自噬调节药物对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响

目的:探讨自噬调节药物包括自噬激活剂(雷帕霉素)、自噬抑制剂(羟氯喹和3-甲基腺嘌呤)对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖、凋亡和自噬的影响。方法:采用不同浓度雷帕霉素(RAPA)、羟氯喹(HCQ)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理RPMI 8226细胞,用CCK-8法检测药物对细胞增殖的作用,流式细胞术检测药物作用24 h后细胞凋亡率,应用单丹磺酰戊二胺(MDC)染色观察自噬小体数量,Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC-3b和凋亡相关蛋白(caspase-3、PARP和BCL-2)的表达情况。结果:RAPA和HCQ可呈时间及剂量依赖性抑制RPMI8226细胞的增殖,并增加细胞的凋亡,而3-MA无明显抑制细胞增殖作用,也无诱导凋亡作用。MDC染色结果显示,细胞内自噬泡数量随着RAPA浓度的提高逐渐增多,而随着HCQ和3-MA浓度升高自噬泡数量却逐渐减少。Western blot结果显示,RAPA可诱导自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和凋亡蛋白caspase-3及PARP表达上调,但抑制抗凋亡蛋白BCL-2表达;HCQ抑制LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和BCL-2表达,但可上调caspase-3和PARP表达;3-MA可下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达,但对caspase-3、PARP及BCL-2表达均未显示明显影响。结论:RAPA能抑制RPMI8226细胞增殖,诱导RPMI8226细胞凋亡和自噬,HCQ则在抑制自噬和增殖的同时也可诱导凋亡,3-MA可抑制细胞自噬但对细胞增殖和凋亡影响不大。     

雷帕霉素对K562细胞survivin、caspase-3表达及超微结构的影响

目的:探讨雷帕霉素对K562细胞survivin、caspase-3在mRNA水平的表达和对K562细胞超微结构的影响。方法:用不同浓度雷帕霉素处理慢性髓系白血病K562细胞,应用CCK8的方法检测雷帕霉素对K562细胞的增殖抑制率,应用电子显微镜观察K562细胞形态学的改变,应用RT-PCR的方法检测不同浓度雷帕霉素作用K562细胞后survivin,caspase-3在mRNA水平的表达情况。结果:雷帕霉素对K562细胞的增殖有明显的抑制作用;电子显微镜显示,随着雷帕霉素浓度的增高K562细胞的凋亡程度加重;随着雷帕霉素浓度的增高caspase-3在mRNA表达水平上升,而survivin在mRNA水平表达下降。结论:雷帕霉素通过上调caspase-3的水平,可以降低survivin水平而促进K562细胞的凋亡。     

高三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡的时间节律性及其机制研究

本研究旨在观察高三尖杉酯碱（HHT）作用于K562细胞后不同时间点凋亡率的变化及其机制。HHT10ng／ml作用K562细胞后,用MTT法检测不同时间点的细胞增殖活力,Westernblot法检测caspase-3凋亡蛋白表达;流式细胞术检测BCL-2蛋白表达;应用透射电子显微镜观测细胞自噬。结果表明,HHT10ng／ml处理后的前5d,K562细胞增殖活性逐渐下降,但在第6天以后增殖活性又逐渐上升;同时激活型caspase-3蛋白从第1天至第7天逐渐增高,而在第8天明显降低（P〈0．05）;BCL-2蛋白表达水平则呈现先降低后升高（P〈0．05）的特点。细胞自噬体在HHT作用第8天明显增多。结论：HHT作用后,K562细胞凋亡水平变化呈现先升高后下降的特点,其机制与HHT作用后期K562细胞自噬水平升高有关。     

细胞自噬对高三尖杉酯碱作用K562细胞的影响

目的:探讨高三尖杉酯碱(HHT)单用或与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联用对K562细胞凋亡及自噬的影响。方法:K562细胞在HHT(10 ng/ml)作用下1-8 d,采用流式细胞术检测细胞凋亡;采用RT-PCR法、Western blot法和透射电子显微镜检测细胞自噬。结果:在HHT作用前期K562细胞凋亡率逐渐升高,而在后期则下降。HHT作用后,K562细胞的Beclin1表达及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值先下降后升高。HHT单用时,激活型caspase-3蛋白表达前期逐渐上升,而在后期下降。与自噬抑制剂3-MA联用组的K562细胞的Beclin1表达和LC3Ⅱ/Ⅰ的比值持续下降,而激活型caspase-3蛋白表达则逐渐升高。结论:HHT可诱导K562细胞凋亡,但HHT持续作用可诱导K562细胞发生自噬,与3-MA联用则增强HHT的细胞毒作用。     

CPEB4对慢性髓系白血病细胞增殖与凋亡的影响

目的:探索CPEB4在K562细胞中的表达、生物学活性及其可能的分子机制。方法:采用Western blot检测正常白细胞和K562细胞中CPEB4的表达情况;再将过表达质粒pcDNA3.1(+)-His-CPEB4、沉默质粒pPLK+Puro-CPEB4 shRNA电穿孔转染K562细胞,改变CPEB4在K562细胞中的表达量,应用Western blot检测转染效率;最后应用CCK-8和流式细胞术检测不同处理的细胞增殖和凋亡情况,并用Western blot法检测增殖与凋亡标志蛋白(AKT、p-AKT、caspase-3、BCL-2)的表达变化。结果:与正常白细胞相比,K562细胞中CPEB4蛋白表达量较高(P0.01);CPEB4沉默的K562细胞与对照组相比,细胞增殖水平显著增高(P0.001),细胞凋亡数显著减少,AKT、p-AKT、BCL-2蛋白表达水平明显增高,而caspase-3蛋白表达显著降低;CPEB4过表达后的K562细胞增殖减慢(P0.05),细胞凋亡数明显增加,AKT、p-AKT和BCL-2蛋白表达显著降低,caspase-3蛋白表达增高。结论:CPEB4可抑制K562细胞增殖,促进K562细胞凋亡,而AKT、p-AKT、BCL-2和Caspase-3等分子参与调控机制。     

