人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞对共培养内皮细胞的作用

目的 在体外共培养体系中研究人多发性骨髓瘤(MM)细胞对人正常内皮细胞的作用.方法 建立人MM细胞株RPMI8226细胞与正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的体外共培养体系;以同期单独培养的HUVEC为对照,用电子显微镜和光学显微镜对与RPMI8226细胞共培养的HUVEC进行细胞超微结构和细胞形态学观察;用刮痕迁移实验、管状结构形成实验评价体外内皮细胞血管新生的能力;并以Western blot和流式细胞术分别检测脑源性神经营养因子(BDNF)、Endoglin与TrkB、Tie2、β3,整合素、血管细胞黏附分子-1蛋白的表达.结果 与同期单独培养的正常内皮细胞对照相比,共培养后的部分内皮细胞胞体伸展并首尾排列成一行;超微结构出现胞核增大、核仁增大、核质比例增大,内质网疏松、变形,细胞表面纤毛减少;共培养体系中细胞管状结构形成数量和迁移细胞数较单独培养体系分别增加了112%和136%;BDNF、Endoglin、TrkB、Tie2、β3整合素和血管细胞黏附分子-1蛋白的表达亦明显上调.结论 MM细胞与人正常内皮细胞共培养后,内皮细胞有明显的趋瘤特征和较强的血管新生能力,推测MM患者骨髓中骨髓瘤细胞通过对相邻内皮细胞的作用促进血管新生,且新生血管的内皮细胞性质与行为不同于正常内皮细胞.     

多发性骨髓瘤细胞脑源性神经营养因子对血管新生作用的研究

目的研究多发性骨髓瘤(MM)细胞脑源性神经营养因子(BDNF)的表达水平及其与MM细胞诱导的血管新生的关系。方法采用RT-PCR法、Western blot法及ELISA法检测MM细胞系KM3、RPMI8226细胞BDNF的表达及分泌。采用MTT法观察MM细胞培养上清液对脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的作用;用改良的Boyden小室法观察MM细胞培养上清液对HUVEC迁移的影响;采用体外小管形成实验,观察MM细胞培养上清液对HUVEC分化的影响。结果KM3、RPMI8226细胞不仅表达BDNF mRNA,也表达和分泌BDNF蛋白,BDNF的基础分泌水平在其生物学作用范围内。KM3、RPMI8226细胞培养上清液均可明显促进HUVEC增殖,含50.0%KM3细胞培养上清液组和完全KM3细胞培养上清液组HUVEC数分别为对照组的(1.85±0.23)倍和(2.16±0.29)倍(P<0.05),抗人类BDNF中和抗体可部分抑制其促增殖活性;含50.0%KM3细胞培养上清液组HUVEC迁移指数为1.85±0.23,完全KM3细胞培养上清液组HUVEC迁移指数为2.16±0.29,与对照组比较,差异有统计学意义(P值均<0.05),并可明显促进基质胶中网状毛细血管形成(P<0.01),抗BDNF中和抗体可明显抑制其作用。结论MM细胞表达和分泌BDNF,BDNF可能参与MM细胞诱导的血管新生。     

