成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

目的：研究体外培养的成人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法：从骨髓血中提取hMSCs,在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养,以流式细胞仪检测hMSCs的表面抗原表达.传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养,相差显微镜观察并绘制生长曲线.免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素.NAP法碱性磷酸酶染色、vonKossa法钙结节染色.结果：hMSCs增殖活跃,CD105、CD44表达阳性, CD14、CD34和CD45阴性.诱导培养后碱性磷酸酶、钙结节、Ⅰ型胶原和骨钙素染色阳性.结论：hMSCs取材方便,易诱导分化为成骨细胞,是研究骨组织工程的理想种子细胞.[     

人骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的形态学研究

目的:研究人骨髓间质干细胞(hMSCs)体外培养并向成骨细胞表型转化过程中的形态学改变。方法:在成骨特定诱导培养液中培hMSCs。在相差显微镜和电子显微镜下观察细胞形态,苏木精-伊红染色观察形态,组织化学法检测碱性磷酸酶(ATP)、Ca结节染色,免疫组化检测Ⅰ型胶原(COLⅠ)、骨钙素(OC)表达。结果:诱导培养的hMSCs形态由成纤维样梭形向多边形转变,透射电镜观察见大量扩张的粗面内质网、高尔基体、线粒体和钙盐沉积,扫描电镜见细胞表面有大量钙盐颗粒。诱导培养后7,14,21d可见ALP染色、COLⅠ免疫组化染色阳性,诱导培养后14,21d可见OC免疫组化染色、Ca结节染色阳性。结论:hMSCs在特定培养液诱导下可表现为典型的成骨细胞形态,可作为骨组织工程的种子细胞。     

人骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的形态学研究

目的：研究人骨髓间质干细胞(hMSCs)体外培养并向成骨细胞表型转化过程中的形态学改变。方法：在成骨特定诱导培养液中培hMSCs。在相差显微镜和电子显微镜下观察细胞形态，苏木精-伊红染色观察形态，组织化学法检测碱性磷酸酶(ATP)、Ca结节染色．免疫组化检测Ⅰ型胶原(COL Ⅰ)、骨钙素(OC)表达。结果：诱导培养的hMSCs形态由成纤维样梭形向多边形转变，透射电镜观察见大量扩张的粗面内质网、高尔基体、线粒体和钙盐沉积，扫描电镜见细胞表面有大量钙盐颗粒。诱导培养后7，14，2ld可见ALP染色、COL Ⅰ免疫组化染色阳性，诱导培养后14，21d可见OC免疫组化染色、Ca结节染色阳性。结论：hMSCs在特定培养液诱导下可表现为典型的成骨细胞形态，可作为骨组织工程的种子细胞。     

中药生肌液对体外培养兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响

背景：在临床工作中，外用中药生肌膏能治疗感染开放性骨折引起的骨缺损。其机制可能为生肌膏中作者前期实验从生肌膏的原料生药中提取了生肌液，并证实不同浓度的生肌液对骨髓间充质干细胞的增殖活性影响不同。有效成分促进骨髓间充质干细胞的增殖，并诱导其向成骨细胞转化。目的：观察生肌液对体外培养的兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响。设计：单一样本实验。单位：天津市天津医院骨科研究所。材料：实验于2004—10／2005—12在天津市天津医院骨科研究所细胞工程室完成。骨髓间充质干细胞取自5只3月龄的雄性健康日本大耳白兔。浓度为5×10^2g／L生肌液从生肌象皮膏（由天津市中药饮片厂提供。原料生药当归、生地、龟板、象皮、血余）提取。方法：将25，8．3，5g／L的生肌液作用于兔骨髓间充质干细胞，以不含生肌液的基础培养液为空白对照，以含地塞米松10^-8mol／L，维生素C0．05g／L，β-甘油磷酸钠10mmol／L的基础培养液为标准对照。将不同干预条件下传代后的骨髓间充质干细胞接种在培养板中培养二三周，采用荧光倒置显微镜下观察钙结节形成情况，采用四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色观察细胞的表达情况，取细胞培养液测定胞外及胞内碱性磷酸酶、骨钙素、乳酸脱氢酶含量，将细胞内外碱性磷酸酶、骨钙素、乳酸脱氢酶数量各自加和，计算碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶值。主要观察指标：培养2，3周兔骨髓间充质干细胞钙结节形成、四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色结果及碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶值。结果：①细胞钙结节观察结果：除了标准对照细胞外，不同浓度生肌液条件下细胞随培养时间延长，胞体先后出现拉长，聚集生长，随后中心细胞增殖、重叠，细胞之间界限模糊，逐渐形成多个散在的细胞结节，钙沉积逐渐出现，最终形成钙化结节。②四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色：除了基础培养液组外，各实验组四环素标记呈阳性的细胞及钙结节在荧光激发下呈黄绿色，空白对照细胞为阴性；除了标准对照细胞外，不同浓度生肌液条件下细胞胶原Ⅰ免疫组织化学染色呈阳性，棕黄色深染颗粒位于细胞胞浆中。③碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶检测结果：条件培养后2，3周，25g／L生肌液作用下细胞碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶比值高于其他条件下两种含量比值，差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论：生肌液对体外培养的兔骨髓间充质干细胞的诱导成骨作用肯定，且高浓度时诱导成骨作用较强。     

