E2F-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建和鉴定靶向E2F-1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法：体外合成两对互补并编码靶向E2F-1基因的特异性短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）序列和一个阴性对照组的寡核苷酸,克隆到pLKO.1-PURO-U6（Age I/EcoR I）质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Tca8113细胞后,运用Real-Time PCR和Western检测三组E2F-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果：经酶切和测序证明,pLKO.1-PURO-U6-E2F-1shRNA序列正确;转染后,各组慢病毒载体中,第一组质粒感染后的Tca8113细胞中E2F-1基因的核酸电泳条带明显减弱,Western检测出E2F-1蛋白的表达降低。结论：靶向E2F-1基因的shRNA慢病毒载体构建成功,并可特异性沉默E2F-1基因的表达,为研究E2F-1在口腔鳞癌的发生发展中的作用提供了初步的实验基础。     

E2F-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建和鉴定靶向E2F-1基因的RNA干扰慢病毒载体.方法:体外合成两对互补并编码靶向E2F-1基因的特异性短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列和一个阴性对照组的寡核苷酸,克隆到pLKO.1-PURO-U6(Age I/EcoR I)质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确...     

慢病毒介导COX-2基因沉默对舌鳞癌Tca8113细胞株药物敏感性的影响

目的:研究COX-2基因沉默表达对舌鳞癌Tca8113细胞药物敏感性的影响。方法:运用RNA干扰技术,构建慢病毒介导的针对COX-2基因的干扰载体,以其感染舌鳞癌Tca8113细胞,沉默其COX-2表达;采用Western-blot方法检测正常细胞以及敲除目的基因细胞COX-2蛋白表达水平;运用MTT方法观察Tca8113细胞在COX-2基因沉默后对平阳霉素及顺铂敏感性的变化。结果:western-blot结果显示,感染慢病毒载体后的细胞COX-2蛋白表达显著下降;MTT结果显示,对相同浓度的平阳霉素和顺铂,COX-2基因沉默组细胞生长抑制率较对照组细胞高(P<0.05)。结论:运用慢病毒介导RNA干扰技术,成功建立稳定沉默COX-2的舌鳞癌细胞株,COX-2沉默后增强了Tca8113细胞对平阳霉素及顺铂的药物敏感性。     

靶向survivin基因的shRNA真核质粒表达稳定株的筛选和建立

目的:针对survivin基因,构建短发卡状RNA干扰(short hairpin RNA interference,shRNA interference)真核质粒表达载体,并转染到高表达survivin基因的舌鳞癌细胞株Tca8113中,筛选出稳定低表达survivin基因的细胞株.方法:针对survivin基因的mRNA序列设计,并合成2对寡核苷酸序列,插入质粒pSilencerTM-2.1U6-neo中,形成重组质粒(PS1和PS2).用大肠杆菌扩增,酶切、PCR、测序鉴定,用脂质体介导转染Tca8113细胞,G418筛选得到稳定表达株,荧光实时定量PCR和Western印迹检测survivin基因在mRNA和蛋白水平的变化.采用SAS8.0软件包对数据进行t检验.结果:2个真核质粒表达载体均构建成功,并筛选出转染成功的细胞.与对照组相比,PS1和PS2转染的Tca8113细胞中的survivin基因在mRNA水平均显著下降,P<0.05;在蛋白水平,PS2转染后显著下降,P<0.01.结论:本研究成功建立针对survivin基因的shRNA质粒载体,并筛选出稳定低表达survivin基因的Tca8113细胞,为口腔鳞癌的基因治疗提供了理论基础.     