多发性骨髓瘤细胞激活内皮细胞脑源性神经营养因子自分泌环

目的在体外共培养体系中研究人多发性骨髓瘤（MM）细胞对正常内皮细胞的作用。方法建立人MM细胞株RPMI8226与正常人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的体外共培养体系；以同期单独培养的HUVEC为对照，对与RPMI8226细胞共培养的HUVEC进行脑源性神经营养因子（BDNF）及其特异性受体TrkB基因的半定量RT—PCR分析和蛋白的Western blot分析，采用ELISA方法检测共培养体系培养上清中BDNF的含量；在转换共培养实验的基础上应用Transwell小室迁移实验、网状结构形成实验评价与RPMI8226细胞共培养激活的HUVEC对正常HUVEC血管新生能力的影响。结果与同期单独培养的HUVEC相比，经共培养后的HUVEC不仅上清中BDNF的含量增加[分别为（12．4±5．1）ng／ml和（31．6±7．2）ng／ml，P〈0．05]，RT-PCR结果显示HUVEC常规表达BDNF，与RPMI8226细胞共培养后HUVEC BDNF表达量约为前者的1．7倍（P〈0．05）；单独培养的HUVEC几乎不表达TrkB，共培养的RPMI8226细胞明显上调HUVEC TrkB的表达（为前者的4．4倍，P〈0．05），Western blot结果与上述结果相符；经RPMI8226细胞活化的内皮细胞可明显促进HUVEC迁移和网状结构形成，与未活化的内皮细胞相比迁移指数和网状结构数量分别增加了99％和72％，抗BDNF抗体可部分抑制其活性。结论MM细胞通过可溶性的细胞因子介导，激活内皮细胞的BDNF／TrkB自分泌环，继而实现内皮细胞的自促进血管新生效应。     

脑源性神经营养因子激活其受体TrkB在多发性骨髓瘤发病机制中的作用

目的 研究异常表达的脑源性神经营养因子(BDNF)在多发性骨髓瘤(MM)发生、发展中的作用及其信号通路.方法 采用锥虫蓝拒染法检测BDNF对人MM细胞系RPMI8226、U266和KM3细胞存活的促进作用,MTT比色法观察BDNF对苯丙氨酸氮芥和长春新碱细胞毒作用的影响,Western blot检测BDNF对MM细胞TrkB磷酸化的影响.通过动物模型观察BDNF对肿瘤生长和实验动物存活时间的影响.结果 BDNF以浓度依赖性方式促进MM细胞的存活,50μg/L BDNF作用后存活细胞数较对照组明显增加.BDNF可明显降低苯丙氨酸氮芥和长春新碱的细胞毒性,50μg/LBDNF作用后,苯丙氨酸氮芥和长春新碱的EC50值分别为无BDNF作用时的2倍和3倍.体内实验表明BDNF可明显促进异种移植的MM裸鼠模型中肿瘤的生长,经BDNF处理和未经BDNF处理组肿块的平均体积分别为3240.9 mm3和1032.7 mm3(P＜0.05),生存时间分别为13 d和21 d(P＜0.05).MM细胞中异常表达的TrkB是BDNF的功能性受体,外源性BDNF作用后,MM细胞TrkB磷酸化水平明显增加,并且Trk抑制剂K252a可明显抑制BDNF诱导的MM细胞迁移.结论 外源性BDNF可磷酸化激活MM细胞表面TrkB受体,促进骨髓瘤细胞的增殖、存活、迁移并参与骨髓瘤细胞的化疗耐药,在MM的病理生理进程中起重要作用.     

AKT/eNOS信号途径在脑源性神经营养因子诱导内皮细胞血管新生中的作用

目的探讨脑源性神经营养因子（BDNF）促进内皮细胞血管新生的机制及其参与的信号通路，为抗多发性骨髓瘤血管生成的研究提供新的实验依据。方法以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为对象，采用Western blot印迹法检测细胞内磷酸化丝／苏氨酸激酶（AKT）、内皮细胞一氧化氮合酶（eNOS）蛋白质的表达；采用Transwell小室迁移实验、小管形成实验评价体外内皮细胞血管新生的能力，小鼠体内Matrigel plug实验评估体内内皮细胞血管新生的能力，采用硝酸还原酶法检测HUVEC上清中内皮细胞源性一氧化氮（eNO）的含量，FITC-Annexin V／PI双染色流式细胞术分析细胞凋亡。结果BDNF以时间一浓度依赖性的方式激活P13K／AKT／eNOS信号通路，应用PI3K激酶抑制剂Ly294002可以明显阻断BDNF刺激后内皮细胞eNO的生成。在体外，BDNF诱导的细胞迁移和小管形成效应均分别能被Ly294002和L-NAME（NOS抑制剂）阻断；而BDNF的抑制凋亡效应与L-NAME无关，仅受Ly294002影响；在体内，经L-NAME喂养的小鼠皮下Matrigel栓中的新生血管数量与未经L-NAME喂养的小鼠相比显著减少。结论BDNF通过AKT／eNOS途径活化介导血管薪生，这可能成为治疗多发性骨髓瘤血管新生的新靶点。     