中药生肌液对体外培养兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响(英文)

背景:在临床工作中,外用中药生肌膏能治疗感染开放性骨折引起的骨缺损。其机制可能为生肌膏中作者前期实验从生肌膏的原料生药中提取了生肌液,并证实不同浓度的生肌液对骨髓间充质干细胞的增殖活性影响不同。有效成分促进骨髓间充质干细胞的增殖,并诱导其向成骨细胞转化。目的:观察生肌液对体外培养的兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响。设计:单一样本实验。单位:天津市天津医院骨科研究所。材料:实验于2004-10/2005-12在天津市天津医院骨科研究所细胞工程室完成。骨髓间充质干细胞取自5只3月龄的雄性健康日本大耳白兔。浓度为5×102g/L生肌液从生肌象皮膏(由天津市中药饮片厂提供,原料生药当归、生地、龟板、象皮、血余)提取。方法:将25,8.3,5g/L的生肌液作用于兔骨髓间充质干细胞,以不含生肌液的基础培养液为空白对照,以含地塞米松10-8mol/L,维生素C0.05g/L,β-甘油磷酸钠10mmol/L的基础培养液为标准对照。将不同干预条件下传代后的骨髓间充质干细胞接种在培养板中培养二三周,采用荧光倒置显微镜下观察钙结节形成情况,采用四环素标记及胶原Ι免疫组织化学染色观察细胞的表达情况,取细胞培养液测定胞外及胞内碱性磷酸酶、骨钙素、乳酸脱氢酶含量,将细胞内外碱性磷酸酶、骨钙素、乳酸脱氢酶数量各自加和,计算碱性磷酸酶/乳酸脱氢酶、骨钙素/乳酸脱氢酶值。主要观察指标:培养2,3周兔骨髓间充质干细胞钙结节形成、四环素标记及胶原Ι免疫组织化学染色结果及碱性磷酸酶/乳酸脱氢酶、骨钙素/乳酸脱氢酶值。结果:①细胞钙结节观察结果:除了标准对照细胞外,不同浓度生肌液条件下细胞随培养时间延长,胞体先后出现拉长,聚集生长,随后中心细胞增殖、重叠,细胞之间界限模糊,逐渐形成多个散在的细胞结节,钙沉积逐渐出现,最终形成钙化结节。②四环素标记及胶原Ι免疫组织化学染色:除了基础培养液组外,各实验组四环素标记呈阳性的细胞及钙结节在荧光激发下呈黄绿色,空白对照细胞为阴性;除了标准对照细胞外,不同浓度生肌液条件下细胞胶原Ι免疫组织化学染色呈阳性,棕黄色深染颗粒位于细胞胞浆中。③碱性磷酸酶/乳酸脱氢酶、骨钙素/乳酸脱氢酶检测结果:条件培养后2,3周,25g/L生肌液作用下细胞碱性磷酸酶/乳酸脱氢酶、骨钙素/乳酸脱氢酶比值高于其他条件下两种含量比值,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:生肌液对体外培养的兔骨髓间充质干细胞的诱导成骨作用肯定,且高浓度时诱导成骨作用较强。     

