人脐血造血干,祖细胞体外培养的实验研究

采用体外细胞培养的方法，检测了脐血、骨髓、外周血ＣＦＵ－ＧＭ，ＢＦＵ－Ｅ。结果表明脐血中ＣＦＵ－ＧＭ，ＢＦＵ－Ｅ数量高于成人外周血，同骨髓相比，ＣＦＵ－ＧＭ数量无显著差异，ＢＦＵ－Ｅ低于骨髓。同时观察到脐血中ＣＦＵ－ＧＭ大集落比例明显高于骨髓；ＣＦＵ－ＧＭ集落产率时间曲线较骨髓延迟３～４天；Ｓ期ＧＭ－ＣＦＣ所占比例明显低于骨髓，可能提示脐血造血细胞中早期造血细胞比例高于骨髓。实验中还发现脐血红系集落生长同骨髓十分相似，二者均含ＣＦＵ－Ｅ和ＢＦＵＥ集落，而外周血中只含ＢＦＵ－Ｅ集落。我们统计了２７份脐血血量及所含有核细胞数。根据骨髓移植的有核细胞数标准（２×１０￣８／ｋｇ），一份脐血的有核细胞数很难达到此要求，但已达到目前国外小儿异体脐血移植成功病例的有核细胞数值。     

胎牛血清对脐血干细胞体外增殖和分化为内皮细胞的影响

目的：观察不同浓度胎牛血清（FBS）体外培养对脐血单个核细胞（MNC）形成集落能力和分化为内皮细胞ECs的影响。方法：自脐带血中分离MNC，给予不同FBS浓度（5%，10%，20%）＋DMEM培养条件，倒置相差显微镜下比较d7形成的集落和d16细胞分化比例，3周后进行Dil-AcLDL染色、4周后用免疫荧光测定VIII因子相关抗原（vWF），鉴定其向（ECs）分化情况。结果：（标化到每10^5个接种细胞）：FBS浓度为5%、10%和20%时，集落形成数目分别为0±0、0.1172±0.37058和1.1149±1.21314（P〈0.05）；分化细胞比例为0±0（P〈0.05）、0.0524±0.05167和0.0104±0.00905；Dil-AcLDL染色结果分别为“-”、“＋”、“＋”，免疫荧光测得其表面均有vWF表达。结论：提高培基中FBS浓度到一定程度有助于MNC向EC分化。     

人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：国内外有关内皮祖细胞的分离培养和鉴定方面的文章很多,但是人脐血和外周血内皮祖细胞的鉴别方面文章不多。目的：从人脐血和外周血中分离出内皮祖细胞,并对其进行培养和鉴定。方法：选取密度梯度离心法从脐血和外周血中分离获得单个核细胞,按照1×10^6／cm^2的浓度种植于预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,用含血管内皮生长因子的M199培养基进行诱导培养。结果与结论：人脐血和外周血中存在内皮祖细胞,浓度梯度离心联合贴壁筛选获得的单个核细胞在血管内皮生长因子的诱导培养下可分化成内皮祖细胞,内皮祖细胞表达CD34、CD133、CD105、KDR和CD31,能吞噬乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,它们可作为体外分选内皮祖细胞的标志。     

脐血来源的两种内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

为了建立从人脐血分离培养两种内皮祖细胞的方法和培养体系，从脐血分离单个核细胞，在含有内皮细胞条件培养液的体系中培养得到两种细胞，利用摄取乙酰化低密度脂蛋白（acetylated low-density lipoprotein，DiI-Ac—LDL）和结合欧洲荆豆凝集素（Ulex European Agglutinin 1，UEA—1）进行鉴定，并进一步用免疫细胞化学、RT-PCR、流式细胞术对它们进行内皮细胞相关的表型检测。结果表明，这两种细胞均能摄取DiI-Ac-LDL和结合UEA—1，表达内皮细胞的标志如CD31、CD144和血管假性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF），有CD31、酪氨酸激酶受体（kinase tyrosine insert domain receptor，KDR）、CD144和内皮一氧化氮合成酶（endothelial NO synthase。ENOS）的基因转录。但是，它们的增殖能力明显不同，分别称为循环成血管细胞和高增殖潜能内皮祖细胞。流式细胞计数结果显示，这两种细胞在一些表面标志表达方面也存在明显的差异。结论：利用含内皮细胞条件培养液的培养体系，成功地从脐血分离的单个核细胞中培养得到了两种内皮祖细胞。     

