实时荧光定量PCR直接检测粪便标本艰难梭菌tcdB基因

目的建立艰难梭菌实时荧光定量PCR检测方法,直接检测粪便标本艰难梭菌tcd B基因,并探讨其应用价值。方法根据艰难梭菌基因组设计tcd B基因特异性引物及探针,用ATCC 43255标准株评价其敏感性,选取艰难梭菌生物学特征相近的临床菌株验证其特异性;收集2015年10-12月临床腹泻患者稀便标本115份,提取基因组总DNA后进行tcd B基因检测,并以产毒培养法为参考方法,探讨该方法的临床诊断价值。结果荧光定量PCR法最低检测限为1×10-3ng,并且仅特异性地扩增产毒艰难梭菌;临床样本评价荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为75.0%、99.1%、85.7%和98.1%。结论实时荧光定量PCR直接检测稀便标本中的艰难梭菌tcd B基因可用于艰难梭菌相关腹泻的快速诊断。     

艰难拟梭菌重命名及相关致病因子研究进展

基于表型特征、化学分类学及系统发育学等研究,艰难梭菌已被归入拟梭菌属,并重命名为艰难拟梭菌.近年来,随着多重耐药艰难拟梭菌不断出现,导致抗生素治疗失效以及感染复发病例明显上升.目前欧美部分国家已建立完善的艰难拟梭菌感染监控体系及相应的临床诊疗指南,但我国相关工作起步较晚.同时,我国仍存在抗生素使用不规范甚至滥用等现象,...     

艰难梭菌毒素基因检测及分子流行病学分析

目的了解腹泻患者艰难梭菌感染现状,并分析分离菌株的核糖体分型情况。方法收集161例住院腹泻患者粪便标本进行艰难梭菌毒素基因PCR检测,同时进行产毒培养法,并比较2种方法的一致性;对分离的艰难梭菌进行核糖体分型。结果艰难梭菌产毒培养法阳性率为9.94%(16/161),粪便艰难梭菌毒素基因阳性率为9.94%(16/161),2种方法结果差异无统计学(P0.05),一致性较好(Kappa0.75)。培养所得18株艰难梭菌中A、B毒素基因均阴性的2株(11.11%),tcdA~+tcdB~+产毒株15株(83.33%),tcdA~-tcdB~+1株(5.56%)。18株艰难梭菌核糖体分型分为16种型别(GS1～GS16),未发现核糖体分型027型菌株。结论艰难梭菌粪便毒素基因PCR检测可用于临床诊断,未发现本院艰难梭菌暴发流行。     

高毒力艰难梭菌的基因型和毒力相关基因检测

目的鉴定莫西沙星耐药的艰难梭菌临床菌株的基因型和毒素相关基因的携带情况。方法 22株莫西沙星耐药的艰难梭菌临床菌株收集自澳大利亚悉尼地区,利用基于荧光毛细管电泳的聚合酶链反应(PCR)-核糖体分型技术对其进行基因分型;利用PCR方法检测其毒素A、B编码基因tcdA、tcdB和二元毒素编码基因cdtA、cdtB;利用PCR-基因测序方法检测毒素调节基因tcdC的基因序列,通过与参考菌株VPI 10463(Genbank收录号:X92982)比对了解其基因突变情况,通过与Genbank中的序列比对确定其序列型。结果 21株菌株为高毒力核糖体型027(RT027),另1株为RT078;22株菌株毒力编码基因均为tcdA+tcdB+cdtA+cdtB+;21株RT027 tcdC序列型为sc1,另1株RT078序列型为WA39,与参考株VPI 10463比较,RT027菌株tcdC序列均出现连续18个核苷酸(nt330-347)的缺失和第117位单核苷酸的缺失,RT078菌株则出现连续39个核苷酸(nt341-379)的缺失和第184位(CT)的突变。结论高毒力RT027是最常见的莫西沙星耐药的艰难梭菌基因型;高毒力RT027和RT078均携带毒素A、B和二元毒素编码基因,且毒素调节基因tcdC均存在基因突变。     