同种异体颗粒骨对骨髓基质细胞影响的实验研究

目的 探讨同种异体颗粒骨对骨髓基质细胞粘附及分化的影响。方法 本实验取同种异体白兔皮质骨造成骨颗粒(直径100μ-500μ)，经低温冷冻(-70℃)一周后，与骨髓基质细胞(第二代)相结合进行体外培养(设为实验组)；另取未复合骨颗粒的骨髓基质细胞行体外培养(设为对照组)。两周后，倒置显微镜观察、光镜、四环素荧光标记、扫描电镜、透射电镜、碱性磷酸酶染色等方法观测骨髓基质细胞的粘附及分化情况。结果 实验：光镜及电镜观察，细胞紧密贴附于骨颗粒表面，细胞体积较大，胞浆丰富，内含丰富的核糖体、粗面内质网、高尔基复合体和线粒体，部分线粒体基质内有致密的颗粒状沉积：四环素荧光染色后，有金黄色荧光结节出现；碱性磷酸酶染色显示，阳性率大于百分之七十。对照组：电镜观察，细胞多呈长梭型，核大，可见核仁，胞浆内有核糖体、线粒体、内质网；四环素染色呈阴性；碱性磷酸酶染色率为百分之四十。结论 同种异体颗粒骨可诱导骨髓基质细胞向成骨细胞转化；同种异体颗粒骨与骨髓基质细胞之间有较强的粘附作用；同种异体颗粒骨可用作骨组织工程细胞外基质替代物。     

人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

背景：骨形态发生蛋白质是目前发现惟一的一类具有成骨能力的细胞因子，它能刺激基质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞方向分化。目的：应用基因工程方法，观察人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向分化。设计：单一样本观察。 单位：中山大学附属第一医院骨科。材料：pcDNA1．1／AMP-hBMP7质粒。 方法：实验于2004-05／2005-03在中山大学附属第一医院外科实验室完成。全骨髓培养法培养兔骨髓基质干细胞，在体外分别转染poD．NA1．1／AMP-hBMP7和pcDNA1．1／AMP并留置空白对照。检测转染基因的转录和表达，观察细胞形态和生长情况，通过对感染细胞的碱性磷酸酶染色、钙盐染色、电镜观察胞质中钙质成分以及检测骨钙素鉴定其成骨分化表型。 主要观察指标：①兔骨髓基质干细胞的形态及生长。②表达产物的鉴定。③碱性磷酸酶染色（钙钴法）结果。④茜素红染色结果。⑤透射电镜观察结果。⑥扫描电镜观察结果。⑦骨钙素的测定结果。 结果：人骨形态发生蛋白质7基因存在于转染后的骨髓基质干细胞中并表达相应的mRNA。目的基因表达后的细胞形态略有变化，但生长曲线与未转染组无明显变化。骨钙素表达较未转染组明显增强。转染组细胞的碱性磷酸酶染色和钙盐染色均为阳性。 结论：人骨形态发生蛋白质7基因转染可促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞表型分化。     

人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

背景骨形态发生蛋白质是目前发现惟一的一类具有成骨能力的细胞因子,它能刺激基质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞方向分化.目的应用基因工程方法,观察人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向分化.设计单一样本观察.单位中山大学附属第一医院骨科. 材料pcDNA1.1/AMP-hBMP7质粒.方法实验于2004-05/2005-03在中山大学附属第一医院外科实验室完成.全骨髓培养法培养兔骨髓基质干细胞,在体外分别转染pcD-NA1.1/AMP-hBMP7和pcDNA1.1/AMP并留置空白对照.检测转染基因的转录和表达,观察细胞形态和生长情况,通过对感染细胞的碱性磷酸酶染色、钙盐染色、电镜观察胞质中钙质成分以及检测骨钙素鉴定其成骨分化表型.主要观察指标①兔骨髓基质干细胞的形态及生长.②表达产物的鉴定.③碱性磷酸酶染色(钙钴法)结果.④茜素红染色结果.⑤透射电镜观察结果.⑥扫描电镜观察结果.⑦骨钙素的测定结果.结果人骨形态发生蛋白质7基因存在于转染后的骨髓基质干细胞中并表达相应的mRNA.目的基因表达后的细胞形态略有变化,但生长曲线与未转染组无明显变化.骨钙素表达较未转染组明显增强.转染组细胞的碱性磷酸酶染色和钙盐染色均为阳性.结论人骨形态发生蛋白质7基因转染可促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞表型分化.     

