抗原负载的树突细胞介导的特异性抗慢性粒细胞白血病作用

慢性粒细胞白血病 (ＣＧＬ)来源的树突细胞 (ＤＣ)在体外能较强地激发特异性细胞毒Ｔ细胞产生 ,对自身白血病细胞具有较强的杀伤活性[1 ] 。我们探讨ＣＧＬ细胞冻融抗原(ＣＬＡ)负载的ＤＣ与细胞因子诱导的杀伤细胞 (ＣＩＫ)共同培养能否进一步提高特异性细胞毒Ｔ细胞的杀伤活性。材料和方法1　细胞来源　 12例外周血样本采自ＣＧＬ慢性期初诊患者(ＷＢＣ >5 0× 10 9) ,冻存后作为靶细胞及制备ＣＬＡ。采缓解后患者外周血进行ＤＣ及ＣＩＫ细胞培养。2　主要试剂　ｒｈＩＬ 4 (比活性 13Ｕ ｎｇ)、ｒｈＴＮＦα(比活性 36Ｕ ｎｇ)购自Ｐｒｏ…     

慢性粒细胞白血病树突状细胞对特异性抗白血病T细胞的作用

树突状细胞（ＤＣ）是有效的抗原呈递细胞,我们从初诊慢性粒细胞白血病慢性期（ＣＭＬＣＰ）患者的外周血中培养出ＤＣ,探讨其对特异性抗白血病Ｔ细胞（ＡｎｔｉＬＢＴ）的作用。病例和方法１　病例　初诊ＣＭＬＣＰ患者１６例。均有ｔ（９;２２）染色体异常。其中男１０例,女６例。年龄３２（１８～４５）岁。分别将与其中６例患者ＨＬＡ相合的６名健康亲属作为正常对照。２　单个核细胞（ＭＮＣ）的分离制备　取肝素抗凝的外周血或骨髓２～３ｍｌ,按文献［１］分离外周血单个核细胞（ＰＢＭＮＣ）或骨髓单个核细胞（ＢＭＭＮ…     

抗原冲击致敏树突状细胞诱导特异性CTL杀伤Jurkat细胞实验研究

本研究以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导其为树突状细胞（DC），分别负载Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），以探讨其对白血病Jurkat细胞的杀伤作用。联合应用rhGM—CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等细胞因子，密度梯度离心法、贴壁法从外周血获取单核细胞并进行诱导扩增，培养出DC，分别用冻融抗原及WT1多肽抗原冲击致敏DC。实验分4组：冻融抗原致敏DC组为实验组A，WT1多肽致敏DC组为实验组B，未致敏DC组为对照组A，单核细胞组为对照组B，观察CTL对Jurkat细胞的杀伤作用。结果表明：培养出了具有典型特征的DC，它高表达CD40、CD80、CD1a及CD86等表面标志，能体外诱导强烈的同种异基因混合淋巴细胞增殖反应。实验组显示高水平杀伤率，与对照组比较均具有统计学意义（P〈0.01），实验组A、B间比较无统计学意义。结论：Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原冲击致敏DC能有效诱导T细胞抗白血病作用，为临床研制DC疫苗提供了实验依据。     

DC-CIK细胞的生物学活性及体外抗白血病作用的研究

本研究探讨树突状细胞（DC）对细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平及抗白血病细胞的作用。健康人外周血单个核细胞诱导DC和CIK，将DC与CIK共培养，以CIK细胞单独培养为对照。用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数，MTT法测定杀伤活性，流式细胞术分析免疫表型，ELISA双抗体夹心法测定干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-12（IL—12）的水平。结果表明：DC—CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞（P〈0．05）；DC、CIK细胞共培养后，CD3^＋CD8^＋、CD3^＋CD56^＋细胞比率较相同条件下CIK细胞组显著增多（P〈0．05）；共培养3天，DC—CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ水平均比CIK细胞单独培养的水平高（P〈0．01，P〈0．05）；在5：1—40：1的效靶比范围内，DC—CIK细胞对白血病细胞的杀伤率显著高于CIK细胞（P〈0．05），且杀伤率与效靶比呈正相关。结论：DC增加CIK细胞的增殖能力和抗白血病活性，有可能作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗手段。     

