表达绿荧光蛋白的多药耐药微小残留白血病细胞的小鼠模型

为了方便研究多药耐药微小残留白血病的病理生理和治疗,采用携带绿荧光蛋白（EGFP）基因标记的小鼠多药耐药白血病细胞系P388/VCR-G和DBA小鼠建立一个检测多药耐药微小残留白血病的动物模型.结果显示,P388/VCR-G细胞腹腔接种DBA小鼠,白血病的发病率为100%,无自发缓解.P388/VCR-G白血病模型小鼠对环磷酰胺（Cy）敏感,有较好的药物剂量-生存时间关系,接种细胞的对数与Cy剂量间有良好回归相关关系.白血病诱导缓解后残留白血病细胞在肝、脾、胸腺及骨髓等脏器呈不均匀分布.冰冻切片荧光显微镜下观察EGFP＋细胞是检测小鼠体内微小残留白血病细胞最敏感的方法.结论：采用P388/VCR-G细胞和DBA小鼠可建立表达EG-FP的多药耐药小鼠微小残留白血病模型.     

清热解毒方对可移植性小鼠淋巴细胞白血病及其微小残留病疗效的比较研究

目的:探讨复发与初发白血病的关系,观察清热解毒方对L7212白血病及其微小残留病疗效的差异,初步了解该方的适应证情况,以指导临床使用.方法:造模成功后予高剂量清热解毒方灌胃7d,观测生存时间、终末期外周血白细胞计数及分类、肝脾胸腺指数及细胞增殖周期.结果:L7212模型组、L7212中药Ⅰ组、MRL模型组、MRL中药Ⅰ组小鼠生存时间呈升幂排列,且有显著性差异(P＜0.05或＜0.01).L7212中药Ⅰ组较L7212模型组的生命延长时间及生命延长率,均高于MRL中药Ⅰ组较MRL模型组.L7212模型组与MRL模型组终末期外周血白细胞计数有显著性差异(P＜0.05).L7212模型组与L7212中药Ⅰ组白细胞计数的差值小于MRL模型组与MRL中药Ⅰ组的差值,但L72l2模型组与L7212中药Ⅰ组白血病细胞百分比的差值,大于MRL模型组与MRL中药Ⅰ组的差值.白血病死亡小鼠的脾脏指数L7212模型组较MRL模型组、L7212中药Ⅰ组较MRL中药Ⅰ组低,组间比较有统计学差别(P＜0.05).MRL组较L7212组G0 G1期细胞比例增高,S期和G2 M期细胞相对减少.中药组较模型组小鼠G2/G1比值低(P＜0.05).结论:小鼠复发白血病比原代接种的浸润程度严重,前者G0 G1期细胞较后者高,S期和G2 M期细胞相对减少.清热解毒方对L7212白血病的疗效优于对其微小残留病,提示急性白血病初期更适于使用该方.     

甲酰四氢叶酸钙对L615微小残留白血病小鼠的作用

本研究建立了L615微小残留白血病小鼠模型,观察了甲酰四氢叶酸钙(LV)对L615微小残留白血病小鼠的作用。615小鼠生存天数与其接种的L615白血病细胞数是对数线性关系。615小鼠接种L615细胞5×10~6后24h接受阿糖胞苷(Ara-C)3g/m~2腹腔注射治疗,其生存期延长至24.7d(未治疗组存活7.3d),但最终均死于白血病复发。用移植生物试验及生存期推测经Ara-C治疗后48h,小鼠体内残留白血病细胞数甚微,且处于“抑制”或“休止”状态,此时的小鼠可作为残留白血病模型。L615微小残留白血病小鼠接受不同剂量LV(50-200mg/m~2/d)处理后其平均生存期(17.9±2.19-13.3±1.35d)较对照组(24.7±2.55d)明显缩短。病理学发现LV有促进骨髓抑制期L615微小残留白血病小鼠的脾小结良性增生的作用,但同时也加速了脾脏的白血病细胞浸润。以上结果表明,LV对L615残留白血病小鼠未能起到有益的治疗作用,相反加速了残留白血病小鼠的复发。     

