成人腹股沟疝发病机制的基因组学变异研究

[目的]探讨成人原发性腹股沟疝基因组学的相关变异.[方法]利用基因芯片技术对原发性腹股沟疝患者的腹横筋膜与正常腹横筋膜进行检测比较,筛选表达差异的相关基因,挑选差异程度最高的目标基因进行RT-qRCR检验.[结果]基因芯片筛选两组标本得到1189个差异表达基因,其中包含877个表达上调基因和312个表达下调基因,其中肌球蛋白调节轻链9(MYL9)是差异最显著的上调基因,而肌球蛋白调节重链1(MYH1)是差异最显著的下调基因,对MYL9和MYH1进行RT-qRCR检验,结果与芯片结果一致.[结论]成人腹股沟疝的发病可能与相关基因差异性表达相关,其中MYL9及MYH1可能起着重要作用.     

非钙依赖性调节肌球蛋白活性对维持平滑肌张力的影响

目的:揭示肌球蛋白轻链激酶(myosinlightchainkinase,MLCK)的一个活性片段对肌球蛋白功能的非钙依赖性调节作用,进一步完善平滑肌收缩的非钙依赖性调节机制研究,并为平滑肌系统疾病的治疗以及新药开发提供理论基础。方法:实验于2004-01/05在大连医科大学生化药理实验室完成。用胰蛋白酶(trypsin)水解MLCK,再经离子交换层析分离纯化而获得MLCK的活性片段(myosinlightchainkinasefragment,MLCKF,61ku);用west-ernblot检测MLCKF与完整MLCK的同源性;用SDS-PAGE及ScoinImage扫描软件检测肌球蛋白轻链的磷酸化程度;用分光光度法测定肌球蛋白Mg2+-ATP酶的活性。结果:在无Ca2+/CaM条件下,61kuMLCKF能轻度磷酸化20ku肌球蛋白轻链,并提高肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性;其磷酸化效力强于无Ca2+/CaM时MLCK的磷酸化效力,但弱于有Ca2+/CaM时MLCK的磷酸化效力,且持续时间长,较稳定,不易被MLCK抑制剂ML-9抑制。结论:MLCKF能以非钙依赖性方式轻度磷酸化肌球蛋白轻链,并提高肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性,对低钙时平滑肌张力的维持可能起一定作用。     

烫伤后微血管通透性升高与肌球蛋白轻链激酶有关

以往的研究证明，肌球蛋白轻链磷酸化致使血管内皮细胞收缩可引起微血管通透性增高。肌球蛋白轻链激酶在肌球蛋白轻链磷酸化过程中起关键作用。最近国外医学人员研究了烫伤后血管内皮细胞屏障受损时肌球蛋白轻链激酶的作用。肌球蛋白轻链激酶-210（MLCK-210）主要表达于血管内皮细胞，科研人员采用敲除MLCK-210基因的小鼠造成25％总体表面积（TBSA）Ⅲ度烫伤模型。     

非钙依赖性调节肌球蛋白活性对维持平滑肌张力的影响

目的：揭示肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)的一个活性片段对肌球蛋白功能的非钙依赖性调节作用，进一步完善平滑肌收缩的非钙依赖性调节机制研究，并为平滑肌系统疾病的治疗以及新药开发提供理论基础。方法：实验于2004-01／05在大连医科大学生化药理实验室完成。用胰蛋白酶(trypsin)水解MLCK，再经离子交换层析分离纯化而获得MLCK的活性片段(myosin light chain kinase fragment,MLCKF.61 ku)；用western blot检测MLCKF与完整MLCK的同源性：用SDS—PAGE及Scoin lmage扫描软件检测肌球蛋白轻链的磷酸化程度；用分光光度法测定肌球蛋白Mg^2 —ATP酶的活性。结果：在无Ca^2 ／CaM条件下，61 ku MLCKF能轻度磷酸化20ku肌球蛋白轻链，并提高肌球蛋白Mg^2 -ATP酶活性；其磷酸化效力强于无Ca^2 ／CaM时MLCK的磷酸化效力．但弱于有Ca^2 ／CaM时MLCK的磷酸化效力，且持续时间长，较稳定，不易被MLCK抑制剂ML-9抑制结论：MLCKF能以非钙依赖性方式轻度磷酸化肌球蛋白轻链．并提高肌球蛋白Mg^2 -ATP酶活性，对低钙时平滑肌张力的维持可能起一定作用。     