树突状细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞增殖和抗白血病作用影响的研究

目的探讨树突状细胞(DC)对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平以及抗白血病细胞作用的影响。方法健康人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照。用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA双抗体夹心法检测分泌干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-12(IL-12)的水平。结果DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞(P<0.05);DC、CIK细胞共培养后,CD3 CD8 、CD3 CD56 双阳性细胞比率较同条件下CIK细胞组显著增多(P<0.05);共培养3d,DC-CIK细胞上清液中IL-12I、NF-γ分泌量均比CIK细胞单独培养的分泌量高(P<0.01,P<0.05);在5∶1~40∶1的效靶比范围内,DC-CIK细胞对白血病细胞的杀伤率显著高于CIK细胞(P<0.05),且杀伤率与效靶比呈正相关。结论DC增加CIK细胞的增殖能力和抗白血病活性。可作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗策略。     

转染慢性粒细胞白血病总RNA对树突状细胞介导的抗白血病作用的体外研究

目的体外诱导和鉴定慢性粒细胞白血病-树突状细胞（CML—DC）,并探讨人慢性粒细胞白血病（CML）总RNA体外转染对其介导的特异性细胞毒T淋巴细胞（CTLl对慢性粒细胞白血病细胞杀伤作用的影响。方法分离14例CML患者骨髓单个核细胞．加入rhIL-4、rhGbl—CSF、rhTNF-α诱导培养CML—DC。分别于培养第1、3、6、14d用倒置显微镜进行形态学观察．流式细胞术检测免疫学表型,染色体G显带技术检测其染色体核型,逆转录聚合酶链反应（RT—PCRIl检测bcr—abl融合基因。并于CML-DC培养第5d,加人CML细胞总RNA脂质体转染,或裸总RNA转染,或不加任何试剂继续培养的DC,共三种CML—DC．分别致敏T淋巴细胞．另设以IL-2培养的T淋巴细胞为对照组,比较不同组别的致敏T淋巴细胞的杀伤活性。结果CML骨髓单个核细胞诱导前CDlct、CD83表达均在5％以下。而诱导成熟的CML—DC细胞CDla、CD83阳性表达率分别为20．13~3．43％、26．76＋2．79％,较诱导前均明显增高（P〈0．01）。CML-DC细胞均存在Phl染色体,并表达bcr-abl融合基因。总RNA脂质体转染CML—DC、裸总RNA转染CML—DC、单纯CML—DC分别致敏的T淋巴细胞在效：靶比为20：1时对CML单个核细胞的杀伤效率分别为75．33±3．11％、37．23±2．92％、29．62±1．61％,均明显高于对照组f9．87＋3．43％,P〈0．01）。总RNA脂质体转染的CML—DC所诱导的CTL杀伤活性最强．与后三组杀伤活性均有显著性差异（P〈0．001）。结论CML—DC既具有CML白血病源性．又具有DC细胞的特性,并能诱导特异性CTL杀伤白血病细胞。经脂质体转染CML细胞总RNA可以提高CML-DC介导的CTL特异性杀伤慢性粒细胞白血病细胞。     

脐血树突状细胞对同源CIK细胞生物学活性及抗白血病作用影响的研究

本研究旨在探索脐血树突状细胞（DC）对同源细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞体外增殖、免疫表型、分泌细胞因子水平及其对白血病细胞细胞毒作用的影响。采集脐血单个核细胞诱导DC和CIK细胞。将DC和CIK细胞按1：5的比例混合培养,以脐血CIK细胞或外周血DC—CIK细胞为对照。用流式细胞术分析细胞表型,台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法检测效应细胞杀伤白血病细胞的活性,ELISA法测定分泌干扰素-γ（IFN—γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-12（IL—12）的水平。结果表明,脐血DC—CIK细胞增殖能力显著高于脐血CIK细胞和外周血DC-CIK细胞（P〈0．05、P〈0．05）;脐血DC、CIK细胞共培养后,CD3^＋CD8^＋、CD3^＋CD56^＋细胞比例较相同奈件下CIK细胞明显增多（P〈0．05）;混合培养3天,脐血DC—CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ 、TNF—α含量均比单纯培养CIK细胞分泌含量高（P〈0．01、P〈0．05、P〈0．05）;在2．5：1—20：1的效靶比范围内,脐血DC—CIK细胞对各亚型急性白血病细胞的杀伤率明显高于CIK细胞（p〈0．05）,但对各亚型白血病细胞杀伤活性无显著性差异,与外周血DC—CIK细胞对白血病杀伤效应相类同。结论：脐血DC可增强同源CIK细胞的增殖活性和抗白血病效应。脐血DC。CIK细胞增殖能力比外周血DC—CIK细胞强,但两者在细胞毒方面无显著性差异。因脐血较易获得,且输注不易引起严重的排斥反应,因而DC—CIK细胞在免疫治疗方面具有更广泛的临床应用前景。     