脂质体介导的rhIGF-1基因对成骨细胞增殖分化的影响

目的探讨重组人胰岛素生长因子（rhIGF-1）基因对体外培养大鼠成骨细胞增殖分化的影响。方法采用酶消化法获取大鼠乳鼠颅骨成骨细胞，传至第3代进行成骨细胞鉴定，钙化结节用茜素红（ARS）染色，钙钴法显示成骨细胞中碱性磷酸酶（ALP）的表达。用脂质体法将pcDNA3．1-rhIGF-1质粒转染成骨细胞。倒置显微镜下观察细胞的生长形态，MTT法检测成骨细胞增殖情况，碱性磷酸酶及骨钙素（OCN）测定成骨细胞活性。结果建立了稳定的大鼠成骨细胞模型；pcDNA3．1-rhIGF-1质粒转染组与对照组及空质粒pcDNA3．1组比较成骨细胞增殖旺盛、ALP和OGN的分泌增加，有显著性差异（P〈0．01）。结论外源性rhIGF-1基因能够刺激大鼠成骨细胞增殖、分化，促进骨形成。     

人颌骨骨膜成骨细胞的体外分离与培养

目的探讨人下颌骨骨膜分离培养成骨细胞的可行性。方法切取人健康的下颌骨骨膜，用胰酶、胶原酶分步消化法分离出成骨细胞，利用差异贴附原理对分离出的细胞进行纯化，对成骨细胞进行体外培养与扩增，倒置显微镜下观察细胞的生长、增殖与黏附情况，利用碱性磷酸酶染色和免疫组织化学方法检测人成骨细胞Ⅰ型胶原表达来对成骨细胞进行鉴定。结果人下颌骨骨膜成功分离出成骨细胞并进行体外培养与扩增，免疫组化学方法检测出Ⅰ型胶原表达，碱性磷酸酶染色阳性反应率达95％以上。结论自人下颌骨骨膜分离培养成骨细胞的方法切实可行。     

人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞及鉴定

目的探讨5-氮胞苷作为诱导剂体外诱导人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)分化为心肌样细胞,并对其进行鉴定。方法采用密度梯度离心法与贴壁培养法相结合分离培养hMSCs,以5-氮胞苷诱导第3代hMSCs,24h后继续培养,观察细胞形态学的变化;培养4周,采用免疫细胞化学法对分化的心肌样细胞特异性蛋白结蛋白、心肌肌钙蛋白I进行鉴定。结果培养7d后hMSCs贴壁呈集落生长,有成纤维细胞样外观;5-氮胞苷诱导7d后细胞呈梭形,排列方向渐趋一致,有肌管样结构形成,免疫细胞化学法检测人心肌特异性蛋白结蛋白、心肌肌钙蛋白I表达阳性,而未经诱导的相同培养时间的hMSCs中均未见表达。结论 hMSCs体外在5-氮胞苷诱导下可定向分化为心肌样细胞。     

骨髓基质干细胞成骨分化过程中Wnt、骨形态发生蛋白2信号通路相关因子与辛伐他汀的作用

背景：辛伐他汀可促进体外培养的人或鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,但作用机制尚不清楚。目的：观察辛伐他汀对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中Wnt与骨形态发生蛋白2信号途径中相关因子表达的影响。方法：取6周龄雌性SD大鼠双侧股骨、胫骨全骨髓进行体外成骨细胞诱导培养。实验分为对照组及SIM组。SIM组加入浓度为10-7mol/L辛伐他汀,对照组加入等量无水乙醇和PBS。培养14d,行碱性磷酸酶染色,28d时,行vonKossa染色观察细胞外基质矿化情况;培养14,21d,免疫荧光细胞化学染色观察成骨细胞中β-catenin,Smad1/5,Cbfa1的表达及分布。结果与结论：大鼠骨髓基质干细胞经体外诱导后可分化为具有碱性磷酸酶活性和矿化细胞外基质能力的成熟成骨细胞。辛伐他汀可显著上调骨髓基质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶的表达。同时,与对照组比较,SIM组β-catenin,Smad1/5,Cbfa1表达明显增多（P〈0.05）,且呈现明显的核内聚集趋势。说明辛伐他汀促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的作用可能与调控Wnt与骨形态发生蛋白2信号通路中相关因子的表达及细胞内分布有关。     

人骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化的能力

背景:利用骨髓间质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的多向分化性,选择合适的生物材料和适当的生长因子联合应用,可达到修复组织缺损的目的,MSCs细胞具有取材方便,对身体健康损害小,来源于自体干细胞诱导构建的组织不存在MHC限制等优点,所以日益受到人们的重视。目的:探讨人骨髓间充质干细胞向成骨和成软骨细胞诱导分化的能力。设计:单一样本研究。单位:苏州大学附属儿童医院骨科,苏州大学生命科学院生物技术研究所。材料:RPMI1640完全培养基,地塞米松,β-甘油磷酸钠,抗坏血酸,鼠抗人一抗,羊抗鼠二抗,链球菌亲和素(三抗),DAB(1:50),100mL/L胎牛血清,维生素C,转化生长因子-β1(TGF-β1)等。方法:选用不同代次的MSCs细胞,分别使用成骨和成软骨条件培养基培养,观察细胞的形态学变化,同时采用细胞化学和免疫组化的方法检测碱性磷酸酶,钙盐沉积,糖胺多糖分泌和I,Ⅱ胶原的表达。主要观察指标:骨髓基质干细胞向成骨细胞分化;骨髓基质干细胞向成软骨细胞分化。结果:MSCs细胞在地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠的作用下,15d后可见细胞变为多边形,ALP和I型胶原染色阳性,形成钙结节,表现成骨细胞分化特点;而在维生素C和TGF-β1的作用下,7d可见细胞多为圆形,糖胺多糖和II型胶原染色阳性,表现成软骨细胞分化特点。     

骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞与血管内皮生长因子基因整合的研究

目的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）在药物诱导下定向分化为成骨细胞,对其进行血管内皮生长因子（VEGF）基因片段转染,观察其生物学特性的变化。方法选择MSCs体外培养的第2代细胞诱导其向成骨细胞分化,实验分为对照组和地塞米松浓度1×10-8mol/L诱导组。对诱导分化后的成骨细胞进行碱性磷酸酶（ALP）染色和活性测定及I型胶原的免疫组化染色、茜素红钙节结染色的鉴定。对诱导后的成骨细胞进行已构建的VEGF基因片段（ad5-h-VEGF）的人5型腺病毒载体进行转染,并进行免疫组化鉴定。结果诱导培养第3、6、9、12天的ALP活性（A405）测定,地塞米松浓度1×10-8mol/L组测定值（A值）分别为0.144±0.004、0.175±0.003、0.207±0.010、0.224±0.004;对照组分别为0.101±0.003、0.124±0.016、0.133±0.005、0.139±0.005。两组在组间、不同时点以及组间和不同时点的交互作用差异均有统计学意义（P〈0.05）。MSCs经地塞米松的成骨诱导剂诱导7~9天可出现碱性磷酸酶染色阳性,连续培养20天后可出现茜素红钙节结染色阳性。转染后细胞VEGF免疫组化染色阳性。结论对骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞作ad5-h-VEGF基因转染,可使诱导的成骨细胞胞浆中VEGF阳性表达。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:采用地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C3种物质作为诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化的基本辅剂,定向诱导犬第2代BMSCs,探讨BMSCs向成骨细胞分化的潜能和成骨细胞的特征性鉴定方法.方法:无菌条件下行犬髂骨穿刺,采集骨髓15～ 20 mL,全骨髓10％ FBS DMEM培养液进行原代培养.将第2代纯化的BMSCs细胞悬液(调整细胞密度为1×105/mL)接种于含地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C的DMEM/FI2培养液的培养瓶(皿)中,体外扩增培养、传代.对细胞形态特征进行观察;行碱性磷酸酶(ALP)染色,骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白免疫荧光化学检测鉴定细胞性质.结果:原代培养的BMSCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长.诱导分化后的细胞形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长,传代后细胞体积略变大;BMSCs成骨诱导增殖后电镜下细胞呈多边形,可见ALP染色阳性;经成骨细胞诱导培养14 d后,细胞骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白表达阳性.结论:BMSCs易于体外分离培养及扩增,地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C体外定向诱导能够在短时间内获得大量成骨细胞,且所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能.     

