两个同源重组血友病家系的基因诊断

目的探讨特殊血友病家系的基因诊断。方法通过FⅧ基因内含子22倒位及内含子1倒位的直接检测与遗传连锁分析的间接诊断相结合对1个血友病A（HA）家系进行基因诊断；采用核酸直接测序法对FⅨ各外显子及其侧翼序列进行检测，并联合FⅨ基因相关的6个微卫星（STR）位点对1个血友病B（HB）家系进行基因诊断。结果HA家系先证者为FⅧ内含子1倒位阳性，家系中要求做携带者诊断的女性成员为内含子1倒位携带者；而FⅧ基因内外8个多态性位点遗传连锁分析证实该女性成员发生同源染色体重组。HB家系先证者除7号外显子测序未成功外，其余部分均未找到突变，家系中要求做携带者与产前诊断的女性，其羊水细胞经直接核酸测序未找到突变，利用FⅨ相关的6个STR位点进行遗传连锁分析发现该女性有染色体同源重组现象存在，胎儿为正常男性。结论在应用间接诊断方法进行HA和HB的携带者及产前基因诊断时，要考虑到染色体同源重组现象的发生可能导致误诊与漏诊的情况。在中国人群中应该开发更多的FⅧ和FⅨ分子中信息量大的多态性位点，以提高HA和HB的携带者及产前诊断的准确率。     

血友病A／B的携带者和产前诊断研究

目的：建立一套简易、快速且准确率高的血友病携带者和产前诊断体系。方法：对血友病A（HA）家系采用长距离聚合酶链反应（LD-PCR）及序列特异PCR进行F8基因内含子22及内含子1倒位检测。对有家族史的HA家系可联合F8基因内外的8个多态性位点进行遗传连锁分析．产前诊断加测性别位点（Amelo）。而对散发家系，则通过直接核苷酸测序查找先证者的基因突变，继而对家系女性成员进行携带者与产前诊断。对血友病B（HB）家系，采用直接核苷酸测序法确定其基因突变．结果：100个HA家系中。22例先证者的F8基因内含子22倒位检测结果为阳性；2例患者母亲为F8基因内含子1倒位的携带者：对有家族史的家系，综合应用倒位检测和遗传连锁分析，携带者与产前诊断率均为100％。34个HA散发家系除2个家系外均可找到致病突变：发现可能携带者105例，产前诊断65例，总诊断率为95．9％：23个HB家系中19个家系通过直接测序可找到突变．而联合F9基因外6个STR位点对HB家系进行遗传连锁分析，发现31例可能携带者及需产前诊断者16例，总诊断率为95．7％。结论：F8基因内含子22及1倒位筛检联合F8基因内、外多个位点的遗传连锁分析．可作为HA的携带者检测及产前诊断的方法；直接核苷酸测序可确定F9基因突变．而联合基因外多个多态性位点检测并进行遗传连锁分析．是HB携带者检测及产前诊断的简便、快速方法。     

血友病携带者与产前基因诊断

目的建立1种简便、快速的血友病携带者检测与产前诊断体系。方法对38个血友病A家系,用长链PCR及序列特异PCR作F8基因内含子22及1倒位检测;有家族史家系可联合F8基因内外的8个多态性位点进行遗传连锁分析,DXS 52(ST14)位点多态性以PCR产物凝胶电泳法检测,7个STR位点(F8C ivs13、CA22、DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108)的多态性以多重荧光PCR法检测,产前诊断加用性别位点(Amelo);对于散发家系,通过直接核苷酸测序查找先证者的基因突变,继而对家系女性成员作携带者与产前诊断。对12个血友病B家系采用直接核苷酸测序法确定基因突变,多重荧光PCR法检测F9基因外6个STR位点(DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102)的多态性。结果38个血友病A家系中,10名先证者的F8基因内含子22倒位检测为阳性,1例先证者为F8基因内含子1倒位阳性,对于有家族史的家系,综合应用倒位检测和遗传连锁分析,携带者与产前诊断率均为100%;4个散发家系均可找到致病突变;38个血友病A家系的携带者及产前诊断总诊断率为94.81%。12个血友病B家系中有10个家系通过直接测序可找到突变,联合F9基因外6个STR位点对血友病B家系的遗传连锁分析的可诊断率为96.88%。结论F8基因内含子22及1倒位筛检联合F8基因内、外多个位点的遗传连锁分析可以进行血友病A的携带者及产前诊断;直接核苷酸测序可确定F9基因突变,而联合基因外多个多态性位点检测并进行遗传连锁分析,是血友病B携带者检测与产前诊断的简便、快速的方法。     