VEGF反义RNA促骨髓瘤细胞凋亡及抑制内皮细胞形成血管作用的体外研究

本研究探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）反义RNA对人多发性骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡及内皮细胞ECV304体外血管形成的影响和以VEGF反义RNA进行多发性骨髓瘤（MM）基因治疗的可行性。将VEGF121反向克隆入真核表达质粒pIRES2-EGFP构建重组质粒AS-VEGF，酶切、测序鉴定。用此真核表达重组质粒转染人骨髓瘤细胞系U266，G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR、Westernblot法分别检测阳性克隆中VEGFmRNA和蛋白的表达；利用MTT法、流式细胞术检测转染细胞增殖、凋亡的变化；利用基质胶中内皮细胞ECV304的网络形成检测血管形成。结果表明：获得了携带反义VEGF基因的真核表达重组质粒AS-VEGF；VEGF121反义RNA部分阻断了U266细胞中VEGF的表达，转染重组质粒的U266细胞VEGFmRNA和蛋白表达都较对照组细胞有明显减少，细胞的增殖受到抑制，凋亡增加。转染重组质粒的细胞培养上清在基质胶中作用ECV304细胞后的血管形成较对照组亦有明显减少。结论：VEGF反义RNA可以下调VEGF表达，从而抑制骨髓瘤细胞系U266增殖，增加其凋亡并抑制血管形成。     

EGCG对多发性骨髓瘤细胞KM3促血管新生作用的抑制效应及机制初探

本研究探讨绿茶茶多酚成分之一表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG)]对多发性骨髓瘤细胞KM3促血管新生作用的影响及其机制。体外培养多发性骨髓瘤细胞KM3,观察不同浓度EGCG作用后的培养上清对血管内皮细胞株HUVEC迁移和形成血管能力的影响。ELISA法检测KM3细胞培养上清中血管内皮生长因子(VEGF)分泌水平;RT-PCR方法检测KM3细胞VEGF mRNA表达水平。结果表明:EGCG以浓度依赖方式抑制KM3细胞培养上清促内皮细胞迁移的作用,5,25,50和100μmol/L的EGCG迁移细胞数目分别为414±27,299±70,202±42及116±13个,且EGCG的浓度与内皮细胞的迁移数目呈负相关(r=-0.952,p<0.05)。同时,内皮细胞形成小管的面积随EGCG浓度的升高而减少,25及50μmol/L时的面积分别是88343.9±3231.1和60897.5±914.1μm2,均明显低于对照组(p<0.01),小管面积与EGCG浓度呈负相关(r=-0.888,p<0.05)。5、25、50、100μmol/L的EGCG作用于KM3细胞48小时后培养上清中VEGF的含量分别为1399.0±47.4pg/ml,660.1±5.7pg/ml,108.5±5.8pg/ml和26.2±18.6pg/ml,与对照组比较,25、50、100μmol/L组均有统计学意义(p<0.01)。RT-PCR结果显示EGCG抑制KM3细胞VEGF的mRNA水平表达,且呈浓度依赖性。结论:EGCG能显著抑制多发性骨髓瘤细胞KM3的促血管新生作用;下调VEGF转录水平的表达,减少VEGF的分泌可能是其药理作用机制之一。     