采用MLL-AF9转基因小鼠造血细胞移植的方法建立白血病小鼠模型

目的:采用混合谱系白血病(MLL)-AF9转基因小鼠造血细胞移植的方法建立白血病小鼠模型,为急性髓系白血病的机制研究和治疗药物筛选提供基础。方法:繁育和鉴定MLL-AF9转基因小鼠,当小鼠自然发病后,经外周血白细胞计数检测、流式细胞术和形态学方法鉴定。待外周血白细胞数100×109/L后,收集骨髓细胞和脾细胞冻存。将细胞复苏后经尾静脉注射入4.5 Gy照射的野生C57BL/6J小鼠体内,观察小鼠的成模情况,最后采用阳性药物在该模型上进行疗效评价。结果:本实验繁育的MLL-AF9转基因小鼠的自然发病时间为22-28周,发病后的转基因小鼠脾脏增大,骨髓呈髓系白血病细胞的幼稚形态,骨髓和脾细胞均高表达CD11b和Gr-1髓系标志。最低0.5×106骨髓细胞和2.5×106脾细胞移植就能使受体小鼠全部造模成功,小鼠的中位生存时间分别为20和36 d。在脾细胞移植的小鼠发病模型上进行实验治疗,发现传统化疗药物阿糖胞苷能延缓发病,并延长模型小鼠的生存时间。结论:成功建立基于MLL-AF9转基因小鼠造血细胞移植的小鼠白血病发病模型,有望用于MLL相关白血病的发病机制研究和疗效评价。     

基质细胞抑制HL-60细胞凋亡机制初探

骨髓基质细胞在造血调控方面发挥重要作用。为探讨骨髓基质细胞对骨髓白血病细胞凋亡抑制的作用机制，我们选用小鼠骨髓基质细胞系Hess-5，研究其在髓系白血病细胞HL-60抗凋亡中的作用及其抗凋亡过程中bcl—xL和bcl-2表达水平的变化。     

干扰HMGA2基因表达抑制HL60细胞的增殖及浸润

目的:探索干扰高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein A2,HMGA2)基因的表达对HL-60白血病细胞体外增殖、浸润的影响。方法:实验分为3组,实验组为稳定转染慢病毒干扰HMGA2基因表达载体的HL-60细胞;阴性对照组为稳定转染慢病毒空载体HL-60细胞;空白对照组为未转染的HL60细胞。3组分别接种BALB/c裸鼠建立种植瘤模型,检测接种后各个时间点裸鼠外周血和骨髓中白血病细胞的比例(肿瘤负荷)、生活质量,计算接种40 d后各组小鼠的肝脾指数。结果:RTPCR及Western印迹证明干扰RNA慢病毒表达载体可明显降低HL-60细胞靶基因的表达。接种后骨髓涂片结果显示裸鼠白血病模型成功建立。接种后21,28,40 d,实验组HL-60细胞在小鼠外周血和骨髓中的比例均明显低于阴性对照组及空白对照组,差异有统计学意义(P0.05),其白血病细胞比例随接种时间延长而增加的速度亦明显变缓;且实验组小鼠萎糜少动、腹部膨隆、皮下结节等并发症出现时间明显较空白对照组及阴性对照组延迟;接种40 d后实验组小鼠肝脾指数分别为66.76±5.56和20.57±0.75,均明显低于其余两组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:干扰HMGA2基因表达,可明显抑制HL60白血病细胞在小鼠体内增殖、浸润。     

混合骨髓移植的实验研究

目的：探讨在异基因骨髓移植治疗白血病中既控制移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）又同时保留移植物抗白血病（ＧＶＬ）作用的移植方案。方法：采用近交系小鼠移植模型，在异基因骨髓、脾细胞移植物中混合一定比例的同基因脾细胞，观察移植后受鼠ＧＶＨＤ死亡率、脾结节数、移植后不同时间骨髓造血重建细胞来源以及受鼠脾脏淋巴细胞对供、受鼠双方来源的刺激细胞增殖反应；采用Ｌ６１５小鼠白血病模型观察混合移植对荷瘤小鼠生存时间及死亡原因的影响。结果：混合移植可以有效减轻ＧＶＨＤ，异基因造血免疫细胞在受鼠体内一过性存留并发挥移植物抗宿主反应，使荷瘤小鼠生存时间明显延长。结论：异基因骨髓、脾细胞移植物中混合一定比例的同基因脾细胞使移植受鼠体内既具有主要组织相容性抗原复合物（ＭＨＣ）不合的免疫活性细胞发挥一过性ＧＶＬ作用，同时减轻了异基因骨髓移植的严重ＧＶＨＤ。     