多重PCR检测毒力型艰难梭菌的方法学研究及应用

目的建立多重PCR方法检测毒力型艰难梭菌。方法设计艰难梭菌种特异tpi引物和毒力基因tcdA、tcdB特异性引物,建立多重PCR方法。利用已知菌株,验证方法的特异性和最低检出限。与厌氧培养法、ELISA法比较其检测临床菌株和其毒素分泌的准确性。结果多重PCR方法检测艰难梭菌的最低检出浓度为0．7pg／IM,特异性为100％。53株厌氧培养法鉴定的艰难梭菌临床分离株,多重PCR方法检测tpi基因均为阳性,其中tcdA＋／tcdB＋为39株．tcdA一／tcdB．为14株。ELISA法检测毒素A／B显示23株为阳性、30株为阴性。23株ELISA法毒素A／B阳性的艰难梭菌多重PCR方法检测结果均为tcdA十／配拈＋。结论多重PCR方法可用于检测毒力型艰难梭菌具有较高的临床应用价值。     

基于CRISPR/Cas9技术构建人CLCN7基因编辑载体

目的为修复石骨症致病基因(CLCN7)进行前期探索,采用CRISPR/Cas9技术构建CLCN7基因编辑表达载体。方法根据sgRNA设计原则,在CLCN7外显子区设计一对sgRNA,合成四条单链DNA寡核苷酸,退火后连接于CRISPR/Cas9质粒的BspQ I酶切位点处,然后转染感受态大肠杆菌DH5α,并通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,扩大培养。结果最后经过PCR和Sanger测序鉴定获得了两个基因编辑表达载体CLCN7-sg1RNA-CRISPR-Cas9和CLCN7-sg2RNACRISPR-Cas9。结论基因编辑载体的成功构建为CLCN7突变修复提供了工作基础。     

溃疡性结肠炎患者粪便中艰难梭菌毒素基因A/B携带情况的研究

目的检测溃疡性结肠炎(UC)患者和健康体检者粪便标本中艰难梭菌毒素基因A/B携带情况,探讨艰难梭菌毒素基因携带情况与UC之间的关系。方法收集53例UC确诊患者(活动期32例,静止期21例)和45例健康体检者的粪便标本,提取粪便总DNA,采用荧光定量PCR方法分别检测粪便中艰难梭菌毒素A(cdtA)基因及艰难梭菌毒素B(cdtB)基因,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,并对扩增产物进行测序验证。结果 UC组共检出7例cdtA、4例cdtB,其中UC活动期组5例cdtA、2例cdtB;静止期组2例cdtA、2例cdtB;健康对照组共检出5例cdtA、2例cdtB。UC组cdtA和cdtB检出率与健康对照组比较差异无统计学意义(P0.05);活动期组cdtA和cdtB检出率与静止期组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论粪便中cdtA/B的携带情况与UC发病、疾病分期无明显相关性。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除K562细胞中的SMIM1基因

目的利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,在K562细胞系中敲除编码Vel血型抗原的SMIM1基因。方法设计5条sgRNA序列,构建Cas9-sgRNA共表达质粒,在293T细胞中初步筛选切割效率较高的sgRNA序列。将筛选后的sgRNA通过第二代慢病毒包装系统包装慢病毒并感染K562细胞,提取细胞基因组DNA,进行Sanger测序和TA克隆检测。结果使用易转染的293T细胞建立sgRNA的初步筛选平台,筛选出切割效率较高的sgRNA4序列。CRISPR/Cas9系统成功在K562细胞中SMIM1基因的sgRNA4识别位点发挥基因编辑活性。结论证实了利用CRISPR/Cas9技术在K562细胞中敲除SMIM1基因的可行性,为构建Vel抗原表型阴性的细胞模型奠定基础,也为后续编辑其他血型抗原的基因提供实验依据。     