靶向抑制人木糖基转移酶-Ⅰ基因的shRNA真核表达载体的构建

目的 构建靶向抑制人木糖基转移酶-Ⅰ(XT-Ⅰ)基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,为探讨唾液腺肿瘤性肌上皮细胞合成及分泌蛋白多糖(PG)的研究奠定基础.方法 根据GenBank提供的XT-Ⅰ基因序列,设计短链寡核苷酸,化学合成后经退火形成双链DNA片段,克隆到Pgenesil-1载体中,构建shRNA真核表达载体WJ1-WJ6,行酶切及核酸测序鉴定;将构建的XT-Ⅰ特异性shRNA表达载体转染体外培养的人唾液腺腺样囊性癌细胞株ACC-M,在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞术检测转染效率,并采用半定量RT-PCR和Western blot分别检测转染后细胞XT-Ⅰ基因mRNA和蛋白表达水平的变化.结果 经酶切、连接后构建的6个质粒命名为WJ1、WJ2、WJ3、WJ4、WJ5、WJ6.酶切及核酸测序鉴定证实,构建的shRNA表达载体WJ1-WJ6序列正确;转染WJ1-WJ6后ACC-M细胞均可表达绿色荧光;流式细胞术测定转染效率平均为50.26%;RT-PCR结果显示,wJ3显著抑制XT-Ⅰ mRNA的表达,抑制率为72.39%;Western blot结果显示,WJ3有效抑制XT-Ⅰ的蛋白表达,抑制率为70.18%.结论 成功构建靶向抑制XT-Ⅰ的shRNA真核表达载体WJ1-WJ6,其中WJ3可高效抑制XT-Ⅰ基因mRNA及蛋白水平的表达,为唾液腺肿瘤中PG的RNAi研究奠定了基础.     

短发卡RNA介导的表皮生长因子受体基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响

目的 研究短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响,为治疗舌鳞状细胞癌提供依据.方法 构建靶向人EGFR的shRNA真核表达载体并瞬时转染人舌鳞状细胞癌细胞株Tca8113细胞,用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法检测转染前后EGFR的mRNA和蛋白的变化,用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖活性,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 转染后Tca8113细胞的EGFR mRNA和蛋白的表达(0.217±0.047)和(0.324±0.059)均明显下调(P＜0.05),细胞增殖活性(0.340±0.009)明显降低(P＜0.05),细胞凋亡率(39.4±7.7)%显著增高(P＜0.05).结论 shRNA介导的EGFR基因沉默可抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖并诱导其凋亡.     

靶向抑制人木糖基转移酶-I基因的shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向抑制人木糖基转移酶- Ⅰ（XT- Ⅰ）基因的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体，为探讨唾液腺肿瘤性肌上皮细胞合成及分泌蛋白多糖（PG）的研究奠定基础。方法根据GenBank提供的XT- Ⅰ基因序列，设计短链寡核苷酸，化学合成后经退火形成双链DNA片段，克隆到Pgenesil- 1载体中，构建shRNA真核表达载体WJ1-WJ6，行酶切及核酸测序鉴定；将构建的XT- Ⅰ特异性shRNA表达载体转染体外培养的人唾液腺腺样囊性癌细胞株ACC-M，在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，流式细胞术检测转染效率，并采用半定量RT- PCR和Western blot分别检测转染后细胞XT- Ⅰ基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果经酶切、连接后构建的6个质粒命名为WJ1、WJ2、WJ3、WJ4、WJ5、WJ6。酶切及核酸测序鉴定证实，构建的shRNA表达载体WJ1-WJ6序列正确；转染WJ1-WJ6后ACC-M细胞均可表达绿色荧光；流式细胞术测定转染效率平均为50.26%；RT- PCR结果显示，WJ3显著抑制XT- Ⅰ mRNA的表达，抑制率为72.39%；Western blot结果显示，WJ3有效抑制XT- Ⅰ的蛋白表达，抑制率为70.18%。结论成功构建靶向抑制XT- Ⅰ的shRNA真核表达载体WJ1-WJ6，其中WJ3可高效抑制XT- Ⅰ基因mRNA及蛋白水平的表达，为唾液腺肿瘤中PG的RNAi研究奠定了基础。     