腺病毒介导入血管内皮生长因子_165基因转染促进人骨髓间充质干细胞的成骨特点

目的：课题组以前的实验证实，人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒可高效感染人骨髓间充质干细胞，使之大量表达人血管内皮生长因子165，促进局部新生血管生成，有利于组织修复。实验观察腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响。 方法：实验于2005—03／2006—01在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和创伤骨科完成。人骨髓间充质干细胞取自健康成年男性自愿者，得到医院伦理道德委员会批准。将人骨髓间充质干细胞体外扩增纯化后随机分为4组：①人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组。②β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组。③阳性对照组：培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠。④空白对照组：不给予特殊处理。各组细胞处理后12d，应用全自动生化分析仪检测各组培养上液碱性磷酸酶活性；于处理后14d，应用VonKossa染色法检测人骨髓间充质干细胞中骨胶原结节形成情况。 结果：①经多次换液传代，人骨髓间充质干细胞呈均一梭形形态。处理后人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平，突起减少；β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组形态无明显变化。②Yon Kossa染色人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成，明显多于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组。③人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组培养上清碱性磷酸酶活性显著高于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组（F=165．18，P=0．00）。结论：人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒基因转染对人骨髓间充质于细胞成骨能力具有促进作用，验证了转染人血管内皮生长因子165的人骨髓间充质干细胞移植治疗骨?     

比较3种形态学方法观察成骨细胞矿化结节的应用价值

背景：矿化结节是成骨细胞分化成熟的标志,以往观察方法多采用茜素红等特殊染色法。目的：比较茜素红染色-光镜、四环素荧光标记-激光扫描共聚焦显微镜、扫描电镜3种形态学观察成骨细胞矿化结节的方法,分析各自的特点及在骨病研究中的应用价值。方法：将大鼠成骨细胞株UMR-106正常培养、每天换液,连续培养14 d,分别采用茜素红染色-光镜、四环素荧光标记-激光扫描共聚焦显微镜、扫描电镜观察矿化结节的形态结构,并利用扫描电镜结合能谱仪原位定量分析钙元素;此外,在培养中加入可抑制成骨细胞增殖、分化的肿瘤坏死因子α作为对照实验。结果与结论：3种观察方法均可观察到正常成骨细胞矿化结节的形态结构。对于肿瘤坏死因子α抑制成骨细胞产生矿化结节的情况,经茜素红染色-光镜观察法,未见明显的矿化结节;而四环素荧光染色-激光扫描共聚焦显微镜观察法,可见清晰、稀少的矿化结节;扫描电镜观察法明显可见较少而细小的矿化结节,提示后二种方法灵敏度较高。此外,扫描电镜可将观察成骨细胞分泌钙质、形成矿化结节的亚细胞结构,与能谱元素分析结合,可实现矿化结节的定位与定量,在骨病研究中值得推广应用。     

荧光活性染料DiI标记的大鼠骨髓基质干细胞生长增殖及其成骨分化

背景：目前关于骨髓基质干细胞的标记报道较多,各有其优缺点,寻找一种有效、简便的细胞标记与示踪的方法尤为关键。目的：观察经荧光活性染料DiI标记的大鼠骨髓基质干细胞生长增殖与成骨分化情况。设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-09/12在南方医科大学组织工程研究中心完成。材料：SD大鼠10只,由南方医科大学实验动物中心提供。DiI应用液为美国Molecular ProbeInc公司产品。方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞,加入无血清的DMEM制成细胞悬液,再加入1×109L-1的DiI应用液5μL,37℃下孵育25min,清洗离心后,加入DMEM高糖完全培养基,荧光显微镜观察细胞荧光强度及形态变化。另取传至第3代细胞,加入含地塞米松、维生素C、β-磷酸甘钠、体积分数为10%胎牛血清的成骨诱导剂进行诱导分化。主要观察指标：DiI标记后细胞形态变化,XTT比色法测定细胞增殖状况,细胞上清液中乳酸脱氢酶活性,成骨诱导后细胞碱性磷酸酶活性及成骨分化能力。结果：锥虫蓝染色见骨髓基质干细胞活力好,仅偶见蓝染细胞,荧光显微镜下DiI标记后全部细胞的胞浆、胞膜均显红色荧光,标记的骨髓基质干细胞呈梭形,胞浆丰富,保持了良好的正常形态,DiI标记阳性率为100%,标记早期细胞形态呈荧光环状,48h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光。与未标记细胞比较,DiI标记的骨髓基质干细胞增殖吸光度、培养上清液乳酸脱氢酶活性、碱性磷酸酶活性均无明显变化（P〉0.05）。成骨诱导7d后,钙钴法染色两组骨髓基质干细胞均见不同程度的胞质呈棕黑色改变。结论：DiI能有效标记体外培养的骨髓基质干细胞,并在细胞内稳定表达,且标记细胞形态良好,对活体细胞无毒性作用;此外,DiI标记不影响骨髓基质干细胞的生长、增殖及成骨分化能力。     