PCR-核糖体分型技术基因分型艰难梭菌

目的调查区域性的艰难梭菌基因型分布和毒素A、B的携带情况。方法 68株艰难梭菌临床菌株收集自悉尼大学韦斯特米德医院,利用PCR-核糖体分型技术进行基因分型,利用PCR方法检测毒素A、B编码基因tcdA、tcdB。结果 68株菌可分为31种核糖体型(RT),最常见的为RT014(19.1%)和RT002(11.8%);94.1%(64株)的菌株tcdA、tcdB均为阳性。结论悉尼地区主要流行的艰难梭菌基因型为RT014和RT002,绝大部分临床菌株均携带毒素A、B。     

利用CRISPR/Cas9技术建立SOST荧光报告基因i PSCs细胞系

目的利用CRISPR/Cas9技术构建硬骨素(SOST)基因荧光报告诱导性多能干细胞(i PSCs)细胞株。方法使用PCR检测i PSCs分化过程不同阶段成骨基因的表达。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将p2A-td TomatoNeo质粒转染至i PSCs细胞。使用PCR凝胶电泳检测转染的效果,而后分别在光镜下观察成骨不同阶段i PSCs的形态变化、茜素红染色及SOST-td Tomato荧光表达情况,并利用茜素红染色及PCR评估转染细胞的成骨效果及成骨基因表达情况。结果 PCR检测结果发现,SOST只在骨细胞中稳定表达,可作为骨细胞的标志性基因。利用CRISPR/Cas9技术将td Tomato插入到SOST终止密码子处,转染后的i PSCs细胞株不影响其成骨效果及SOST基因的表达。结论利用CRISPR/Cas9技术能够成功构建td Tomato-SOST荧光报告基因的i PSCs细胞株。     

艰难梭菌感染实验室诊断的研究进展

艰难梭菌（C d ）是革兰阳性厌氧芽孢杆菌,能引起伪膜性肠炎等感染性疾病（CDI）。近年来随着抗生素的广泛使用和NAP1／027克隆株在世界范围内传播,CDI发病率和严重程度不断增加。在加拿大、美国和英国相继导致医院内及社区流行,已被公认为发达国家重要的医院内感染病原菌之一［1］。住院患者长期使用抗生素可杀灭肠道内敏感细菌,破坏肠道微生态平衡,导致Cd过度生长并释放毒素,与CDI密切相关的毒素包括T cdA和T cdB。美国感染病协会2010年版的CDI诊断标准包括：（1）有腹泻症状,24 h内排未成形便大于或等于3次;（2）大多数患者近8周内使用过抗生素;（3）粪便中检出产毒型Cd或Cd毒素,或结肠镜检或组织病理检查发现伪膜性肠炎［2］。其中腹泻症状与抗生素使用为非特异指标;病理学检查为有创操作,不适于常规开展。因此,准确、快速的实验室检验结果对CDI诊断和治疗具有重要意义。现有的CDI检测方法种类较多,它们各自有优势和局限性,本文对CDI实验室诊断的研究进展作一综述。     

婴儿艰难梭菌携带状况及菌株特征研究

目的调查婴儿艰难梭菌的携带状况及菌株特征。方法收集2015年8-11月在该院住院或门诊治疗的1岁内婴儿粪便标本238份,利用免疫层析法快速初筛艰难梭菌,阳性标本再利用CDIF平板进行厌氧培养以获得菌株,利用PCR方法检测艰难梭菌毒素A、B的编码基因tcdA、tcdB和二元毒素编码基因cdtA、cdtB,运用slpA测序分型(slpA ST)方法对菌株进行基因分型。结果 238份粪便标本共分离出50株艰难梭菌,3月、3~6月和6月至1岁三组婴儿艰难梭菌的分离率分别为9.3%,17.6%和27.3%,三组见比较差异有统计学意义(χ~2=6.940,P=0.0310.05)。52.0%(26/50)的菌株为产毒株,其中69.2%(18/26)的菌株产毒模式为tcdA+tcdB+cdtA-cdtB-。50株艰难梭菌可分为11种slpA ST型,产毒株最常见的基因型为slpA ST fr-02和kr-02,而非产毒株则为xr-03。结论 1岁内婴儿艰难梭菌携带率较高,且过半为产毒株,大多同时产毒素A和B。产毒株与非产毒株的基因型存在差别。     