不同间歇时间磁刺激对星形胶质细胞迁移能力的影响及机制分析

目的 探讨不同间歇时间磁刺激对星形胶质细胞迁移能力的影响及相关机制。 方法 将传代星形胶质细胞分为对照组、1 s间歇组、5 s间歇组和10 s间歇组,分别给予相应间歇时间磁刺激,观察不同间歇时间磁刺激对星形胶质细胞迁移能力的影响;星形胶质细胞在磁刺激作用下,采用PEA-15磷酸化阻滞剂Bis I、细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）阻滞剂U0126处理细胞,采用Transwell实验检测星形胶质细胞迁移能力,采用Western blot技术检测pPEA-15和pERK1/2表达。 结果 1 s间歇时间磁刺激可明显增强星形胶质细胞迁移能力,促进PEA-15及ERK1/2磷酸化,并提高基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达;加入Bis I可降低ERK1/2磷酸化水平及MMP-9表达,减弱磁刺激对星形胶质细胞的促迁移作用;经U0126试剂处理后,发现磁刺激对星形胶质细胞的促迁移作用显著下降。 结论 1 s间歇时间磁刺激能促进星形胶质细胞PEA-15磷酸化,提高ERK1/2磷酸化水平,进而增强下游蛋白MMP-9表达,从而促进星形胶质细胞迁移。     

SHIP基因突变对白血病细胞系K562细胞迁移及侵袭的影响

目的 研究含SH2结构域的肌醇磷酸酶(SHIP)基因碳末端PxxP结构域点突变对细胞体外迁移及侵袭能力的影响及其机制.方法 采用基因转染技术将携带野生型(wt)和突变型(mu)SHIP基因的慢病毒载体感染人白血病细胞系K562细胞;采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平检测转染后各组SHIP基因表达水平;采用Transwell小室比较K562/wtSHIP、K562/muSHIP转染后K562细胞跨膜及侵袭能力有无差别;Westem blot法比较各组细胞基质金属蛋白酶( MMP)-2、MMP-9和磷酸化灶性黏着斑激酶(p-FAK)的表达情况,并检测各组细胞NF-KB活性改变.结果 感染慢病毒48 h后FQ-PCR和Westemblot法检测结果显示SHIP基因在K562细胞中表达明显升高;K562/wtSHIP组细胞迁移指数为(15.8±1.4)％,明显低于K562/muSHIP组[(54.3±2.4)％]和转染空载体的细胞对照组[K562/猫免疫缺陷病(pFIV)组,(50.3±3.8)％](P＜0.01);K562/muSHIP组与K562/pFIV组差异无统计学意义(P＞0.05);侵袭实验显示K562/wtSHIP组迁移到碳酸脂膜的细胞[(32±6)/视野]较K562/pFIV细胞[(78±13)/视野]和K562/muSHIP细胞[(83±16)/视野]明显减低.而K562/pFIV细胞与K562/muSHIP细胞比较,在侵袭能力上差异无统计学意义(P＞0.05).K562/muSHIP细胞p-FAK和NF-KB表达明显高于K562/wtSHIP细胞.结论 SHIP基因碳末端PxxP结构域对于SHIP基因负调节功能有重要作用.此位点发生突变通过影响FAK蛋白磷酸化、NF-KB活化以及MMP-9的表达影响K562细胞的体外迁移和侵袭能力;SH IP基因碳末端PxxP结构域点突变可能为致病性突变,可能是白血病细胞中SHIP功能异常的原因之一.     

