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相似文献
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1.
目的:对现有常规提取血清microRNA的方法进行改良.方法:运用常规TRIzol法和改良后的血清microRNA提取方法分别提取健康人血清中的microRNA;利用反转录茎环引物及TaqMan探针进行实时荧光定量PCR检测miR-16和miR-21的含量,通过比较miR-16和miR-21的Ct值以鉴定不同提取方法对microRNA检测的影响.结果:改良后的血清microRNA提取方法可明显降低PCR检测中miR-16和miR-21的Ct值.结论:改良的血清microRNA提取方法可有效提高目的microRNA的检出水平.  相似文献   

2.
目的探讨和优化循环miRNA检测方法,为进一步研究循环miRNA作为生物标记物提供方法学基础。方法以miR-16和miR-21为检测目标,通过实时PCR的方法检测其表达量。比较传统Trizol法和miRNA提取试剂盒的miRNA提取效率;比较血清和血浆中miRNA含量;并对基于实时定量PCR(qPCR)的循环miRNA检测方法重复性和敏感性进行评价。结果 miRNA提取试剂盒的miRNA提取效率是传统Trizol法的16 435倍;血浆中miR-16和miR-21qPCR检测的Ct值为25.75±1.83、25.69±2.04,而血清miRNA检测Ct值为27.82±1.03、27.12±1.35,两者相比有显著差异;同一批血浆miR-16两次检测相关系数为0.8885,单个血浆样本10倍梯度稀释后Ct值拟合系数0.9865。结论 Trizol法提取循环miRNA效率低,血浆中miRNA含量较血清稍高,建议选取血浆为标本,通过miRNA提取试剂盒提取miRNA,然后行实时PCR检测其表达,该法具有较高的重复性和敏感性。  相似文献   

3.
目的探讨用实时荧光定量PCR检测急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者血清微小RNA(microRNA,miRNA)的表达并选择最优内参照基因。方法用实时荧光定量PCR检测40例ARDS患者及20例体检健康者血清中5个miRNA候选内参照基因miR-16-5p、miR-93-5p、miR-101-3p、miR-191-5p和U6,并用ge Norm法、Norm Finder法、bestkeeper法和相对△Ct法4种算法分析内参照基因稳定性,通过对4种算法稳定值进行排序并计算几何均数的方法分析综合稳定值。结果比较5个候选内参照基因在ARDS患者和体检健康者的表达水平,差异均无统计学意义(P均0.05)。4种算法综合分析显示,miR-16-5p以最小的稳定值1.32成为综合稳定性最高的内参照基因,其次是miR-101-3p、U6、miR-93-5p和miR-191-5p。结论实时荧光定量PCR法确定ARDS患者血清miRNA最优的内参照基因为miR-16-5p。  相似文献   

4.
目的 建立一种SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测血清miR-21方法,并初步探讨其对乳腺癌诊断的应用价值.方法 用Trizol试剂提取血清总RNA.用茎环引物将miR-16(作为miR-21内参基因)与miR-21分别逆转录成相应cDNA.再用SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR对cDNA进行扩增、检测.然后,通过信噪比(signal to noise ratio,SNR)分析试验的准确性;通过熔解曲线评价试验的特异性;通过标准曲线的R2评估试验的精确性;通过批内和批间差异计算试验的稳定性.另外,用自建方法检测33例乳腺癌患者、18例乳腺良性疾病和49名健康人群血清miR-21和miR-16水平,并根据乳腺癌组与健康对照组中miR-21相对表达量确定临界值,以评价其对乳腺癌诊断的敏感度、特异度.结果 通过PCR退火与延伸在温度和时间上的优化,本试验所建立方法SNR≥99.36%;熔解曲线为单峰;标准曲线R3=0.994 8;批内CV< 1.5%,批间CV< 4%.以miR-16为内参,用自建SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测乳腺癌组、良性疾病组与健康对照组血清miR-21的相对表达量分别为20.83±18.18、20.86±10.11和9.33±4.44,经Kruskal Wallis检验,3组间表达量差异有统计学意义(x2=16.92,P<0.001),且健康对照组与乳腺癌组、健康对照组与良性疾病组间的差异均有统计学意义(Z值分别为-2.58、-4.42,P均≤0.01),而乳腺癌组与良性疾病组血清miR-21表达量差异无统计学意义(Z=-0.51,P=0.608).以miR-21相对表达量18.32为临界值,其对乳腺癌诊断的敏感度为51.5%(17/33),特异度为93.9%(46/49).结论 建立了一种较敏感、特异、稳定的SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR检测血清miR-21方法,该方法对乳腺癌的诊断可能有一定价值.  相似文献   

5.
田国忠 《疾病监测》2020,35(3):246-250
目的建立一种具有灵敏性高,特异性强的巢式聚合酶链式反应(PCR)方法检测血液标本中布鲁氏菌核酸DNA。方法使用细菌基因组提取试剂盒提取纯菌核酸DNA;使用血液等组织基因组核酸DNA提取试剂盒提取血液标本核酸DNA,对提取的核酸DNA先行常规PCR预扩增,以扩增的PCR产物为模板进行荧光定量PCR第二次扩增(即巢式PCR)。对纯菌提取的核酸DNA进行灵敏度和和特异性测试,构建巢式PCR的Ct值与核酸DNA拷贝数之关系曲线;检测临床血液标本核酸DNA,同时比较常规两种PCR方法检测结果。结果常规PCR检测的灵敏度为512个核酸DNA拷贝数;巢氏PCR检测有效范围为921.6 ng/μl^6.8 fg/μl,对应的Ct值为12.04~37.50,其指数关系为:y=(e-0.695x)×1012;R2=0.9986,巢式PCR扩增效率为2.28×109倍,检测限为2个布鲁氏核酸DNA拷贝数。巢式PCR的灵敏度为91.67%,特异度为93.10%,阳性预测值为91.67%,阴性预测值为93.10%。对一起羊养殖场采集的25份血液标本应用巢式PCR方法检测,结果阳性率为92.00%(23/25);27份健康人群血液标本没有检测出(无Ct值)。结论巢式PCR具有较好的灵敏性和特异性,特别适合于血液标本布鲁氏菌核酸DNA的检测。  相似文献   