体外高浓度葡萄糖培养及黄芪干预人外周血内皮祖细胞的数量和增殖与分化

背景:内皮祖细胞数量及功能受损是糖尿病血管并发症发生发展的重要环节,黄芪对多种原因引起内皮功能障碍具有保护作用,可以有效保护血管内皮功能。目的:观察高浓度葡萄糖及黄芪干预对人外周血内皮祖细胞数量、增殖及分化影响。方法:不同浓度葡萄糖孵育内皮祖细胞24h以及30mmol/L葡萄糖孵育内皮祖细胞不同时间;内皮祖细胞经20g/L黄芪预处理24h后,再加入30mmol/L葡萄糖培养24h。结果与结论:高葡萄糖以浓度及时间依赖方式减少内皮祖细胞的数量,降低内皮祖细胞的增殖及向内皮细胞系分化能力(P0.05或0.01),给予黄芪预处理后,内皮祖细胞数量明显增加,增殖及向内皮细胞系分化能力明显增强(P<0.05或0.01)。提示高葡萄糖以浓度及时间依赖方式减少外周血内皮祖细胞数量,降低内皮祖细胞的增殖及向内皮细胞系分化能力,黄芪可以改善高葡萄糖对内皮祖细胞的损伤作用。     

体外高浓度葡萄糖培养及黄芪干预人外周血内皮祖细胞的数量和增殖与分化

背景：内皮祖细胞数量及功能受损是糖尿病血管并发症发生发展的重要环节,黄芪对多种原因引起内皮功能障碍具有保护作用,可以有效保护血管内皮功能。目的：观察高浓度葡萄糖及黄芪干预对人外周血内皮祖细胞数量、增殖及分化影响。方法：不同浓度葡萄糖孵育内皮祖细胞24h以及30mmol/L葡萄糖孵育内皮祖细胞不同时间;内皮祖细胞经20g/L黄芪预处理24h后,再加入30mmol/L葡萄糖培养24h。结果与结论：高葡萄糖以浓度及时间依赖方式减少内皮祖细胞的数量,降低内皮祖细胞的增殖及向内皮细胞系分化能力（P0.05或0.01）,给予黄芪预处理后,内皮祖细胞数量明显增加,增殖及向内皮细胞系分化能力明显增强（P〈0.05或0.01）。提示高葡萄糖以浓度及时间依赖方式减少外周血内皮祖细胞数量,降低内皮祖细胞的增殖及向内皮细胞系分化能力,黄芪可以改善高葡萄糖对内皮祖细胞的损伤作用。     

人脐血间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的体外诱导

背景:细胞替代治疗帕金森病成为目前研究的一个热点,如何进行体外诱导获得足量的有效多巴胺能神经元是治疗该疾病的一种策略。目的:探讨人脐血间充质干细胞体外诱导分化为多巴胺能神经元的可行性。方法:将传至第5代人脐血间充质干细胞以5×106L-1接种,先用20μg/L表皮生长因子+20μg/L碱性成纤维细胞生长因子预诱导24h后,分为4组:对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,不加任何诱导液;其余3组分别加入100μmol/L抗坏血酸,1μmol/L全反式维甲酸,50μg/L胶质细胞源性神经营养因子单独或联合进行诱导。结果与结论:各诱导组均表达酪氨酸羟化酶、多巴胺转运体、多巴胺受体D2 mRNA。诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞特异性抗原。与对照组相比,各诱导组巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、酪氨酸羟化酶、多巴胺转运体、多巴胺受体D2阳性细胞率均明显升高(P<0.05);且全反式维甲酸+胶质细胞源性神经营养因子组和3种物质联合诱导组升高幅度高于抗坏血酸组(P<0.05),3种物质联合诱导组升高幅度高于全反式维甲酸+胶质细胞源性神经营养因子组(P<0.05)。结果提示抗坏血酸,全反式维甲酸,胶质细胞源性神经营养因子单独或联合均能促进人脐血间充质干细胞向多巴胺能神经元分化,3种物质联合应用效果最高。     