Bcl-2和Bax调节细胞凋亡的研究

Bcl-2和Bax是凋亡调节基因Bcl-2家族的两个重要成员,二者可通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。Bcl-2和Bax调节凋亡的机制与线粒体内信号传递系统、Bcl-2蛋白磷酸化和Bax转位有密切关系,并且,Myb、CREB、P53、Gif-1和WT1等多种基因均对Bcl-2的表达或功能具有调节作用。     

Bcl—2和Bax调节细胞调亡的研究

Bcl-2和Bax是调亡调节基因Bcl-2家庭的两个重要成员,二者可通过形成同源或源二聚体来调节细胞调亡。Bcl-2和Bax调节调亡的机制与线粒体内信号传递系统、Bcl-2蛋白磷酸化和和Bax转位有密切关系,并且,Mby、CREB、P53、Gif-1和WT1等多种基因均对Bcl-2的表达或功能具有调节作用。     

血小板胞浆游离钙与血栓性疾病

血小板活化的机制很复杂 ,其中Ｃａ2 + 起了关键性的作用 ,它是血小板代谢与功能的一个重要调节因子 ,尤其是血小板胞浆游离Ｃａ2 + 浓度 ([Ｃａ2 + ]ｉ) ,在血小板的变形、聚集、释放反应中都可由血小板 [Ｃａ2 + ]ｉ增高触发。血小板 [Ｃａ2 + ]ｉ增高可激活肌球蛋白轻链酶 ,使肌球蛋白轻链磷酸化而导致肌球蛋白聚合 ,并促进肌动蛋白聚合 ,Ｆ 肌动蛋白的含量增高 ,因而改变血小板的细胞骨架结构 ;血小板 [Ｃａ2 + ]ｉ增高还可促进包括磷脂酶Ａ2 等多种Ｃａ2 + 依赖蛋白酶的作用 ,调节血小板脂质代谢和糖原分解代谢 ,使血栓烷Ａ2 (ＴＸＡ2 …     

MTDH基因沉默对B淋巴瘤细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨异黏蛋白(MTDH)基因沉默对B淋巴瘤细胞增殖及侵袭能力的影响。方法在B淋巴瘤细胞Raji中转染MTDH siRNA和siRNA对照,分别命名为MTDH siRNA组和siRNA对照组,将没有转染的细胞作为对照组。qRT-PCR和Western blot方法检测细胞中MTDH表达水平,MTT方法检测细胞增殖和黏附能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室检测细胞侵袭及迁移能力,Western blot检测细胞中波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白水平。结果MTDH siRNA细胞中MTDH mRNA和蛋白水平均明显低于对照组和siRNA对照组(P<0.05)。与对照组和siRNA对照组比较,MTDH siRNA细胞增殖和黏附能力降低,细胞凋亡率升高,细胞侵袭和迁移能力也降低,细胞中Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低,Cleaved Caspase-3蛋白水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论MTDH基因沉默下调B淋巴瘤细胞增殖能力,抑制B淋巴瘤细胞侵袭和迁移。     

抑癌基因PTEN及其与原发性肝癌相关性研究进展

PTEN基因是迄今发现的第一个具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因，通过对多条细胞内信号转导通路的去磷酸化调节，参与细胞的生长、增殖、凋亡、迁移和血管生长等过程，该基因的突变失活与多种肿瘤发生、发展有密切关系。本文就PTEN基因及其突变失活在肝细胞癌的发生、发展中的作用作一综述。     

去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因与血管平滑肌细胞增殖(英文)