抗脑源性神经营养因子单克隆抗体在骨髓瘤异体移植动物模型中的抗肿瘤效应

为探索BDNF／TrkB途径是否可能成为治疗MM的潜在靶点、抗脑源性神经营养因子（BDNF）单克隆抗体能否阻碍疾病的发展，用骨髓瘤异体移植的动物模型评估在体内BDNF单克隆抗体的抗肿瘤活性。选择糖尿病抵抗／重症联合免疫缺陷（NOD／SCID）小鼠，皮下注射人骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞建立异体移植动物模型。抗体以20μg/只的剂量于接种肿瘤细胞后第1、2、3天腹腔内注射或者以100μg／只的剂量于检测到瘤体后每周1次腹腔内注射。采用组织学方法检测瘤细胞的形态特征，以免疫组织化学染色法分析瘤组织的微血管密度，应用^3H—TdR掺入法和Matrigel网状结构形成实验分别检测BDNF单克隆抗体对RPMI8226细胞体外增殖和PRMI8226细胞诱导的内皮细胞血管新生的影响。结果表明：在建立的骨髓瘤细胞异体移植动物模型内，多次注射BDNF单克隆抗体可缩小肿瘤体积，降低瘤组织微血管密度，延长无病生存期和生存时间，而且BDNF单克隆抗体可显著抑制体外RPMI8226细胞的增殖和诱导内皮细胞血管新生，而相应的对照抗体却无此效应。结论：BDNF单克隆抗体可抑制动物模型中皮下浆细胞瘤的生长和血管新生：     

脑源性神经营养因子对RPMI8226细胞表达和分泌血管内皮生长因子的调控作用

脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子超家族成员之一,多项研究证实BDNF及其功能性受体TrkB高表达于多种恶性肿瘤,包括人类多发性骨髓瘤(MM)[1].     

血管内皮细胞生长因子-A及肿瘤相关巨噬细胞在多发性骨髓瘤中的研究进展

多发性骨髓瘤(MM)是一类浆细胞恶性克隆性疾病,发病机制复杂.MM的发生、发展与新生血管形成及骨髓微环境密切相关.新生血管形成受血管内皮细胞生长因子(VEGF)等血管形成调节因子调节,可促进MM细胞增殖、迁移.肿瘤相关巨噬细胞(TAM)活化后,亦可产生VEGF等促血管生成因子,从而促进骨髓新生血管形成,促进MM发展.笔者拟就VEGF-A、TAM在MM发病中的研究进展进行综述.     

脑源性神经营养因子通过AKT和ERK1/2信号通路诱导内皮细胞血管生成

本研究探讨脑源性神经营养因子（BDNF）促进血管新生的作用及其参与的信号通路,为抗肿瘤血管生成的研究提供新的实验依据。以人脐静脉内皮细胞为对象,采用Western blot方法检测细胞内磷酸化Akt、ERK1/2蛋白质的表达;采用Transwell小室迁移实验和管腔形成实验评价体外内皮细胞血管新生的能力,MTT法检测内皮细胞增殖活性,FITC-Annexin-Ⅴ/PI双染流式细胞术分析细胞调亡。结果表明：BDNF以时间依赖性的方式激活PI3K/Akt和MEK1/ERK信号通路。应用PI3K激酶抑制剂Ly294002、MEK1激酶抑制剂PD98059可以明显阻断BDNF对PI3K/Akt、MEK1/ERK信号通路的激活。100ng/ml的BDNF体外促内皮细胞血管新生能力与25ng/ml血管内皮生长因子（VEGF）相当,其中BDNF诱导的细胞迁移分别被Ly294002和PD98059阻断,其抑制率分别约为74%和36%;同样,Ly294002、PD98059可部分阻断BDNF诱导的小管形成效应,其阻断率分别约57%和37%;而BDNF的促增殖效应仅被PD98059拮抗,抑制凋亡效应仅受Ly294002影响。结论：BDNF在体外有促血管新生的作用。PI3K/Akt和MEK1/ERK信号通路以不同机制共同调节这一过程,其中PI3K/Akt信号通路起着更为重要的调节作用。     