人脐静脉血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

目的 体外分离、培养及鉴定人脐静脉血内皮祖细胞。方法 密度梯度离心法分离培养人脐静脉血EPCs。、通过免疫荧光法观察内皮细胞吸收DiL-acLDL和FITC-UEA-I情况,流式细胞仪定量检测EPCs表面CD133、CD34和KDR抗原表达阳性率来鉴定EPCs。倒置显微镜下观察EPCs形态学变化,计数细胞并绘制生长曲线。结果 培养细胞呈长梭形,接种2-4 d梭形形态细胞较少,为细胞生长的潜伏期;6-10 d贴壁梭形细胞逐渐增多,为对数增殖期;10-14 d细胞融合成集落样生长,梭形细胞明显增多,进入生长平台期。激光共聚焦显微镜鉴定DiL-acLDL、FITC-UEA-I双染阳性的细胞为正在分化的EPCs;流式细胞仪检测结果 ：细胞表达CD133、CD34和KDR抗原的阳性率分别为：7.3＋2.71%、42.0＋6.42%、89.3＋10.45%。结论 从人脐静脉血可分离、纯化、扩增培养出内皮祖细胞。     

严重颅脑损伤脑组织匀浆诱导人脐血MSCs成神经分化的实验研究

目的 探讨严重颅脑损伤时的脑组织匀浆对人脐血间充质干细胞(MSCs)成神经分化的诱导能力.方法 制作小鼠严重颅脑损伤模型,取伤后24 h和正常小鼠脑组织匀浆,对体外培养的第2代MSCs进行诱导.诱导3 d后以荧光免疫细胞组化技术检测细胞内NF和NeuN的表达.结果 成功培养出人脐血MSCs,成神经诱导后,严重损伤性脑组织匀浆诱导组NF和NeuN阳性率分别为(47.31±8.14)%和(58.91±8.12)%,高于正常脑组织匀浆诱导组阳性率(P<0.05).结论 脑组织匀浆可诱导人脐血MSCs向神经元样细胞分化,表达神经细胞特异标志分子NF和NeuN,严重损伤性脑组织匀浆的诱导效果高于正常脑组织匀浆.     

人脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究

目的　探讨人脐血间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSC)的体外分离、纯化、扩增和向神经元样细胞的定向诱导分化条件。方法　无菌条件下采集正常人脐血 ,肝素抗凝 ,用相对密度为1.0 77的淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞 ,进而获得MSC。用MesencultTM 培养基进行纯化和扩增培养。用流式细胞仪检测MSC的表面标志。取扩增 2 ,5 ,8代的MSC分别向神经元样细胞诱导 ,免疫组化和组化法检测神经元样细胞特异性标志和结构。结果　脐血MSC每扩增一代 ,细胞数量增加约 2～ 3倍。 6 .6× 10 5个人脐血原代MSC在体外扩增 10代后获得 9.9× 10 8个细胞 ,扩增约 1.5× 10 3倍。流式细胞仪检测结果显示 ,脐血MSC不表达CD34 、CD1 1a和CD1 1b,强表达CD2 9,弱表达CD71 ,与骨髓MSC表面抗原特性一致。诱导后的细胞平均有 70 %左右呈现典型的神经元样表型 ,免疫组化法检测发现不同代数的MSC诱导后均表达神经丝蛋白 (neurofilament,NF)和神经元特异性烯醇化酶 (neuron specificenolase ,NSE) ;组织化学法检测可看到神经元特有结构尼氏体。结论　脐血MSC在体外有较强的扩增能力 ,能够向非间充质类细胞分化。     