树突状细胞介导的抗白血病效应的临床研究

肿瘤的免疫治疗作为恶性肿瘤综合治疗的重要组成部分，近年来受到了广泛的关注。树突状细胞(DC)是已知的功能最强的抗原呈递细胞，不仅能够激活自体的抗肿瘤免疫，同样能够提高异体免疫组织的抗肿瘤效应。为了探讨外周血来源的DC体外培养扩增和临床治疗的可行性和安全性，分析DC免疫治疗对于急性非淋巴细胞白血病自体骨髓移植患者长期生存的影响，利用CS3000Plus采集13例急性非淋巴细胞白血病自体骨髓移植后的病人的外周血单个核细胞，经过2周的体外培养后行DC免疫治疗，治疗后长期随访观察其无病生存时间。结果表明，无一例发现有与DC免疫治疗相关的严重不良反应；Kaplan-Meier生存分析结果为：DC组5年生存率为75．52％，非DC组5年生存率为45.71％，DC组在累计生存率上明显优于非DC组。结论：外周血来源的DC体外培养和临床治疗是安全可行的，急性非淋巴细胞白血病病人在自体骨髓移植术后应用DC免疫治疗延长了其无病生存时间，提高了长期生存率。     

树突状细胞疫苗诱导抗白血病免疫

白血病细胞可通过多种机制逃避机体免疫应答，树突状细胞(DC)作为功能最强的专职抗原递呈细胞，高表达MHC-Ⅰ类、Ⅱ类抗原以及B7-1／CD80、B7-2／CD86、ICAM-1等共刺激分子，能有效递呈白血病抗原，逆转机体对白血病抗原的耐受，启动特异抗白血病的T细胞应答。DC疫苗用于白血病传统化疗后的免疫治疗已成为清除微小残留病变和防止白血病复发的希望所在。     

自体树突状细胞活化的骨髓细胞对慢性粒细胞白血病骨髓的净化

为考察慢性粒细胞白血病(CML)患者自体树突状细胞(DCs)活化骨髓细胞、净化骨髓的作用,采用免疫磁珠从2例血液学缓解的CML骨髓单个核细胞(BMMNCs)分离DCs,另取BMMNCs置T-25塑料培养瓶建立Dexter培养体系,分为3份,第1份为对照,第2份加rhIL-2,第3份加自体DCs.每周取半量非贴壁细胞、计数、行CFU-GM检测,然后加等量新鲜培养基继续培养.当非贴壁细胞总数＜2×105时终止培养,收集贴壁细胞做CFU-GM集落形成试验并检测CD34和P210表达.取贴壁细胞形成的CFU-GM集落,抽提RNA,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测BCR/ABL的表达.结果发现,在DCs加入CML骨髓Dexter培养体系培养后1-2周,非贴壁细胞的CFU-GM产量明显下降,与rhIL-2的体系基本平行,同时体系中的P210阳性细胞显著减少.不过,培养3周后含DCs的体系CFU-GM产量下降减缓,而含rh-IL-2的体系CFU-GM产量持续下降.在含自体DCs的Dexter体系,贴壁细胞中CD34+细胞和P210+细胞比例最低,只是贴壁细胞产生的CFU-GM集落中,BCR/ABL(+)的集落比例与不合DCs的体系比较无明显差别.这些结果说明自体DCs加入CML骨髓Dexter培养体系能减少白血病的祖细胞,包括成熟的祖细胞和原始的祖细胞,自体DCs有可能用于CML骨髓的体外净化.     

干扰素α对慢性髓系白血病来源树突状细胞表达Th细胞因子和CCR7的影响

本研究探讨干扰素α（IFN-α）对慢性髓系白血病（CML）来源树突状细胞（DC）表达趋化因子CCR7及分泌IL-10、IL-12P70的影响。在诱导CML-DCs的无血清条件培养基中，除加入SCF、GM-CSF、TNF-α及IL-4外．还加入不同浓度IFN-α。培养10—14天后，用流式细胞术检测共刺激分子及CCR7表达。G显带法显示Ph1染色体，噻唑蓝（MTT）法检测CML-DC刺激正常人外周血淋巴细胞增殖状况，ELISA法检测培养上清IL-10及IL-12P70含量。结果显示：IFN-α（300U／ml）组与无IFN-α组比较其CML—DC的CD40、CD83、CD86及CCR7的表达均升高1倍，异体混合淋巴细胞反应（MLR）中OD值增加1倍，Ph1染色体阳性比例及IL-10和IL-12P70浓度均减低。结论：IFN-α能够部分纠正CML-DC免疫表型及功能缺陷，这同其上调DC共刺激分子和CCR7表达及解除了CML血清中IL-10对CML—DC分化的抑制有关。     