用单倍体相合小鼠FBL-3红白血病细胞株移植建立CB6F1小鼠红白血病模型

本研究探讨建立F1代单倍体相合小鼠FBL-3红白血病模型的可行性,并观察FBL-3细胞在小鼠体内的生物学特性。将FBL-3H2-d小鼠红白血病细胞经尾静脉分别接种给小鼠C57BL/6和CB6F1H-2b/d(C57BL/6×BALB/c),观察两种小鼠的生存时间和染色体变化,并对濒死小鼠的肝、脾、肺和肾进行病理检查,部分进行电子显微镜检查。分析骨髓和脾脏细胞染色体核型及MHC分子表达情况。结果表明:静脉接种103-107个白血病细胞的情况下,C57BL/6小鼠和CB6F1小鼠发病率分别为100%和92.5%;接种的细胞数量与存活时间呈线性关系;接种相同数量FBL-3细胞的CB6F1小鼠平均生存时间较C57BL/6小鼠延长。白血病细胞主要侵及肝、脾、骨髓、肺和肾组织,糖原染色阳性、氯醋酸染色部分阳性,过氧化物酶、碱性磷酸酶、丁酸染色均为阴性。电子显微镜观察到细胞内病毒样颗粒。脾脏和骨髓细胞染色体多数为非二倍体,且H-2b表达率升高,H-2d表达率降低。结论:经尾静脉接种FBL-3细胞可以建立CB6F1小鼠红白血病模型。     

流式细胞仪检测急性婴幼儿白血病干细胞

背景：有关儿童急性髓细胞性白血病干细胞含量的测定及急性髓细胞性白血病患儿缓解后白血病干细胞含量与急性白血病微小残留病之间关系的研究国内外未见报道。目的：通过测定急性髓细胞性白血病干细胞或急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC在儿童急性白血病患儿骨髓单个核细胞中的含量,研究急性髓细胞性白血病患儿缓解后白血病干细胞含量与急性白血病微小残留病水平之间的关联。方法：收集白血病患儿113例次。采用骨髓单个核细胞分离及单细胞悬液制成单细胞悬液,进行单个核细胞染色、急性髓细胞性白血病干细胞分析及根据初诊免疫表型获得白血病相关表型,并采用该白血病相关免疫表型进行单抗组合和流式细胞术测定分析。结果与结论：①初诊急性髓细胞性白血病组骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞含量明显高于初诊急性淋巴细胞性白血病组和非肿瘤对照组（P均〈0.017）,初诊急性淋巴细胞性白血病组骨髓单个核细胞中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC含量显著高于非肿瘤对照组（P〈0.017）。②对33例次缓解急性髓细胞性白血病患儿急性髓细胞性白血病干细胞和急性白血病微小残留病相关性分析发现,两者存在显著负相关性。结果提示,①急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC也存在于初诊急性淋巴细胞性白血病患儿骨髓细胞中,且当急性淋巴细胞性白血病获完全缓解时急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC含量却没有下降,但非肿瘤对照组标本中急性髓细胞性白血病干细胞-IPIC的含量极微。②急性髓细胞性白血病患儿缓解后骨髓中急性髓细胞性白血病干细胞含量和急性白血病微小残留病水平之间存在着明显的负相关。     

一种新的抗肿瘤疗法——活化骨髓在恶性肿瘤治疗中的研究进展

活化骨髓在骨髓净化中可发挥肿瘤监视作用,不断杀死骨髓移植后残留在体内的白血病细胞;减少实体肿瘤的肺、淋巴结等处转移,对小负荷肿瘤状态更有意义。本文就活化骨髓的特性以及它在净化白血病骨髓、治疗实体瘤等方面的研究进展作一综述。     