抗结核治疗后RT027型艰难梭菌致伪膜性肠炎1例

艰难梭菌(Clostridioides difficile)是一种专性厌氧革兰阳性芽孢杆菌,是造成医院内抗生素相关性腹泻的重要病原菌[1]。长期使用广谱抗生素、免疫抑制剂、质子泵抑制剂或化疗药物等可导致肠道菌群失调,造成产毒艰难梭菌过度繁殖并产生毒素引起艰难梭菌相关性腹泻(Clostridioides difficile associated diarrhea,CDAD)。CDAD的症状轻重不一,可从轻度的腹泻到重度的伪膜性肠炎,甚至引起感染性休克导致死亡[2]。近年来,艰难梭菌高产毒株RT027型在欧洲和北美地区造成了医院感染的暴发流行,引起了世界范围的关注[3]。在国内该型别的报道较少,仅在北京、广州、香港、台湾等地区有少量散发病例报道[4-9]。本文报道1例抗结核治疗后RT027型艰难梭菌引起伪膜性肠炎的病例。     

应用CRISPR/Cas 9 系统构建肺癌细胞系获得AMPKα1 基因敲除的稳定细胞株

目的 利用CRISPR/Cas 9 系统在人肺癌细胞系A549 和H460 中获得敲除腺苷单磷酸活化蛋白激酶α1(adenosine monphosphate-activated protein kinase, AMPKα1) 的稳定表达细胞系。方法 根据CRISPR/Cas 9 靶点设计原则,设计三条引导RNA（sgRNA）,分别构建AMPKα1-CRISPR/Cas9 KO 及其HDR 质粒。将质粒转染至A549 和H460 细胞后,筛选稳定的单克隆细胞株。用Western blot 鉴定筛选获得的肺癌细胞株是否表达AMPKα1。实验被分为原始对照组和敲除组,采用MTT 法检测AMPKα1 的肺癌细胞增殖情况。结果 经过CRISPR/Cas 9 系统处理后,筛选获得的A549 和H460 敲除AMPKα1 稳定细胞株与原始细胞株A549 和H460 相比,Western blot 检测不到AMPKα1蛋白质的表达,差异具有统计学意义(t=137.7, 79.17, 均P ＜ 0.000 1)。MTT 结果显示,筛选获得的A549 和H460 敲除AMPKα1 的稳定细胞株与原始细胞株A549 和H460 相比,敲除细胞株的增殖速度明显减弱,差异具有统计学意义（t=3.956 ～ 28.16,均P ＜ 0.05）。结论 CRISPR/Cas 9 系统成功建立敲除AMPKα1 表达的稳定肺癌细胞株,为进一步研究AMPKα1 在肺癌发生发展中的作用提供细胞模型。     

超声联合生物纳米泡介导基因编辑的实验研究

目的 探讨超声联合生物纳米泡在体外介导基因编辑的可行性.方法 提取生物纳米泡(GVNPs),用阳离子聚合物PEI修饰其表面,再与载有向导RNA(sgRNA)的质粒共孵育构建GVNPs-PEI-DNA(GVPD)转染复合物,通过转染sgRNA进入稳定表达Cas9蛋白的细胞系的方式,介导基因编辑.实验分为空白组(Blank...     

利用CRISPR/Cas9系统敲除ITGB6基因对人结肠癌HT-29细胞生物学行为的影响

目的 探讨整合素β6(ITGB6)基因敲除后对人结肠癌HT-29细胞生物学行为的影响。方法 通过CRISPR/Cas9技术构建ITGB6敲除的HT-29细胞（ITGB6-KO）作为敲除组,选择空白转染细胞作为对照组。通过Western blot法检测ITGB6表达,通过MTT实验、平板克隆形成实验和Transwell侵袭实验检测敲除ITGB6基因对HT-29细胞的增殖能力、克隆形成能力和侵袭能力的影响。结果 Western blot和DNA测序结果显示CRISPR/Cas9技术有效敲除ITGB6基因。MTT实验、平板克隆形成实验和Transwell侵袭实验显示敲除ITGB6基因能够抑制HT-29细胞增殖能力、克隆形成能力和侵袭能力（P <0.01）。结论 CRISPR/Cas9技术能够有效建立敲除ITGB6基因的结肠癌HT-29细胞系,ITGB6敲除后HT-29细胞恶性生物学行为受到抑制,ITGB6基因有望成为结肠癌治疗的潜在靶点。     

