导前明显上调（P<0.05）,SDF-1在50、200 ng·mL ^-1时分别对iPDLSCs和hPDLSCs细胞成骨分化作用最明显（P<0.05）。结论 正常来源和炎症来源的人牙周膜干细胞均具有成骨分化能力,SDF-1可增强两种来源的牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

ERK/MAPK信号通路在牙周膜干细胞成骨分化过程中的时空效应性变化

目的探讨牙周膜干细胞成骨分化进程中ERK/MAPK信号通路表达水平的变化,以及它对牙周膜干细胞成骨分化的调控作用。方法通过单克隆法获得人源性的牙周膜干细胞,分别用DMEM培养基、成骨诱导培养液处理牙周膜干细胞7、14、21d后收集细胞,提取总蛋白,通过Western Blot的方法检测ERK/MAPK通路的变化;分别用DMEM培养基、成骨诱导液、成骨诱导液+ERK抑制剂U0126处理牙周膜干细胞21d,通过茜素红染色的方法检测PDLSCs的成骨分化能力的改变;并通过分光光度计对茜素红染色结果进行定量分析。结果 DMEM组和成骨诱导组中,牙周膜干细胞胞内磷酸化ERK(P-ERK)的表达水平呈现先上升后下降的趋势,在诱导第14d达到峰值,在21d表达水平下降。在诱导第7d和第14d,成骨诱导组牙周膜干细胞胞内P-ERK/ERK的表达水平比值均高于DMEM组,具有显著统计学差异(P<0.05)。在第21d时,DMEM组牙周膜干细胞胞内P-ERK/ERK的表达水平比值略高于成骨诱导组,但无统计学差异(P>0.05)。ERK的抑制剂U0126的加入抑制牙周膜干细胞的成骨向分化过程中矿化结节的产生。结论 ERK/MAPK信号通路参与牙周膜干细胞的成骨向分化调控,它在牙周膜干细胞成骨分化过程中的表达随着时间的发展呈非线性变化。     

炎症微环境下芦丁对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 研究芦丁（rutin）对炎症微环境下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法 采用有限稀释法分离纯化获得牙周膜干细胞,采用流式细胞术鉴定牙周膜干细胞。以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激牙周膜干细胞,建立体外炎症模型。实验分为4组,第1组使用α-MEM培养基培养牙周膜干细胞,第2组使用含有脂多糖的α-MEM培养基培养牙周膜干细胞,第3组在含有脂多糖的α-MEM培养基加入芦丁培养牙周膜干细胞,第4组使用含有芦丁的α-MEM培养基培养牙周膜干细胞。通过碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测试、茜素红染色、RT-PCR以及蛋白免疫印迹等方法检测成骨分化能力的改变。采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计分析。结果 CCK-8和碱性磷酸酶活性测试结果显示,10 μmol/L芦丁对炎症状态下牙周干细胞增殖和成骨分化作用最明显。碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果显示,10 μmol/L芦丁可以改善炎症微环境下牙周膜干细胞的成骨分化能力。RT-PCR、蛋白免疫印迹结果显示,芦丁可以增强炎症状态下COL1、ALP、RUNX2等成骨基因和成骨蛋白的表达。结论 芦丁可以增强炎症微环境下牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

细胞膜片技术及其在种植体表面的应用进展

为了提高种植体骨结合,增加种植治疗的成功率,细胞膜片技术从生物学的角度提供了种植体表面改性的新方法。细胞膜片技术是一种保留细胞外基质、不含支架的细胞处理方法,与常规植入材料相结合可形成膜片-种植体复合体。同时越来越多的研究表明细胞膜片可以作为基因工程的载体,搭载成骨相关基因,从而促进种植体骨结合。然而,此项技术在种植体应用方面还面临着一些问题,如膜片种植体制备方法单一、体内膜片种植体存活状况未知等。因此,该文将从细胞膜片及膜片种植体的制备方法、体内细胞膜片的追踪方法等方面对其进行总结。