端粒酶逆转录酶基因修饰人骨髓间质干细胞的实验

背景:人骨髓间充质干细胞经过有限次的细胞传代后,就会停止增殖,发生衰老和死亡。有研究表明,端粒与细胞寿命的控制密切相关,是否可通过外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达,诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性,维持端粒长度的稳定,从而延长人骨髓间充质干细胞的生命周期并保持其多潜能分化特性?目的:观察外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达对人骨髓间质干细胞端粒酶活性及细胞生命周期的影响。设计:重复测量实验。单位:郑州大学医学院干细胞研究中心。材料:实验于2003-10/2005-12在郑州大学医学院干细胞研究中心完成。人骨髓间质干细胞采自郑州大学第一附属医院及第三附属医院小儿外科和门诊20名健康志愿者。增强型绿色荧光蛋白-C1质粒和增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒由加拿大Dr.ChantalAutexier馈赠。DH5α菌株由郑州大学医学院重点分子医学实验室侯卫红博士馈赠。方法:无菌条件下,抽取健康志愿者胸骨骨髓2mL,经离心、洗涤及传代培养后备用。①阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果:将第5代人骨髓间充质干细胞接种至24孔培养板中,将携带有增强型绿色荧光蛋白报告基因和人端粒酶逆转录酶目的基因的质粒pEGFP-人端粒酶逆转录酶通过脂质体转染法转入人骨髓间充质干细胞中,转染共分4组:正常对照组、脂质体组、增强型绿色荧光蛋白-C1质粒组、增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒组,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选与扩增。②人骨髓间充质干细胞转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶活性的检测:通过RT-PCR和PCR-ELISA对选用转染增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转H人骨髓间充质干细胞第5代)、转染增强型绿色荧光蛋白-C1质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转C人骨髓间充质干细胞第5代)、未转染的第10代人骨髓间充质干细胞、K562细胞(阳性对照)转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达情况,对转H第5及30代人骨髓间充质干细胞、转C第5代人骨髓间充质干细胞及未转染的第10代人骨髓间充质干细胞端粒酶活性的影响进行检测。③转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析:采用胰蛋白酶-Giemsa染色法转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析。④转H人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞及RT-PCR鉴定:将转染细胞在重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的联合诱导下向神经元样细胞定向诱导分化,并用RT-PCR进行鉴定(蛋白微管相关蛋白和神经丝亚单位M表达)。主要观察指标:①不同转染组阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果。②不同转染组人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶的活性。③转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析结果。④转H人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞及RT-PCR鉴定结果。结果:①随G418浓度的下降,正常对照组、脂质体组细胞全部死亡,从而得到稳定表达增强型绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞;经G418加压筛选后得到1个连续传到第35代且生长旺盛的抗性细胞克隆,倒置显微镜下观察与未转染人骨髓间充质干细胞相比无明显差异。②转C第5代人骨髓间充质干细胞和未转染第10代人骨髓间充质干细胞的人端粒酶逆转录酶mRNA表达阴性,而K562和转H第5代人骨髓间充质干细胞的人端粒酶逆转录酶mRNA表达阳性。③转H第5代人骨髓骨髓间充质干细胞组和转H第30代人骨髓间充质干细胞端粒酶为阳性。④转H人骨髓间充质干细胞第10,20,30代的染色体总数均为23对,且含2条X性染色体,仍为正常2倍体,染色体形态和数目均正常。⑤较多转H人骨髓间充质干细胞出现了典型的神经元样形态,且经RT-PCR检测表明,神经元特征性蛋白微管相关蛋白和神经丝亚单位M表达增强。结论:外源性人端粒酶逆转录酶基因可以在人骨髓间充质干细胞中获得异位表达,并能诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性。外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达不仅可以使人骨髓间质干细胞的寿命明显延长而且不影响其维持干细胞的多向分化潜能特性。