高三尖杉酯碱通过mTOR通路诱导慢性髓系白血病K562细胞凋亡

目的:观察高三尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)对人CML细胞株K562的增殖及凋亡的影响,并从mTOR通路探索HHT抗CM L效应的作用机制。方法:采用不同浓度HHT或联合mTOR抑制剂雷帕霉素(RAPA)处理K562细胞,用CCK-8法检测细胞增殖抑制活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测BCL-6、Caspase-3及mTOR通路相关蛋白的表达水平,RT-PCR法检测BCL-6 mRNA表达水平。结果:HHT可抑制K562细胞的增殖并促进其凋亡,且呈浓度依赖性(r=0.970)。随着HHT作用浓度的增加,mTOR通路相关蛋白表达水平升高(r=0.908),而BCL-6 mRNA及蛋白的表达水平下降(r_(mRNA)=-0.961,r_(protein)=-0.981)。与HHT单用组相比,联用RAPA可显著下调mTOR及Caspase-3的表达,并上调BCL-6表达。结论:HHT可通过激活mTOR通路抑制抗凋亡BCL-6蛋白的表达,进而诱导CML细胞凋亡。     

三氧化二砷对K562/ADM耐药细胞凋亡抑制的逆转作用

目的:研究三氧化二砷(As2O3)诱导白血病K562/ADM耐药细胞凋亡的分子机制。方法:采用MTT比色法检测K562/ADM耐药细胞增殖活性,细胞形态学和annexinV /PI双染色检测细胞凋亡,RT-PCR检测mdr1、bcl-2和caspase-3基因mRNA的表达水平,流式细胞法(FCM)测定P-糖蛋白(P -glycoprotein,P-gp)和bcl-2蛋白表达及caspase-3活性。结果:As2O3显著抑制K562/ADM耐药细胞的增殖;经 As2O3处理后细胞形态上出现典型的凋亡改变,annexinV /PI双染显示凋亡细胞明显增加;mdr1mRNA表达和P-gp合成明显降低,凋亡抑制基因bcl-2mRNA及其蛋白bcl-2表达下调, caspase-3mRNA表达和caspase-3活性显著增强。结论:As2O3诱导K562/ADM耐药细胞凋亡,其主要机制可能为As2O3抑制 mdr1和bcl-2基因表达,逆转耐药白血病细胞因bcl-2和P-gp高表达所介导的凋亡抑制。     

大黄素对K562细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用

本研究观察中药大黄素（emodin）对人慢性髓系白血病K562细胞株的增殖及凋亡影响，探讨P210融合蛋白和caspase-3激活在其中的作用。采用MTT法、集落形成试验观察大黄素对K562增殖的影响；AnnexinV FITC／PI法、DNA倍体分析及DNA凝胶电泳法检测细胞凋亡；Westem blot检测大黄素作用后不同时间段P210、磷酸化P210、caspase。3前体蛋白及PARP表达水平的变化。结果表明，大黄素能抑制K562细胞增殖，作用48小时的半数抑制浓度（IC50）为38．25μmol/L；Annexin V FITC／PI法、亚二倍体峰（凋亡峰）及DNA片段化检测证实，大黄素能诱导K562细胞凋亡，并呈量效关系。大黄素作用飚62细胞后P210、磷酸化P210、caspase-3前体蛋白表达水平均有不同程度下调，PARP的活性片段85kD表达增加，这些变化呈时效关系。结论：大黄素能够有效抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡。P210磷酸化抑制，P210表达下调和caspase-3激活可能参与了该过程。     

大黄素可能通过Akt-Caspase 3信号通路诱导K562/Adr细胞凋亡

目的:观察大黄素(emodin)对多药耐药白血病细胞株K562/Adr凋亡的影响及Akt-Caspase 3信号通路在其中的作用。方法:采用Annexin V/PI双染的流式细胞术和DNA倍体分析法检测细胞凋亡;Western blot法检测大黄素作用后不同时间段caspase-3前体蛋白、PARA、Akt、p-Akt表达水平的变化。结果:大黄素能够诱导K562/Adr细胞凋亡,并呈量效关系。大黄素作用K562/Adr细胞后caspase-3前体蛋白、Akt、p-Akt、PARA 116 KD表达水平下调,PARP 85 KD表达水平增加,并呈时效关系。结论:Akt-Caspase 3信号通路可能参与大黄素诱导K562/Adr细胞凋亡的过程。     

自噬在硼替佐米诱导的肾癌细胞凋亡中作用的研究

目的探讨自噬在硼替佐米诱导的肾癌细胞凋亡中的作用。方法采用MTT检测硼替佐米对人肾癌ACHN细胞增值率的影响;通过Western Blotting检测硼替佐米对人肾癌ACHN细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3及自噬相关蛋白LC3表达水平的影响;联用自噬抑制剂3-MA后,MTT检测细胞增殖率,Western Blotting检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达水平。结果硼替佐米对肾癌ACHN细胞的增殖有抑制作用,并且增加人肾癌ACHN细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达水平及自噬相关蛋白LC3表达水平,呈一定的浓度依赖性;联用3-MA可增加硼替佐米诱导的肾癌ACHN细胞的增殖抑制作用,并可增加硼替佐米诱导的肾癌ACHN细胞cleaved caspase-3表达水平。结论硼替佐米可诱导肾癌细胞凋亡并诱导肾癌细胞发生自噬,抑制自噬可以明显增强硼替佐米的肾癌细胞毒作用。