靶向人CD106基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：：构建人CD106基因RNAi慢病毒载体。方法：设计4条靶向CD106的RNA干扰靶点序列(Target 1、2、3、4),合成短发卡结构shRNA并退火成双链DNA,与慢病毒载体重组形成siRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定验证获得连接正确的克隆。经由293T细胞包装siRNA慢病毒颗粒,随后将其感染人口腔鳞癌HN12细胞,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：构建的慢病毒载体的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度至少达到1×109 TU/ ml。siRNA慢病毒感染人HN12细胞,经Real-time PCR和Western blot检测目的基因CD106的mRNA和蛋白表达较阴性对照载体慢病毒感染组明显下降。结论：成功构建了人靶向CD106RNAi慢病毒载体,并能够在细胞水平上有效沉默靶基因。     

shRNA沉默LASP-1对舌鳞状细胞癌SCC9细胞增殖和迁移的影响

目的：探讨LASP?1在人舌鳞状细胞癌细胞中的表达,并应用shRNA沉默人舌鳞状细胞癌细胞SCC9中LASP?1基因,研究LASP?1对SCC9细胞增殖和迁移能力的影响。方法构建携带绿色荧光蛋白的LASP?1 shRNA质粒及阴性对照组质粒LASP?1 shNC,通过脂质体转染SCC9细胞,采用MTT法检测细胞增殖;RT?PCR法检测细胞LASP?1 mRNA表达;Western blot检测细胞LASP?1蛋白的表达;运用Transwell小室实验检测细胞迁移能力。结果 LASP?1在舌鳞状细胞癌细胞中高表达;实验组和阴性对照组分别转染相应质粒48 h后细胞均有绿色荧光蛋白表达,表明质粒转染成功;实验组SCC9细胞LASP?1 mRNA和LASP?1蛋白表达明显降低;与空白对照组相比,实验组细胞培养48 h和72 h细胞存活率分别降低了（51.23±1.47）%和（50.07±2.11）%;Transwell实验结果显示, LASP?1基因被沉默后细胞迁移能力明显下降,比对照组降低约43%。结论 LASP?1在舌鳞状细胞癌细胞中高表达,下调LASP?1基因表达可抑制SCC9细胞的增殖和迁移。     

靶向黏着斑激酶siRNA表达载体构建及转染Tca8113细胞的沉默效应

目的:构建靶向黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)基因的小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)质粒表达载体,转染人舌癌细胞Tca8113后观察其对FAK表达的抑制作用.方法:根据siRNA的设计原则,在人FAK mRNA序列中,设计并合成2条特异性靶序列寡核苷酸及2条无关对照序列,经退火成互补双链,再克隆到pGC-silencerTM-U6/Neo真核表达载体中,构建重组体pSilencer-FAK并进行酶切鉴定;转染重组质粒至Tca8113细胞中,经G418抗性筛选,获得稳定转染细胞系;运用免疫细胞化学和Westem-blot鉴定FAK的沉默效应.结果:质粒酶切证实目的寡核苷酸片段已被克隆到pGC-SilencerTM-U6/Neo载体中;psi-lencer-FAK转染细胞后,FAK基因的表达受到明显抑制.结论:成功构建了针对人FAK的siRNA表达载体,通过转染Tca8113细胞可有效地抑制细胞中FAK的表达.     

cbfa1、satb2双基因共表达载体的构建及鉴定

目的:构建携带cbfa1和satb2双基因的慢病毒真核表达载体。方法:采用PCR技术,从质粒中扩增基因cbfa1和satb2,经TA克隆、酶切筛选后,对阳性重组子进行商业测序鉴定。将测序正确的cbfa1和satb2分别插入pIRES上、下游的相应酶切位点中,构建pIRES-cbfa1-satb2。然后通过双酶切,得到cbfa1-Ires-satb2片段,将其插到含有neo/kana基因的慢病毒载体pLentinTrident1-CMV的相应酶切位点上,构建慢病毒真核表达载体pLentinTrident1-CMV-cbfa1-Ires-satb2。结果:通过PCR技术成功扩增了cbfa1和satb2基因,借助中间载体pIRES中的内部核糖体进入位点,将cbfa1和satb2同时连到了慢病毒载体pLentinTrident1-CMV上,经PCR、酶切及测序验证,质粒构建成功。结论:本实验成功构建了携带cbfa1和satb2双基因的慢病毒真核表达载体,为进一步研究2种基因的功能奠定了基础。     