脑源性神经营养因子(BDNF)在多发性骨髓瘤患者血浆中表达增高及其意义的初步研究

为了研究多发性骨髓瘤 (MM)患者血浆中脑源性神经营养因子 (BDNF)、血管内皮细胞生长因子 (VEGF)的表达情况和BDNF与血管新生的关系 ,初步探讨BDNF在MM的发生与发展中的潜在作用 ,用酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定MM患者与健康体检者血浆BDNF和VEGF的浓度 ;采用MTT法观察BDNF对脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的作用 ;用改良的Boyden小室法和体外小管形成实验等体外血管新生模型观察BDNF对HUVEC迁移和形成血管通道的影响 ;采用鸡胚尿囊膜血管生成实验和小鼠matrigelplug方法观察BDNF对体内血管新生的影响。结果表明 :患者血浆BDNF浓度为 (4.2 2± 0 .6 4 )ng ml,与健康体检者 (2 .0 3± 0 .38)ng ml相比 ,差异有显著性意义 (P =0 .0 10 ) ;患者血浆VEGF浓度为 (79.35± 13.2 5 ) pg ml,与健康体检者 (34.4 1± 1.78)pg ml相比 ,差异有显著性意义 (P =0 .0 0 6 )。BDNF与VEGF水平间存在着相关性 (r =0 .4 30 ,P =0 .0 2 5 )。BDNF对HUVEC的增殖没有显著作用 ,但可明显促进HUVEC的迁移和管状结构形成 ;同时可促进鸡胚尿囊膜血管生成和matrigelplug中血管新生。结论 :MM患者血浆BDNF和VEGF显著增高 ,BDNF在体内外均具有明显的促血管新生效应 ,在MM的血管新生中可能起着重要作用。     

多发性骨髓瘤细胞对共培养内皮细胞分化的影响及其机制的初步研究

目的 研究人多发性骨髓瘤（MM）细胞对内皮细胞分化为管状结构的影响及调控脑源性神经营养因子（BDNF）分泌的初步机制。方法 采用人MM细胞系RPM18226细胞或原代MM细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）混合共培养和隔离共培养；以同期单独培养的HUVEC为对照，对与MM细胞共培养的HUVEC进行Matrigel基质管状结构形成实验，评价MM细胞对HUVEC血管新生能力的影响；采用ELISA方法检测两种共培养体系培养上清中BDNF的含量；用抗人CD29和CD18的单克隆抗体（单抗）对MM细胞进行预处理后，在混合共培养的基础上进行管状结构形成实验并检测培养上清中BDNF的含量。结果 与同期单独培养的HUVEC相比，与RPM18226细胞隔离共培养的HUVEC形成的管状结构数量明显增多，但增加幅度（约75％）低于混合共培养体系（约113％）。原代MM细胞促HUVEC管状结构形成效应在隔离共培养体系和混合共培养体系分别为138％与188％。HUVEC单独培养上清中BDNF的含量为（12．4±5．1）ng／ml，RPM18226细胞混合共培养上清和隔离共培养上清的BDNF含量分别为（38．5±8．2）ng／ml和（31．6±7．2）ng／ml；原代MM细胞混合共培养上清和隔离共培养上清的BDNF含量分别为（37．1±8．7）ng／ml和（27．9±7．6）ng／ml。两种黏附分子抗体能不同程度地阻断混合共培养体系中MM细胞促HUVEC管状结构形成效应，并抑制BDNF的分泌。结论 MM细胞可刺激共培养HUVEC分化为管状结构；并受到MM细胞与HUVEC间可溶性细胞因子和黏附作用的共同调控，其调控机制与BDNF相关。     