间充质干细胞对H-2半相合骨髓移植小鼠免疫功能的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSC）对半相合骨髓移植小鼠免疫功能的影响及机制。方法经8Gy^60Coγ射线照射后，BALB／c（H-2^d）雌性小鼠分为两组：MSC组，尾静脉输注经cm—DiI膜染剂标记的CB6F1（H-2^bd）雌性小鼠的MSC和CB6F1雄性小鼠的骨髓及脾的单个核细胞；对照组，单独输注CB6F1骨髓及脾的单个核细胞。观察两组移植后不同时间外周血中的淋巴细胞亚群，ConA和LPs刺激的T、B淋巴细胞增殖，供受者及第三者混合淋巴细胞反应（MLR），供者骨髓及脾细胞在受者胸腺、骨髓和脾脏的植入率，供者MSC在受者体内分布，急、慢性GVHD的发生率和生存分析。结果移植后90天（＋90天）内，MSC组CD3阳性细胞高于对照组（P〈0．05），＋30天MSC组CD3CD4双阳性细胞百分比和CD4／CD8值高于对照组（P〈0．05）。两组T细胞增殖活性差异无统计学意义。MSC组＋14天后B细胞增殖功能开始恢复，＋30天达到正常值，而对照组＋60天才恢复到正常值。供受者的MLR中MSC组的RR值始终低于对照组；第三者MLR中MSC组与对照组差异无统计学意义。＋30天MSC组受者骨髓和脾中的sry基因多于对照组。移植后MSC主要集中在胸腺、骨髓、肝、小肠，并且大量扩增。对照组急性GVHD发生率高于MSC组（P〈0．05），＋90天对照组出现不同程度的慢性GVHD，MSC组＋120天后出现慢性GVHD，程度轻于对照组。MSC组存活率高于对照组（P〈0.05）。结论MSC促进骨髓干细胞植入，加快C1M淋巴细胞恢复，促进体液免疫恢复，减少GVHD发生率，并且在受者胸腺、骨髓、肝、肠和心内膜下大量扩增，起到修复损伤作用，提高半相合骨髓移植动物生存率。     

Nitric oxide induces apoptosis in spleen lymphocytes from MRL/lpr mice.

BACKGROUND: MRL/MpJ-Tnfrsf6lpr(MRL/lpr) mice, a murine model of systemic lupus erythematosus (SLE), have defective expression of Fas, substantially reducing signaling for apoptosis via this mechanism. However, it is known that MRL/lpr mice have increased spontaneous apoptosis of leukocytes. These conflicting observations have stimulated interest in apoptosis in this SLE model. MRL/lpr mice overproduce nitric oxide (NO) as autoimmune disease progresses. In vitro administration of NO may induce or decrease apoptosis depending on the cell type. Therefore, we hypothesized that NO induces MRL/lpr spleen lymphocyte apoptosis independent of Fas receptor engagement. METHODS: Percentages of apoptotic spleen lymphocytes from MRL/lpr and BALB/cJ mice were determined ex vivo after in vivo treatment with NG-monomethyl-L-arginine (NMMA), a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor. After culture in varying concentrations of a slow-acting NO donor, the following were determined in spleen lymphocytes: (1) levels of apoptosis, (2) the effect of phorbol myristate acid (PMA) on levels of NO-induced apoptosis, and (3) protein kinase C (PKC) activity. RESULTS: Spleen lymphocytes from MRL/lpr mice with active disease had increased levels of ex vivo apoptosis when compared with BALB/cJ controls. This increase was reduced by pharmacologic inhibition of NOS in MRL/lpr but not in BALB/cJ mice. Exogenous administration of NO in vitro reduced PKC activity and induced apoptosis in MRL/lpr spleen lymphocytes, an effect that could be reduced via coadministration of PMA in vitro. CONCLUSION: These results suggest that NO plays a role in spleen lymphocyte apoptosis in MRL/lpr mice, possibly via inhibition of PKC, despite a Fas defect.     