6.
7.
摘要:目的:建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测宫颈疾病患者血清中miR-21的表达水平,探讨miR-21在宫颈癌临床监测中的意义。 方法:设计miR-21、U6茎环逆转录引物和PCR扩增引物,以U6为内参,用实时荧光定量PCR检测32例不同宫颈疾病患者血清中miR-21表达水平。 结果:建立的实时荧光定量PCR法能特异地检测血清中的miR-21扩增信号,熔解曲线单一,产物特异。宫颈癌患者血清中miR-21水平明显高于子宫肌瘤、宫颈炎等其他良性宫颈疾病(P<0.05),而宫颈癌患者手术切除后血清中miR-21水平明显下降(P<0.05)。 结论:SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR是一种快速简便、敏感性高、特异性好的检测方法,对宫颈癌早期诊断、分子分期和预后判断有很好的应用前景。  相似文献   

8.
目的对3种血浆微小RNA(miRNA)提取方法进行评价。方法运用国产、进口硅胶吸附柱法和TRIzol法分别提取20名志愿者血浆中的miRNA;利用TaqMan聚合酶链反应(PCR)检测提取物中的β-globin基因含量,观察提取物中RNA的纯度;利用反转录茎环引物及TaqMan-MGB探针q PCR检测提取物中miRNA-21含量,观察miRNA提取的效率。结果国产、进口硅胶吸附柱法及TRIzol法提取液中β-globin基因的Ct值分别为35.487±0.356、35.591±0.332和33.529±0.499,3种方法的Ct值差异有统计学意义(P0.001);国产和进口硅胶吸附柱方法的β-globin基因Ct值均明显高于TRIzol法(P0.000 1);而国产与进口硅胶吸附柱法β-globin基因Ct值差异无统计学意义(P=0.345 4)。国产、进口硅胶吸附柱法和TRIzol法miRNA-21的Ct值分别为26.527±0.158、26.653±0.201和28.169±0.385,3种方法的Ct值差异有统计学意义(P=0.000 3);国产和进口硅胶吸附柱法miRNA-21的Ct值均明显低于TRIzol法(P0.000 1);国产硅胶吸附柱法miRNA-21的Ct值低于进口硅胶吸附柱法(P=0.033 7)。结论硅胶吸附柱法可有效提高miRNA的提取效率和纯度。国产硅胶吸附柱法完全可以取代进口硅胶吸附柱法。  相似文献   

9.
目的分析外泌体miR-9-3p在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)血清中的表达水平,探讨血清外泌体miR-9-3p检测在NSCLC诊断中的临床意义。方法收集2016年1月至2017年12月在山东省青岛疗养院诊疗的80例NSCLC患者(NSCLC组)、50例肺部良性病变患者(良性对照组)为研究对象,美国Invitrogen;总外泌体分离试剂盒提取两组患者血清外泌体,使用miRcute miRNA提取分离试剂盒从外泌体中提取miRNA,实时荧光定量PCR检测两组miR-9-3p水平,Spearman相关分析NSCLC血清miR-9-3p与常规标志物癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段抗原21-1(CYFR A21-1)水平相关性,评价血清外泌体miR-9-3p联合CEA、CYFR A21-1检测诊断NSCLC的价值。结果NSCLC患者血清miR-9-3p水平明显高于良性对照组;NSCLC患者血清外泌体miR-9-3p水平与CEA、CYFRA21-1水平具有明显相关性(P<0.01);血清miR-9-3p联合CEA、CYFR A21-1检测诊断NSCLC的敏感性、准确性、阴性预测值与各单项检测比较明显提高(P<0.01),分别为95.00%、91.54%、91.49%。结论血清外泌体miR-9-3p可作为诊断NSCLC的新型标志物,联合常规标志物检测明显提高诊断NSCLC效能。  相似文献   

10.
目的 检测窒息新生儿血清miR-21,miR-210和miR-424的表达水平,为microRNA在新生儿窒息的早期诊断和治疗提供理论依据.方法 运用RT-PCR方法检测62例窒息新生儿血清microRNA的表达水平.根据出生时Apgar评分,分为轻度窒息组45例,重度窒息组17例和30例健康孕妇脐血,以U6snRNA为内参,检测miR-21,miR-210和miR-424在血清中的表达水平.结果 3种microRNA在所有组中均可检测到,与对照组比较,miR 21和miR 210在窒息患儿血清中表达水平上调4.57±0.41和4.18±0.32倍(t=3.02,2.72,P<0.05),且重度窒息组高于轻度窒息组(t=2.23,2.25,P<0.05).miR 424表达水平无差异(1.34±0.19,t=0.29,P>0.05).结论 miR 21和miR-210在窒息患儿血清中表达上调,与病情严重性正相关,检测其在血清中的表达量对新生儿窒息的早期诊断与预后判断具有重要的临床意义.  相似文献   

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