人Notch-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建及鉴定人Notch-1基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,寻找最佳RNAi慢病毒载体。方法 针对人Notch-1基因序列,按照RNAi序列设计原则,设计3段RNAi靶点序列（shRNA1~3）,通过限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接,将Notch-1基因序列插入慢病毒载体pLenOR-THM,构建pLenOR-THM-Notch-1重组载体。质粒转化感受态DH5α细菌,筛选阳性克隆,经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度,观察感染效率。各组病毒载体转染ACC-M细胞后,运用定量逆转录聚合酶链反应和Western blot检测Notch-1基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建慢病毒载体pLenOR-THM-Notch-1,四质粒共转染293T细胞后可见大量绿色荧光;浓缩后的病毒滴度为5.8×108 TU·mL-1;以复感染系数为1时感染293T细胞,感染效率在90％以上。QRT-PCR和Western blot检测结果表明,pLenOR-Notch-1-shRNA3组受抑制程度最高。结论 成功构建了人Notch-1 RNAi慢病毒载体。     

NS-398诱导舌鳞癌细胞凋亡及其对E2F-1蛋白表达的影响

目的观察选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂NS-398诱导舌鳞癌Tca8113细胞凋亡及其对细胞核转录因子E2F-1蛋白表达的影响。方法NS-398作用于舌癌Tca8113细胞,噻唑蓝法检测细胞生长抑制情况,流式细胞仪检测细胞周期及其凋亡率的改变,放射免疫法测定细胞上清液中前列腺素E2(PGE2)含量,Western blot法检测细胞中COX-2和E2F-1蛋白表达的变化。结果NS-398可以抑制Tca8113细胞的增殖,其抑制作用随着时间的延长和药物浓度的增加而增强。NS-398(50μmol/L)可引起Tca8113细胞G0/G1期细胞的逐渐增加,S期和G2/M期细胞比例数减少,并随着时间的延长细胞上清液中PGE2含量降低,细胞中COX-2和E2F-1蛋白表达下调。结论NS-398可以抑制Tca8113细胞的增殖,阻断细胞生长停滞于G0/G1期;该效应可能与其诱导细胞凋亡和降低细胞产生前列腺素E2有关;E2F-1蛋白可能参与了这些过程。     

Immunohistochemical detection of retinoblastoma protein and E2 promoter-binding factor-1 in ameloblastomas

BACKGROUND: To clarify the roles of cell cycle regulation in oncogenesis and cytodifferentiation of odontogenic tumors, expression of retinoblastoma protein (RB) and E2 promoter-binding factor-1 (E2F-1) was analyzed in ameloblastomas as well as in tooth germs. METHODS: Tissue specimens of 10 tooth germs, 40 benign ameloblastomas, and five malignant ameloblastomas were examined immunohistochemically with the use of antibodies against RB, E2F-1, and phosphorylated RB. Ki-67 antigen immunostaining was made as a marker of cell proliferation. RESULTS: Immunohistochemical reactivity for RB, E2F-1, phosphorylated RB, and Ki-67 was detected in the nuclei of odontogenic epithelial cells near the basement membrane in tooth germs and benign and malignant ameloblastomas. The number of cells positive for phosphorylated RB was nearly equal to or slightly less than the number of cells positive for RB or E2F-1. The number of Ki-67-positive cells was slightly more than the numbers of cell positive for RB, E2F-1, or phosphorylated RB. The levels of immunoreactivity for RB, E2F-1, phosphorylated RB, and Ki-67 were slightly higher in benign and malignant ameloblastomas than in tooth germs. Plexiform ameloblastomas showed significantly higher expression of RB than follicular ameloblastomas. Ki-67 immunoreactivity was significantly higher in ameloblastic carcinomas than in metastasizing ameloblastomas. CONCLUSION: Similar immunoreactivity for RB, E2F-1, phosphorylated RB, and Ki-67 in tooth germs and ameloblastomas indicated cellular expression of phosphorylated RB and active-free E2F-1 in both normal and neoplastic odontogenic tissues. Expression of RB, E2F-1, and phosphorylated RB was considered to be involved in cell proliferation and differentiation of odontogenic epithelium via control of the cell cycle.     