BclⅠ和HindⅢ位点在家系性血友病A基因诊断的意义

本研究旨在探讨FⅧ基因内含子18的BclⅠ及内含子19的HindⅢ多态性位点在血友病A(haemophiliaA,HA)患者及家系成员的基因诊断与携带者检出中的应用价值。对8个HA患者及其家系成员45人运用聚合酶链反应-限制性片断多态性(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法对X染色体FⅧ基因内含子18的BclⅠ及内含子19的HindⅢ位点进行多态性分析。应用中国遗传咨询网在线家系图绘制工具PediDraw软件绘制家系图。结果表明,联合检测BclⅠ及HindⅢ位点可对8个HA家系中的5个作出诊断,诊断率约为62.57%,且有2个家系同时伴有2个位点的突变。该8个家系11名可疑携带者中6名可作出携带者诊断,携带者的检出率为54.5%。结论:联合运用BclⅠ及HindⅢ位点进行HA患者家系分析可提高HA患者及携带者的诊断率。     

LD-PCR检测FⅧ基因XbaⅠ位点多态性及其在血友病A携带者诊断中的应用

目的建立高特异性的针对凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22中XbaⅠ多态性位点的连锁分析法,以用于血友病A家系携带者的诊断。方法采用长距离PCR(LD-PCR)方法,特异性地扩增FⅧ基因内含子22中的XbaⅠ位点所在区域,用限制性内切酶XbaⅠ酶切,对5个血友病A家系作家系连锁分析,并对其中可提供多态性信息的家系作携带者诊断。结果家系1中确诊女性携带者1名及1名正常女性成员;家系2中确诊1名女性携带者;而家系3、家系4和家系5该位点无法提供多态性信息。结论基于LD-PCR的FⅧ基因XbaⅠ位点连锁分析方法具有较高的准确性和可靠性,这对临床上诊断血友病A携带者具有积极的意义。     

凝血因子Ⅷ内含子X ba Ⅰ多态位点检测及其在血友病A产前诊断中的应用

目的建立凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22的 Xba Ⅰ多态位点高特异的基因连锁分析法,并应用于血友病 A(HA)家系中孕妇携带者检测及产前基因诊断。方法用长距离 PCR 特异性扩增206个无血缘关系个体中 FⅧ基因内含子226.2 kb 片段并进行Ⅹba Ⅰ酶切,计算Ⅹba Ⅰ多态性位点的基因频率和多态信息量;用内含子22倒位检测及 FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ,Bcl Ⅰ,Hind Ⅲ和(CA)n 二核苷酸重复序列多态性位点和 FⅧ基因外 DXS52多态性位点对20个 HA 家系进行间接基因诊断。结果ⅩbaⅠ多态性位点的基因频率和多态信息量分别是0.5475和0.4955;20个 HA 家系中,7个为内含子22倒位,13个非倒位家系中有6个家系Ⅹha Ⅰ均提供多态信息,其中2个家系只能用Ⅹba Ⅰ作出分子诊断,诊断率达46.15%;两个或两个以上连锁分析方法均提供多态信息的有8个家系。结论改进的 FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ多态位点是一个特异性高,信息量大的分子诊断标志。联合用22内含子倒位及Ⅹba Ⅰ等5种间接检测方法大大地提高了 HA 基因诊断率,是防止患儿出生,阻断致病基因传递的有效措施。     