表达脑源性神经营养因子的人多发性骨髓瘤小鼠模型的建立

过去的研究证实脑源性神经营养因子(BDNF)在体外具有促进多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖并诱导MM血管新生的能力。本研究探讨BDNF/TrkB途径是否为治疗MM的潜在靶点,并比较两种途径建立人MMNOD/SCID小鼠模型的优缺点,为深入探索治疗MM的新靶点奠定基础。选择糖尿病抵抗/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠,通过皮下注射或尾静脉注射人骨髓瘤细胞株RPMI8226建立两种异体移植动物模型。观察荷瘤后小鼠的生长状态,测量皮下瘤块的体积;荷瘤后3周,每周经眼眶后静脉丛采血,检测血清中人源λ轻链含量、Ca2 浓度和血浆中人源BDNF浓度,并计数红细胞;小鼠死后,采用组织学方法观察瘤细胞的形态特征,流式细胞术检测小鼠外周血和骨髓中人源性CD38 细胞比例,采用计算机X线数字摄影观察小鼠全身骨密度的改变和骨质破坏情况。结果表明:皮下注射模型的成瘤率高(5/5),具有多种与浆细胞瘤相似的病理学特征,但其骨髓中未检测到MM细胞,血清中钙离子浓度不高,M蛋白浓度升高不明显且未发现溶骨性损害的组织学和影像学证据。尾静脉注射模型成瘤率相对较低(4/7),骨髓中可检测到呈浸润生长的人CD38 细胞;而且在荷瘤3周后,血清中即可检测到人源M蛋白;随着肿瘤的生长,M蛋白水平、钙离子浓度逐渐升高,并有溶骨性损害的影像学证据。两种模型血浆中人源BDNF的水平亦逐渐升高,9周时浓度分别为(73±11)pg/ml和(105±18)pg/ml。结论:本研究成功建立了两种高表达BDNF的MM荷瘤NOD/SCID小鼠模型,两种模型相互结合应用,为探索MM治疗的新靶点BDNF/TrkB提供了合适的动物模型。     

酞咪哌啶酮对多发性骨髓瘤细胞系血管新生抑制作用的研究

目的 研究多发性骨髓瘤（MM）细胞系培养上清液对人骨髓来源的内皮细胞系（HBMEC）的增殖，迁移，血管新生的促进作用及酞咪哌啶酮对其抑制作用。方法 用MM细胞系（IM9，XG1，U266和MOLP-5）培养上清液培养HBMEC，检测其对HBMEC的增殖，迁移作用，在纤维蛋白胶及基质胶（matrigel)中观察此上清液对血管新生的影响，并研究酞咪哌啶酮对这些作用的抑制。用酶联免疫吸附实验（ELISA）测定此上清液中血管内皮生长因子（VEGF）含量。结果 MM培养上清液明显促进HBMEC的增殖及迁移，在纤维蛋白胶及基质胶（matrigel)中，促进微血管的生长。这些作用均可被酞咪哌啶酮抑制。所有这些作用与MM细胞系产生的VEGF无相关性。结论 MM细胞系通过分泌VEGF或其他某些细胞因子促进HBMEC的增殖，迁移及微血管形成；酞咪哌啶酮可抑制这些作用。并可作为MM的临床治疗方法之一。     

基质细胞衍生因子在多发性骨髓瘤细胞迁移和黏附中生物学作用的研究

目的研究基质细胞衍生冈子（SDF-1）存多发性骨髓瘤（MM）细胞迁移、黏附中的生物学作用以及相关信号转导.方法采用流式细胞术检测MM细胞系RPMl8226、XG-1、XG-7细胞黏附分子表达；免疫荧光技术检测SDF-1对细胞形态以及膜表而黏附分子分布的影响；通过微孔隔离实验检测SDF-1对MM细胞的趋化作用及磷脂酰肌醇3激酶（P13K）存趋化过程中的作用；免疫印迹技术检测MM细胞SDF-1对P13K的活化：结果3种MM细胞系不同程度表达多种黏附分子，RPMl8226、XG-7细胞均高表达黏附分子CD29（〉70％）、XG-1、XG-7细胞均高表达CD44（〉80％），XG-7细胞高表达CD49d（〉90％）；3种细胞系CD49e表达水平均较低（〈30％）；这些黏附分子表达水平不能被SDF-1α明显上调。SDF-1α可触发MM细胞的极化形态建立以及诱导CD29、CD49e在细胞膜的重分布。SDF-1α能促进MM细胞对内皮细胞的黏附，并能够诱导MM细胞的迁移，此作用被G蛋白抑制剂PTX及P13K抑制剂wortmannin明显抑制。结论SDF-1α促进MM细胞对内皮细胞的黏附；并触发MM细胞的极化形态建立及诱导黏附分子的重分布，从而通过P13K信号途径诱导MM细胞的迁移。