颌骨骨肉瘤中E2F-1表达及意义

目的：分析Ｅ２Ｆ－１在颌骨骨肉瘤中的表达及意义。方法：利用免疫组化ＡＢＣ法检测Ｅ２Ｆ－１在２０例颌骨骨肉瘤和８例骨软骨瘤中的表达。结果：骨肉瘤中Ｅ２Ｆ－１的阳性表达率为７０％（１４／２０）,Ｅ２Ｆ－１表达在各病理分型间无显著性差异（Ｐ〉０．０５）,转移与未转移病例Ｅ２Ｆ－１的表达无显著性差异（Ｐ〉０．０５）;而骨软骨瘤中无Ｅ２Ｆ－１的表达（０／８）,与骨肉瘤相比有显著性差异（Ｐ〈０．０５）。结论：     

人釉原蛋白基因重组慢病毒载体的构建及在293T细胞中的表达

目的:构建含人釉原蛋白(human Amelogenin,hAm)成熟肽编码区基因的慢病毒载体FuAmw,并观察在重组慢病毒感染的293T细胞中釉原蛋白的表达.方法:以构建好的重组质粒PQE30-Am为模板,采用PCR技术体外扩增hAm成熟肽编码区.将扩增产物与慢病毒载体转移质粒FUGW分别用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后连接,构建重组慢病毒载体,转移质粒FUAmW,并进行酶切及测序鉴定.通过聚乙烯亚胺(polytheylenimine,PEI)法将三质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒FUGW和FUAmW,然后分别离体感染293T细胞,培养 72h后,经荧光显微镜下观察和流式细胞计数检测感染效率,采用RT-RCR及Western印迹法检测釉原蛋白基因的表达.结果:重组质粒经测序证实.插入片段与人釉原蛋白成熟肽基因序列完全一致.流式细胞仪测得重组病毒感染293T细胞绿色荧光蛋白(green fluoresence protein,GFP)的阳性率为67.38%.RT-RCR和Western印迹均证实,重组慢病毒FUAmW感染的293T细胞能够表达人釉原蛋白.结论:成功构建携带人釉原蛋白成熟肽基因的重组慢病毒载体质粒,以293T细胞包装得到的重组人釉原蛋白病毒能感染真核细胞并获得表达.     

E2F-1和p21WAF1/CIP1在良恶性多形性腺瘤中的定量表达和意义

目的研究E2F-1和p21^WAF1／CIP1在良、恶性多形性腺瘤中的表达和意义。方法实验分为正常组、多形性腺瘤组(PA)和恶性多形性腺瘤组(MPA)。利用免疫组化和原位杂交的方法对三组分别进行E2F-1和p21^WAF1／CIP1的染色，并进行灰度值测量和统计学分析。结果E2F-1主要表达在肿瘤性上皮组织，软骨样细胞和粘液样组织中也有少量表达。在MPA组中的表达显著高于PA组，二者与正常组之间也有显著性差异。p21^WAF1／CIP1主要在腺管状结构、上皮条索和团块鳞状化生结构的细胞浆中表达，在PA和MPA组中的表达均较弱，但MPA组比PA组更弱。结论E2F-1和p21^WAF1／CIP1可作为衡量多形性腺瘤的良恶性程度的有用指标。     

Amplification, clone and identification of the specific fragments of tumor metastasis-suppressor gene nm23-H1 and nm23-H2]

A series of DNA primers specific for the specific fragments of nm23-H1 and nm23-H2 were designed and synthesized. The specific fragments of nm23-H1(185 bp) and nm23-H2(145 bp) were amplified from human blood DNA by using polymerase chain reaction (PCR). The recovered PCR products were treated with Klenow fragment, inserted into pGEM-3zf(+) vector with blunt-end ligation, and then transformed into competent cell JM109. The positive colonies were directly identified by colour screening on indicator plates. The recombinant plasmids were digested by Alu I and identified by PCR. The results showed that the authors had obtained the specific fragments of nm23-H1 and nm23-H2 respectively, and these specific fragments could be used for study the expression of nm23-H1 and nm23-H2 seperately.