Ly49A转基因小鼠脾细胞对半相合异基因骨髓移植后GVHD和GVL的作用

目的　观察Ly4 9A基因转染的C5 7BL 6小鼠脾细胞对半相合异基因骨髓移植 (allo BMT)后移植物抗宿主病 (GVHD)和移植物抗白血病效应 (GVL)的影响。方法　经由逆转录病毒介导将Ly4 9A基因转染至C5 7BL 6小鼠的脾细胞 ;流式细胞仪检测Ly4 9A受体在转染后脾细胞上的表达率 ;以亲代C5 7BL 6H 2 b 小鼠为供者 ,以接种EL96 11红白血病细胞的 (BALB c×C5 7BL 6 )F1H 2 d b(CB6F1)小鼠为受者 ,预处理条件为全身照射 (TBI,6 0 Co照射 10 .5Gy) ,进行脾细胞混合骨髓细胞移植 ,建立半相合异基因急性GVHD模型并在该模型基础上观察Ly4 9A基因转染的脾细胞对GVHD和GVL的作用。结果　Ly4 9A基因转染的C5 7BL 6小鼠的脾细胞 2 4h后蛋白表达率为 (42 .2 0± 4 .87) % ,空载体转染组为(18.6 7± 2 4 8) % ,未转染对照组为 (18.73± 3.82 ) % ,在半相合异基因移植中 (C5 7BL 6 H 2b →CB6F1H 2d b) ,未进行移植的单纯照射组生存期为 (7.80± 3.36 )d ;环磷酰胺治疗组生存期为 (2 1.70±2 87)d ;脾细胞混合骨髓细胞移植组生存期为 (2 9.4 0± 6 .4 3)d ;空载体转染的脾细胞混合骨髓细胞移植组生存期为 (2 9.10± 7.39)d ;Ly4 9A转染的脾细胞混合骨髓细胞移植组生存期为 (45 .0 0± 12 .38)d ,较上述各组生存期明显延长 (P     

Anti-CD25 targeted killing of bicistronically transduced cells: a novel safety mechanism against retroviral genotoxicity.

Gene therapy for Fabry disease, a deficiency in alpha-galactosidase A (alpha-gal A) activity, has the potential to provide a cure for the disorder with a single treatment. Despite modifications to existing vectors, concerns have arisen regarding the risk of genotoxicity associated with the use of retroviruses. To address safety concerns, we propose that expression of a cell surface protein, human CD25 (huCD25) in a bicistronic format, with any therapeutic gene such as alpha-gal A can provide a target that can be used to kill transduced cells selectively should transformative events occur. We show that an anti-CD25 antibody and immunotoxin can specifically target and eliminate transduced leukemia cells expressing CD25. In a murine leukemia model, antibody treatment reduced tumor burden 32-fold and increased survival compared with untreated mice. Furthermore, after a bone marrow transplant of therapeutically transduced cells into Fabry mice, antibody treatment reduced the number of retrovirally transduced huCD25-expressing cells in the peripheral blood. A systemic loss of transduced cells with functional consequences was also evident in the liver and spleen. This proof-of-principle study demonstrates that a targeted antibody can reduce tumor burden and selectively clear bicistronically transduced hematopoietic cells that express a target antigen, thus acting as a built-in safety mechanism.     

Tolerance to histocompatibility determinants in tetraparental bone marrow chimeras

Tetraparental bone marrow chimeras were produced by injecting lethally X-irradiated F1 hybrids with relatively high numbers of T-cell-depleted bone marrow cells from both allogeneic parental strains. The mice survival in excellent health and showed a stable, approximately 50:50 (parent:parent), lymphoid cell chimerism lasting for at least 7 mo after irradiation; regeneration of host-type hemopoietic cells was very limited. Thymus, lymph node, and thoracic duct lymphocytes showed specific unresponsiveness to host mixed leukocyte reaction (MLR) determinants. Similarly specific tolerance to H-2 antigens of host type was demonstrated in spleen and lymph node. No suppressor cells could be demonstrated in either system and blocking serum factors could not be found. The results suggest specific deletion of functional T cells reactive to host-type MLR and cell-mediated lympholysis determinants.     