背景:线粒体融合素2基因作用于血管平滑肌细胞Ras蛋白,通过胞外信号调节蛋白激酶1/2通路抑制细胞增殖.线粒体融合素2基因氨基酸序列第442位丝氨酸为蛋白激酶A磷酸化位点,与其磷酸化状态密切相关,能参与其功能调控.目的:观察大鼠线粒体融合素2基因在去除蛋白激酶A磷酸化位点后对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其相关信号通路.方法:利用已构建的携带绿色荧光蛋白基因、线粒体融合素2基因和去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因的3种重组腺病毒,感染大鼠主动脉血管平滑肌细胞,将其传代培养3～10代后以抽签法随机分为4组:①不加干预的对照组.②感染携带绿色荧光蛋白的对照组(Adv-GFP组).⑨感染携带线粒体融合素2基因的实验组(Adv-Mfn2组).④感染携带去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因的实验组(Adv-Mfn2-PKA(△)组).激光共聚焦显微镜观察完整的和去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因在细胞中的定位.Westernblot检测p-ERK1/2表达水平及完整的和去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因在血管平滑肌细胞中的表达.MTT法绘制细胞生长曲线.结果与结论:完整的和去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因在血管平滑肌细胞中均表达蛋白特异性条带.两种基因表达产物都主要分布于线粒体外膜.与对照组和Adv-GFP组相比,Adv-Mfn2组吸光度值在第3,4,5,6天都显著降低(P＜0.01＝,Adv-Mfn2-PKA(△)组吸光度值无明显变化.与对照组和Adv-GFP组相比,Adv-Mfn2组p-ERK1/2表达水平显著降低(P＜0.01＝,Adv-Mfn2-PKA(△)组无明显变化.提示去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因定位于线粒体外膜,对血管平滑肌细胞的增殖无拮抗作用,对胞外信号调节蛋白激酶1/2通路无抑制作用.     

脑衰反应调节蛋白-2在细胞迁移和非神经系统相关疾病中的研究

脑衰反应调节蛋白-2(CRMP-2)是一种多功能调节蛋白,它不仅在哺乳类动物的神经系统内高度表达,而且在T细胞、肿瘤细胞和正常上皮细胞等非神经系统的细胞和组织中存在表达。在神经系统中,CRMP-2在促进神经轴突生长、维持神经细胞极性、神经元迁移等方面均起着重要作用。在非神经系统中,CRMP-2正向调节T细胞骨架重组和细胞迁移,负向调节肿瘤细胞的迁移水平,并以磷酸化形式参与肿瘤细胞增殖,被认为可能成为某些恶性肿瘤的生物标志物和治疗靶点。     

Ca~(2+)-CaM系统在调节血管平滑肌收缩中的地位与作用

Ca~(2+)是血管平滑肌兴奋收缩的重要偶联因子.当血管平滑肌细胞兴奋,导致细胞内游离Ca~(2+)浓度增高时,Ca~(2+)与CaM形成复合物,活化MLCK,从而使肌球蛋白轻链发生磷酸化,触发血管平滑肌收缩.     

Bcl-2基因家族与细胞凋亡及其在脑缺血中的表达

研究表明原癌基因 Bcl 2是调节细胞凋亡途径中的一个重要调节基因。随着研究的不断深入 ,又发现许多基因结构与 Bcl 2相似 ,具有保守的 BH1和BH2区 ,序列却与 Bcl 2均具有不同程度同源性的基因参与细胞凋亡的调节 ,它们通过相互作用 ,正向或反向调节细胞的凋亡 ,因此将这些基因统称为Bcl 2基因家族。根据它们对细胞凋亡作用结果的不同 ,可将 Bcl 2家族成员分为两类 ,一类能促进细胞凋亡 ,有Bax、Bcl xs、Bad、Bak;另一类能抑制细胞凋亡 ,有 Bcl 2、Bcl x L、Mcl 2、Bag l、Al、ced 9和一些病毒基因。研究表明 ,Bcl 2基因及其家族成…     