人脐血间充质干/祖细胞的生长特征

为了评估脐血中间充质干 /祖细胞存在的频率 ,了解脐血间充质干 /祖细胞的增殖特点 ,寻找新的组织工程种子细胞 ,取足月顺产胎儿脐血、淋巴细胞分离液分离单个核细胞 ,悬浮至含 2 %胎牛血清的DMEM培养基中 ,培养并扩增脐血间充质干 /祖细胞 ,行免疫组织化学鉴定。结果表明 :脐血单个核细胞中间充质干 /祖细胞集落出现的频率为 0 .5× 10 -6,呈成纤维细胞样 ,传 2 0代仍可维持其形态特征 ,可有效扩增 1.3× 10 7倍。结论 :低血清DMEM培养液能维持脐血间充质干 /祖细胞增殖分化能力 ,脐血间充质干 /祖细胞是又一良好的组织工程与细胞治疗的种子细胞。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的探讨来源于人脐血的间充质干细胞(MSCs)在体外分离、纯化和扩增培养的可行性和条件。方法无菌条件下收集正常足月胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用相对密度1.077的淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esencu ltTM作为培养基进行培养和纯化扩增,用流式细胞仪检测MSCs的表面标志。结果来源于人脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后,可产生贴壁细胞,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞,传3代后,可得纯化扩增的人脐血MSCs。6.6×105个脐血原代MSCs在体外扩增10代后,获得9.9×108个细胞。流式细胞仪检测结果显示,人脐血MSCs不表达CD34、CD11 a和CD11b,强表达CD29,弱表达CD71,与骨髓MSCs表面抗原特性一致。结论源于人脐血的MSCs在体外可以培养、扩增,可作为干细胞来源之一用于实验研究和临床。     

阿司匹林对人脐血晚期内皮祖细胞功能的影响

本研究旨在观察阿司匹林对人脐血晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)功能的影响。采用密度梯度离心法及免疫磁珠分选法从脐血获得CD34+的单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板上,培养2周后收集贴壁细胞,通过流式细胞术、免疫荧光、RT-PCR、DiI-Ac-LDL的摄取及体外血管形成能力等方法对其进行鉴定。用不同浓度阿司匹林(终浓度分别为0.1,1,10,100,1 000,10 000μmol/L)处理EPC 24 h,然后分别采用CCK-8比色法、Transwell小室、黏附能力测定实验来观察EPC的增殖能力、迁移能力和黏附能力的变化。结果表明:低浓度的阿司匹林(0.1-1 000μmol/L)对脐血晚期EPC的增殖无明显影响,但可增强晚期EPC的黏附及迁移能力,而高浓度的阿司匹林(10 000μmol/L)显著抑制晚期EPC的增殖和迁移,但对其黏附能力无明显影响。结论:低浓度的阿司匹林可增强晚期EPC的黏附及迁移能力,而高浓度的阿司匹林抑制晚期EPC的增殖、黏附及迁移能力,从而抑制内皮细胞的生成。     

人脐血单核细胞诱导分化为神经样细胞的实验研究

目的探讨人脐血单核细胞向神经细胞分化的潜能,为其治疗神经系统疾病提供实验依据。方法采用HES法分离脐血单核细胞（UCBMNCs）,L-DMEM培养液原代和传代培养UCBMNCs,碱性成纤维细胞生长因子诱导细胞向神经细胞分化,应用流式细胞仪和免疫组化方法分析细胞中nestin、NSE阳性表达情况。结果原代UCBMNCs中有少量细胞表达nestin,阳性率为3.85%±0.88%;经诱导分化后原代（P0）和第10代（P10）细胞形态向神经样细胞转变：NSE阳性表达率分别为25.8%±4.6%、89.3%±8.5%;nestin阳性表达率分别为27.8%±5.8%和86.7%±6.8%。结论UCBMNCs具备神经样细胞分化潜能。     

人脐带源神经干细胞的培养和分化

目的研究诱导人脐带间充质干细胞(hucMSC)分化为神经干细胞样细胞(hucNSC)的方法。方法体外培养hucMSC,流式细胞仪鉴定细胞表型的表达。用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子添加B27诱导,流式细胞学、免疫细胞化学鉴定。用胶质源性神经营养因子(GDNF)、白介素-1β(IL-1β)和全反式维甲酸(ATRA)等诱导分化,免疫组化染色、RT-PCR鉴定。结果hucMSC表达CD105、CD44、CD29。诱导后聚集成细胞球悬浮生长,并不断增殖,流式细胞仪鉴定失去hucMSC的表面标志物特征,而表达Nestin、CD133。再经RA、GDNF、IL-1β诱导,细胞表达胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶和酪氨酸羟化酶。结论hucMSC能分化为具有神经干细胞样生长、增殖、分化特征的细胞。     