混合骨髓移植后过继免疫治疗小鼠白血病

背景：急性白血病自体造血干细胞移植后复发率高,异基因造血干细胞移植后移植相关病死率高,混合造血干细胞移植及移植后过继免疫治疗有可能取长补短,提高疗效。目的：观察自体骨髓混合H-2半相合异体骨髓移植后供体淋巴细胞输注＋白细胞介素2治疗对小鼠白血病的疗效。方法：将Balb/c小鼠经直线加速器照射3Gy后分为白血病模型组、白血病模型照射组、混合移植组、自体骨髓移植组,均尾静脉注射5×10^5K562（GFP＋/NeoR＋）或K562（GFP-/NeoR-）细胞。7d后6Gy照射,自体骨髓移植组移植自体骨髓细胞或联合白细胞介素2治疗;混合移植组移植小鼠自体骨髓细胞混合1/10的H-2半相合异体骨髓细胞后应用白细胞介素2或联合供体淋巴细胞输注治疗。4周后行小鼠外周血及骨髓细胞形态检查,外周血细胞亚群、GFP及NeoR基因测定,肝、脾匀浆细胞GFP和NeoR基因测定。结果与结论：白血病模型组小鼠因骨髓造血功能衰竭于20d内全部死亡,白血病模型照射组小鼠因造血功能衰竭于14d内全部死亡;自体骨髓移植组、混合移植组均有多少不等小鼠无白血病存活超过28d,且混合骨髓移植后及自体骨髓移植后应用白细胞介素2治疗可提高白血病小鼠长期无病生存率,在此基础上联合供体淋巴细胞输注可更进一步提高白血病小鼠长期无病生存率。     

骨髓源干细胞参与的血管内皮更新

背景：研究表明骨髓源干细胞可塑性强,但其参与组织更新及修复的机制在转分化及细胞融合间尚存在争议。目的：通过性别交叉骨髓移植建立雌雄嵌合体小鼠模型,观察骨髓源性干细胞是否参与内皮细胞的更新并探讨其可能的机制。方法：采用雌性C57BL/6-GFP小鼠为供体,雄性C57BL/6小鼠为受体进行骨髓移植建立嵌合体小鼠,并应用流式细胞术分析骨髓嵌合情况。骨髓移植后20周采用Y染色体荧光原位杂交法对脑、肾、肝、脾及心脏组织Y染色体进行标记,荧光显微镜观察各组织器官中血管内皮细胞Y染色体及绿荧光蛋白表达情况。结果与结论：①嵌合体小鼠骨髓细胞流式细胞学检测显示移植骨髓后1周骨髓GFP＋细胞为（7.48±1.38）%、4周时达（73.92±5.57）%,结果表明成功建立性别交叉骨髓移植模型。②骨髓移植后20周嵌合体小鼠脑、肾、肝和脾组织血管壁可见绿荧光蛋白表达,且部分细胞同时表达Y染色体,表明发生骨髓源细胞和血管内皮细胞融合。脑实质及心肌组织未见绿荧光蛋白表达。结果提示骨髓源干细胞可能通过细胞融合机制参与不同组织器官中血管内皮细胞的更新。     

突变Myc基因骨髓特异性转基因小鼠肿瘤模型的建立及鉴定

目的 研究通过外源Myc基因转染造血细胞,实现骨髓特异性转基因并形成淋巴瘤的潜能.方法 造血细胞转染野生型与突变型Myc基因.移植入经~(60)Coγ射线照射的C57BL/6小鼠,观察小鼠形成肿瘤时间以及小鼠自然死亡时间,免疫组织化学染色法检测肿瘤类型;流式细胞术检测外源Myc基因在小鼠骨髓MNC中的表达;骨髓造血细胞、肝、脾、肿瘤组织行Myc免疫印迹法检测Myc在体内的表达情况.结果 Mye基因转基因后形成B细胞淋巴瘤,流式细胞术检测发现外源Myc基因可在造血细胞表达,突变型Myc基因阳性率高于野生型Myc基因,Myc基因转染骨髓造血细胞后,骨髓、肿瘤组织有较高表达,肝、肾组织则无表达.结论 外源Myc基因特异转染造血细胞可形成组织特异性转基因;突变型Myc基冈致瘤性高于野生型Myc基因.