IFN-γ对AKT基因激活的32D细胞的影响及作用机制探讨

目的 观察IFN-γ对AKT基因激活的小鼠髓系祖细胞系(32D细胞)的影响,探讨IFN-γ对造血细胞增殖和凋亡双向调节的可能机制.方法 用质粒转导技术使32D细胞高表达AKT基因,以IFN-γ作用32D细胞,用水溶性四氮唑(WST-1)细胞增殖检测法检测细胞增殖水平,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测磷酸化胞外信号调节激酶(p-Erk)1/2、信号转导和转录活化蛋白(Stat)3、p-Stat3的表达.结果 ①低浓度(100 U/ml)IFN-γ能促进32D细胞增殖、抑制凋亡,高浓度(1000 U/ml)IFN-γ则相反(100 U/ml处理24 h细胞密度为0.238±0.010;而1000 U/ml处理后为0.106±0.010,未处理组为0.170±0.010).②低浓度IFN-γ可使32D细胞内Stat3磷酸化水平升高(1124±13),高浓度时减低(601±13).③转染激活型AKT质粒的32D细胞(激活型细胞)较其他组细胞的增殖率显著增高、凋亡率明显降低[分别为0.287±0.010、(9.57±0.17)%](P＜0.05).④激活型32D细胞较其他组细胞p-Erk1/2蛋白表达明显减低(P＜0.05).结论 ①IFN-γ对32D细胞有双重作用,即低浓度促进细胞增殖、抑制凋亡,高浓度抑制细胞增殖、促进凋亡.②IFN-γ对32D细胞的双重效应可能是通过Stat3的磷酸化水平的增减实现的.③激活型AKT能明显促进32D细胞增殖、抑制凋亡,IFN-γ可通过调控AKT来调节细胞增殖及凋亡.④AKT激活后可以抑制Erk信号通路,可能是通过抑制Rafl的修饰实现的.     

tMfn2基因抑制血管平滑肌细胞增殖的作用与机制

目的 比较线粒体融合素基因2(Mfn2)和去除穿膜区序列的大鼠线粒体融合素基因2(tMfn2)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的作用,探讨tMfn2基因对VSMCs增殖的影响及其相关的信号通路.方法 用携带tMfn2基因和Mfn2基因的重组腺病毒(Adv-tMfn2和Adv-Mfn2)感染VSMCs,检测tMfn2蛋白和Mfn2蛋白在细胞中的表达水平;细胞计数法、四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测VSMCs的增殖;流式细胞术检测tMfn2基因对VSMCs周期的影响;Western blot分析各组磷酸化ERK1/2和磷酸化Raf-1蛋白表达水平的变化;采用方差分析对数据进行统计学处理.结果 Adv-tMfn2和Adv-Mfn2感染VSMCs后能有效表达出相应蛋白;细胞计数和MTT结果显示,tMfn2和Mfn2均使VSMCs增殖受到明显抑制(P<0.01),且前者较后者抑制效果更明显(P<0.01);流式细胞术结果表明tMfn2和Mfn2使多数VSMCs停滞于G0/G1期,细胞比例为(88.01±4.38)%和(67.43±6.21)%,可见tMfn2基因对细胞剧期的影响更明显(P<0.01).进一步研究表明tMfn2比Mfn2更能降低磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)和磷酸化Raf-1(p-Raf-1)的表达水平(P<0.01).结论 与Mfn2基因相比,tMfn2基因更能显著抑制VSMCs增殖,使细胞周期停滞于G0/G1期.这一作用主要通过抑制Ras-Raf-ERK1/2信号通路,下调磷酸化Raf-1蛋白表达,进而抑制ERK1/2的磷酸化而实现.     