应用CRISPR/Cas9基因编辑系统对HEK293细胞系TSC1基因稳定敲除效果的实验鉴定

目的　利用成簇规律间隔短回文重复序列/ 成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白（clustered regularly interspacedshort palindromic repeat/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas9）基因编辑系统在HEK293 细胞系中对TSC1 基因稳定敲除,并对其敲除效果进行鉴定。方法　根据TSC1 基因的序列设计sgRNA,将sgRNA 克隆到载体lentilCRISPRv2 上,将连接产物转化至Stbl3 感受态细胞,对菌液进行测序鉴定。将鉴定成功的lentiCRISPRV2-sgTSC1 质粒转染至HEK293细胞,加入嘌呤霉素进行筛选,挑选单细胞克隆进行PCR 鉴定,选取条带单一的细胞株用Western blot 鉴定TSC1 基因的表达。结果　成功构建lentiCRISPRV2-sgTSC1-1/2 重组质粒,并利用该质粒完成对TCS1 基因的定点切割,Westernblot 结果显示细胞中无TSC1 表达。结论　用CRISPR/Cas9 系统成功构建TSC1 基因敲除的稳定细胞株,为后续实验奠定了基础。     

异基因造血干细胞移植过程中患者艰难梭菌感染与肠道微生态失调关系的临床研究

本研究探讨异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）过程中患者艰难梭菌相关性腹泻（clostridium difficile associated diarrhea,CDAD）与肠道微生态的关系,了解肠道微生态失衡的临床特征,寻找有效防治措施,保护肠道菌群,减少细菌易位及感染的发生。对44例allo-HSCT后腹泻患者采用艰难梭菌毒素A＆B检测试剂盒进行毒素检测,采用厌氧培养方法进行艰难梭菌的分离、鉴定。对患者粪便标本进行肠道微生态研究;采用光冈复合式法对目的菌群（双歧杆菌、乳酸杆菌、类杆菌、消化链球菌、产气荚膜梭菌、肠杆菌、肠球菌、酵母菌）进行定性定量分析。结果表明：44例腹泻患者中共检测出12例艰难梭菌阳性,阳性率为27.27%;CDAD的发生与使用抗生素或化疗药物有关;CDAD患者的肠道微生态发生了明显变化,表现为乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌、肠杆菌等细菌数量明显下降;对CDAD用万古霉素、甲硝唑等药物并配合给予益生菌治疗效果好,但有一定复发率（16.67%）。结论：allo-HSCT并发CDAD与肠道微生态的改变有关,应用敏感抗生素治疗的同时应积极扶植肠道菌群,这样的治疗有利于改善病情和减少复发。     

艰难梭菌肠道感染BALB/c小鼠模型的建立及简易评价

目的 建立简单、可重复的实验室小鼠艰难梭菌感染模型.方法 分别采用链霉素、氨苄西林和万古霉素配制抗生素溶液,经3天自然饮水法破坏BALB/c小鼠肠道正常菌群,更换正常饮水1天后用艰难梭菌进行肠道感染,观察BALB/c粪便细菌载量、小鼠存活状况.结果 经链霉素处理的BALB/c小鼠粪便中艰难梭菌芽孢数最多,万古霉素处理的...     

RNA测序联合CRISPR/Cas9基因编辑技术鉴定调控维甲酸诱导分化功能的miRNA

目的:研究miRNA的敲除对全反式维甲酸(ATRA)介导的急性早幼粒细胞白血病髓系分化的影响,并鉴定具有诱导分化功能的miRNA.方法:首先应用miRNA测序技术分析ATRA作用后miRNA的变化水平.选取上调和下调的miRNA若干,设计合成针对miRNA前体基因序列的sgRNA,通过CRISPR/Cas9技术实现mi...