细胞因子诱导的杀伤细胞对慢性髓性白血病细胞的体外净化作用

在长期骨髓培养(LTBMC)7—9天的基础上,配对比较观察细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK) 白细胞介素2(IL-2)或淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK) IL-2或IL-2活化的骨髓细胞或单纯LTBMC对慢性髓性白血病(CML)患者骨髓Ph~ 细胞的净化作用。结果为LTBMC CIK IL-2组(n=8)细胞的Ph~ 百分率明显低于单纯LTBMC组(n=8,P<0.001),也低于LTBMC LAN IL-2组(n=3)或单纯IL-2(n=3)。结论:CIK IL-2与LTBMC对CML患者骨髓Ph~ 细胞的净化有明显的协同作用。     

急性髓细胞白血病细胞来源的树突状细胞的诱导及功能研究

为了研究急性髓细胞白血病(AML)细胞诱导成树突状细胞(DC)的方法及其DC的功能，分离25例AML患者骨髓或外周血单个核细胞，在含有细胞因子rhGM—CSF，rhIL-4，rhTNF—α的IMDM完全培养基中培养8—12天，进行细胞形态学、表型、遗传学及功能测定。结果表明：20／25例自诱导培养的第3天起，在倒置显微镜下可观察到部分细胞体积增大，形态由圆形变得不规则，可见驼峰样或细刺状胞浆突起；在第8—9天，该类细胞所占的比例达到峰值。至第12天，细胞总数及上述形态的细胞数量明显减少。诱导培养结束时收集细胞，应用流式细胞术检测11／20例诱导前后细胞表面标志的表达，结果表明诱导前细胞不表达CD1a、CD80及CD83，低表达CD86、CD54和HLA—DR；诱导后细胞CD1a、CD80、CD83、CD86、CD54及HLA—DR的表达明显上调。在同种异体混合淋巴细胞反应(Allo-MLR)中，该类细胞刺激同种异体淋巴细胞增殖一对^3H-TdR的摄取能力明显高于AML细胞。FISH证实诱导生成的具有DC特征细胞的AML起源。结论：体外联合应用细胞因子可将AML细胞诱导成具有DC形态、表型及功能特征的细胞(AML—DC)。     

急性和慢性髓系白血病患者VEGF表达的研究

目的：探究急性髓系白血病（AML）与慢性髓系白血病（CML）血清及CML骨髓细胞VEGF含量的变化。方法：采用酶联免疫吸附法（ELISA）对49例AML和17例CML患者血清及20例CML患者骨髓细胞VEGF浓度进行检测。结果：AML患者血清平均VEGF浓度为201．17pg/ml,与正常对照组（133．37pg/ml)比较,有明显的统计差异（P＜0．05）;而CML患者血清VEGF水平可达517．79pg/ml,显著高于正常对照组（P＜0．001）,AML患者各亚型中VEGF水平无明显差异,但以M3型最高（299．31pg/ml),CML患者骨髓细胞培养上清液ＶＥＧＦ的浓度（649．16pg/ml)也显著高于正常骨髓细胞对照组（P＜0．01）,结论：AML和CML患者存在VEGF的异常高表达,提示血管生成和血管内皮生长因子可能在急性与慢性髓系白血病的发病中发挥重要作用。     

钙离子载体诱导慢性髓系白血病细胞分化为树突状细胞的实验研究

本研究旨在探索钙载体（calcium ionophore,CI）诱导慢性髓性白血病（CML）细胞分化成树突状细胞（DC）的作用,了解诱导产生P210蛋白的情况和刺激自身T细胞产生针对CML细胞的细胞毒作用。用CI和粒－单集落刺激因子（GM—CSF）联合诱导CML病人骨髓来源的单个核细胞,通过倒置显微镜和电子显微镜观察细胞的形态变化和超微结构,用流式细胞仪检测细胞表面分化抗原的变化和变化过程;用Western blot检测CML特异的肿瘤标志物P210蛋白在DC中的表达;通过乳酸脱氢酶（LDH）实验评估CI诱导的CML—DC刺激自身T细胞产生抗CML细胞的细胞毒作用。结果表明：CML细胞经CI和GM—CSF联合诱导96小时后在倒置显微镜和电子显微镜下观察到DC典型的形态结构;流式细胞仪检测显示CD83、CD86、CD80、HLA—DR、CD40等细胞表面分化抗原的表达显著提高;Western blot实验表明,生成的CML—DC有P210蛋白的表达,与未经诱导的CML单个核细胞比较,用CI和GM—CSF联合诱导生成的CML－DC的P210蛋白表达水平降低;LDH实验表明,这些CML—DC刺激的自身T细胞对CML细胞的杀伤率显著高于用CML细胞刺激的自身T细胞。结论：CI和GM—CSF联合能快速诱导CML细胞分化成DC,这些CML—DC表达CML细胞特异的肿瘤标志物P210蛋白,但其表达水平较未经诱导的CML单个核细胞低;CML细胞经诱导生成的CML—DC能够刺激自身T细胞产生抗白血病细胞毒性。     