血清和糖皮质激素调节蛋白激酶3（SGK3）过表达对乳腺癌细胞迁移的影响

目的探讨SGK3基因对乳腺癌细胞侵袭转移能力的影响。方法构建pEGFP-N1-SGK3重组质粒,用载体质粒pEGFP-N1和重组质粒pEGFP-N1-SGK3转染乳腺癌MCF7细胞;MTT法观察转染细胞的增殖情况,Tran-swell细胞迁移实验检测SGK3过表达对细胞迁移能力影响,RT-PCR检测相关基因表达,Western blot检测SGK3过表达对Wnt/β-catenin信号通路关键因子的影响。结果利用pEGFP-N1-SGK3质粒转染乳腺癌MCF7细胞,建立表达SGK3蛋白的细胞系;细胞增殖实验发现,SGK3的过表达使MCF7细胞生长速度加快;细胞迁移实验发现过表达SGK3的细胞运动迁移能力增强,其可使mmp9的表达增强,而brms1表达无明显变化;Western blot结果显示SGK3过表达可增加乳腺癌细胞磷酸化的GSK3β水平。结论 SGK3的过表达通过影响Wnt/β-catenin信号通路中的GSK3β磷酸化而增强细胞迁移能力。     

RhoC-siRNA联合Rapamycin对肝癌细胞Bel7402侵袭和迁移的影响

目的探索RhoC-siRNA联合Rapamycin(Rapa)对肝癌细胞Bel7402侵袭和迁移的影响。方法以人肝癌细胞Bel7402为对象,设空白对照组、阴性质粒组、RhoC-siRNA组、RhoC-siRNA联合Rapa组、阴性质粒联合Rapa组、Rapa组、溶媒组,分别采用RhoC基因沉默、Rapa或RhoC基因沉默联合Rapa处理,半定量RT-PCR法比较细胞周期蛋白相关基因CDK2、P16mRNA和侵袭相关基因MMP-2、MMP-9、VEGFmRNA的表达,Transwell小室检测细胞迁移。结果RhoC基因沉默及Rapa可明显抑制肝癌细胞侵袭及迁移,二者联合应用上述效果更加明显。RhoC-siRNA组及Rapa组MMP2、MMP9、VEGF、CDK2基因表达降低,P16基因表达升高(P<0.05)。RhoC-siRNA联合Rapa组MMP2、MMP9、VEGF、CDK2基因表达水平显著下降,P16基因的表达水平显著升高(P<0.05)。RhoC-siR-NA联合Rapa显著抑制肝癌细胞迁移(P<0.01)。结论RhoC-siRNA质粒转染及Rapa可明显抑制肝癌细胞Bel7402的侵袭及迁移;二者联合应用可进一步加强上述效应。     

原肌球蛋白分子生物学特征及其与肌病发生相关性的研究

目的 明确哺乳动物的 4个原肌球蛋白( TM)基因及其突变时与骨骼肌无力、肥大性心肌病的关系,以期为预防性措施和康复干预提供支持. 资料来源应用计算机检索 Medline、万方数据库 1987- 01 /2004- 08期间有关 TM的实验及临床研究的研究原著,英文检索词" tropomyosin, gene, mutation";中文检索词"原肌球蛋白、基因、突变",限定语言种类为英文和中文. 资料选择对检索到的文献进行初审,排除题目含"个案、经验、体会"等综述及非研究原著类的文章,然后对剩余文献查找原文,以是否为随机对照临床试验( RCT)作为纳入标准. 资料提炼共收集到 30篇关于原肌球蛋白分子生物学的研究与进展的随机和非随机试验.其中 21篇符合纳入标准,排除 9篇. 资料综合研究提示,原肌球蛋白( TM)是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白质,它以大量异构体形式广泛分布于各种真核细胞中.哺乳动物中的 4个 TM基因已被确认,至少可表达出 20种 TM异构体.不同的 TM基因突变分别可引起不同的疾病. 结论 4个已被确认的 TM基因分别命名为 TPM1, TPM2, TPM3, TPM4.其中 TPM1基因突变与家族性肥大性心肌病有关;而 TPM3基因突变与线状肌病和骨骼肌无力有关.目前,对 TM的研究已不仅仅局限在肌肉收缩过程中,其对血管平滑肌细胞类型转换的作用等研究已受到越来越广泛的关注.随着对 TM基因研究的不断深入, TM基因突变与各种疾病的关系会越来越明了,基因工程的应用将会从本质上诊治疾病,从而彻底地改变医学行为和患者的生活质量.