胎肺间充质干细胞对脐血来源的单个核细胞体外扩增为巨核细胞的影响

本研究探讨胎儿肺部组织来源的间充质干细胞在无血清条件下体外对脐血单个核细胞诱导扩增为巨核细胞的影响。取脐血单个核细胞,在TPO,IL-11,肝素的扩增体系中分为2组培养。第1组为脐血单个核细胞单独培养,第2组脐血单个核细胞与间充质干细胞共培养,在第7,10,14天时进行活细胞计数,用流式细胞仪分析CD41a和CD61的表达情况。采用免疫组织化学和透射电子显微镜观察第14天细胞的形态与结构,用流式细胞仪分析细胞DNA含量。结果表明,第2组在第10天时获得的CD41^＋细胞和CD61^＋细胞数量最多,分别为第1组的4．5倍和4．7倍;但免疫组织化学和电子显微镜显示,2个组的CD41a^＋和CD61^＋细胞的核发育不成熟。结论：胎肺间充质干细胞能有效刺激CD41a^＋和CD61^＋细胞生成,但不能促进幼巨核细胞核的发育。     

人脐血造血干/祖细胞体外定向诱导分化过程中端粒酶的表达

探讨脐血造血干/祖细胞体外诱导分化过程中端粒酶的表达,为造血干细胞产品的临床应用提供一个监测细胞增殖潜能和安全性的指标。用源自人脐血的CD34~+细胞及不同细胞因子组合(SCF+IL-3+IL-6+G-CSF,SCF+IL-3+IL-6+EPO)在体外进行诱导分化;用TRAP聚丙烯酰胺凝胶电泳法、TRAP-ELISA法检测CD34~+细胞及诱导分化细胞的端粒酶活性;用Western印迹法在蛋白水平检测端粒酶催化亚基hTERT的表达,用RT-PCR在细胞转录水平检测端粒酶催化亚基hTERT mRNA的表达。结果显示,在体外诱导分化14-21天为细胞生长峰值,细胞总数可增加(1006.4±103.2)倍,随着培养时间的延长,细胞数量不再增加。CD34~+细胞低度表达端粒酶活性和hTERT基因,在细胞诱导分化过程中端粒酶活性及hTERT表达逐渐升高,细胞诱导14天后端粒酶活性及hTERT表达下降,28天端粒酶活性及hTERT基因检测不出。结论:利用CD34~+细胞在体外定向诱导分化出的大量细胞,不具有无限增殖的特性,可安全地应用于临床,且利用端粒酶的检测可为临床应用诱导分化细胞的时机提供依据。     

人脐血造血干/祖细胞能在鼠肝中生长

肝脏干／祖细胞的分化、再生以及它的生物特性是一个非常活跃的研究领域。本研究报告当人脐血细胞经静脉输注给肝脏受损伤的及免疫功能缺陷的小鼠后，采用流式细胞术和组织配型(HLA)的方法，结果发现，在输注9周后鼠肝脏细胞内还存在有人脐血细胞，即使在灌洗后肝脏细胞的贴壁细胞培养及细胞集落(CFU—GEMM)中，也可以发现人脐血细胞的存在。结论：证实了脐血造血干／祖细胞能长期在肝脏中生长。     

骨髓间充质干细胞分化的成骨细胞支持脐血造血干祖细胞的研究

本研究利用骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞构建二维培养体系,探讨其体外支持脐血干/祖细胞生存的作用.体外进行人骨髓间充质干细胞（MSC）原代培养后诱导为成骨细胞,构建二维培养体系.将免疫磁珠分选的CD34^＋脐血干/祖细胞接种于其中,在无外源性细胞因子情况下进行体外培养,进行CFU,HPP-CFU和LTC-IC测定并将其分别与MSC、成骨细胞,MSC/成骨细胞（1：2）作为饲养细胞的二维培养体系实验结果相比较.结果发现：在所构建的造血干/祖细胞（HSPC）二维培养体系中,骨髓MSC诱导成骨细胞对于脐血造血干/祖细胞培养的支持作用显著优于其他各组培养体系,尤其对长期造血干细胞（long term-HSC）体外生存有更为明显地支持作用.结论：骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞构建的二维体系对于脐血干/祖细胞体外培养具有支持作用,进一步证实成骨细胞对造血干细胞生存与增殖具有重要调控作用.