人脐血树突状细胞体外诱导抗白血病细胞毒效应

为了体外观察树突状细胞 (DC)诱导的抗白血病细胞毒效应 ,采用细胞因子组合体外扩增培养脐血单个核细胞 (CBMNC) ,对产生的DC进行形态学观察、免疫表型检测和功能鉴定 ;用DC制备细胞毒T淋巴细胞 (CTL)和51Cr释放法测定CTL的溶靶细胞毒性。结果表明 :CBMNC中T细胞亚群与成人外周血相似 ;CD1a阳性细胞含量极少 ,仅为 (0 .4 1± 0 .0 9) % ;在DC扩增培养过程中 ,DC形态发生明显变化 ,胞体变大 ,形态不规则 ,有的细胞出现毛刺状突起 ,有的细胞出现粗大树根状突起 ;在培养 15天时 ,细胞群中CD1a阳性细胞达 (2 8.4± 3.5 5 ) % ,有 (6 3.6 7± 2 3.33) %的细胞表达CD86 ,(8.7± 1.4 9) %的细胞表达CD83,(32 .5± 1.5 3) %的细胞表达HLA DR ;产生的DC对异基因淋巴细胞具有明显的增殖刺激作用 ;经冻融的HL 6 0全细胞抗原脉冲的DC致敏自体T淋巴细胞产生的CTL对HL 6 0细胞具有特异性细胞毒效应。结论 :本研究中的脐血DC培养体系能产生较高含量的DC ,脐血DC在体外能诱导产生抗白血病细胞毒效应。     

成人慢性髓性白血病骨髓细胞血管内皮生长因子的表达

血管生成出现于实体瘤生长的早期,抗血管生成可能成为治疗实体瘤的一个新的策略。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是人类实体瘤中主要的促血管生成细胞因子之一,其在慢性髓性白血病（chronic myelogenous leukemia,CML）病程进展中是否呈现过度表达尚不清楚。为此,本研究采用RT-PCR和ELISA方法对CML病人骨髓细胞及血浆VEGF的表达进行了研究。结果表明,多数CML细胞、白血病细胞系及正常人骨髓细胞均表达VEGF,CML病人VEGF mRNA检测阳性率（93.1%)高于骨髓移植后的CML病人（50%）及正常人（60%）;未治CML病人血浆VEGF浓度（380.6pg/ml）比CML骨髓移植后病人血浆的VEGF浓度（38.0%pg/ml)高9倍;未治CML骨髓细胞分泌的VEGF（499.8pg/ml)比正常人骨髓细胞分泌的（141.3pg/ml)多2.5倍,两之间有显性差异（P＜0.05)。研究结果说明VEGF在CML病人中确实存在过度表达,其在CML发病机制中的作用值得进一步深入研究。     

慢性髓性白血病人源树突状细胞的细胞毒作用及其体外扩增

本研究观察来源于慢性髓性白血病患者的CD34 细胞经两步培养扩增后产生的树突状细胞的抗白血病 免疫功能。从慢性髓性白血病患者骨髓或外周血中分离出CD34 细胞或外周血单个核细胞分别进行两步培养。 首先将其与rhFlt3-L和rhTPO共育7天,再与rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4共同培养14天,以诱导树突状细胞产 生:同时以rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4直接诱导体系作对照。获得的DC通过流式细胞仪检测免疫表型,电镜分 析细胞超微结构及G显带法进行的染色体分析后,并用MTT法检测DC刺激T细胞增殖能力及T细胞对CML细 胞的杀伤作用.结果表明:慢性髓性白血病的CD34 细胞经过rhFlt3-L和rhTPO的初始扩增培养7天后,CD34 细 胞总数扩增77±5倍。用rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4诱导培养14天,DC产率达到(39±8)％,细胞扩增倍数及 DC比例均明显高于直接诱导产生的培养方法(P<0.01),且此DC能刺激自体或异体T细胞增殖,进而杀伤CML 细胞。结论:两步法体外扩增培养可明显提高DC前体总数及产率,优于直接诱导培养;CML细胞来源的DC可诱 导产生抗白血病免疫反应。