倒位PCR法检测血友病A FⅧ基因内含子22/1倒位

目的建立血友病A（hemophilia A,HA）FⅧ基因第22内含子倒位PCR检测法,并初步应用于HA直接基因诊断。方法应用倒位PCR（inversion-PCR,I-PCR）方法对24个HA家系中所有先证者的FⅧ基因22内含子倒位进行检测,对检测阳性者的母亲进一步用上述方法行携带者诊断,并对其中1例进行羊水产前基因诊断。检测阴性者再行内含子1倒位筛查。结果 24个HA家系中,7例先证者的F基因内含子22倒位检测为阳性,阳性检出率、可诊断率分别为29.17%、100%,未发现内含子1倒位;7例内含子22倒位突变阳性患者的母亲有6例为倒位携带者,羊水诊断未发现内含子22/1倒位。结论 I-PCR法能准确地检测F基因22内含子倒位突变,可应用于HA患者及携带者FⅧ基因22内含子倒位基因诊断及产前诊断。     

凝血因子Ⅷ内含子ⅩbaⅠ多态位点检测及其在血友病A产前诊断中的应用

目的建立凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因内含子22的Ⅹba Ⅰ多态位点高特异的基因连锁分析法，并应用于血友病A（HA）家系中孕妇携带者检测及产前基因诊断。方法用长距离PCR特异性扩增206个无血缘关系个体中FⅧ基因内含子226．2kb片段并进行Ⅹba Ⅰ酶切，计算Ⅹba Ⅰ多态性位点的基凶频率和多态信息量；用内含子22例位检测及FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ，BclⅠ，HindⅢ和（CA）n二核苷酸重复序列多态性位点和FⅧ基因外DXS52多态性位点对20个HA家系进行间接基因诊断。结果ⅩbaⅠ多态性位点的基因频率和多态信息量分别是0．5475和0．4955；20个HA家系中，7个为内含子22倒位，13个非倒位家系中有6个家系Ⅹba Ⅰ均提供多态信息，其中2个家系只能用Ⅹba Ⅰ作出分子诊断，诊断率达46．15％；两个或两个以上连锁分析方法均提供多态信息的有8个家系。结论改进的FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ多态位点是一个特异性高，信息量大的分子诊断标志。联合用22内含子倒位及Ⅹba Ⅰ等5种间接检测方法大大地提高了HA基因诊断率。是防止患儿出生，阻断致病基因传递的有效措施。     

两个特殊血友病A患者家系的基因诊断

目的 探讨特殊血友病A(HA)家系的基因诊断。方法 用内含子22倒位检测及FⅧ基因内外4个位点的多态性进行遗传连锁分析;用核酸直接测序法对FⅧ各外显子及其侧翼序列进行检测。结果 家系1先证者表型为重型HA,FⅧ内含子22倒位检测及FⅧ基因内外4个位点的多态性遗传连锁分析未获得诊断信息;直接核酸测序证实先证者及其妹FⅧ基因24号外显子第2209位氨基酸存在R2209Q错义突变,后者胎儿DNA检测为正常男性。家系2中HA先证者已去世,一名要求做携带者检测的女性表型正常,内含子22倒位检测及直接核酸测序没有发现基因缺陷,用FⅧ基因内外4个位点的多态性遗传连锁分析均显示该成员未携带血友病A基因。结论 联合应用直接核酸测序法及多态性遗传连锁分析可以对特殊血友病A家系进行基因诊断。     

无先证者血友病A家系的基因诊断

目的 :探讨无先证者血友病A(hemophilia A,HA)家系的基因诊断。方法 :对5个无先证者的HA家系,采用长距离PCR及序列特异PCR直接检测疑似携带者的凝血因子Ⅷ(coagulation factorⅧ,FⅧ)基因内含子22倒位及1倒位;对其中未检测出的家系通过联合FⅧ基因内外的7个STR位点(FⅧCivs13、Intron25、3_486、5_147、5_226、DXS8069、DXS1073)进行遗传连锁分析,对于有产前诊断要求的孕妇则结合其男性胎儿脐带血的FⅧ活性检测结果作出分析。结果 :5个HA家系中,有3例疑似携带者的FⅧ基因内含子22倒位检测结果为阳性,1例疑似携带者的FⅧ基因内含子1倒位检测结果为阳性。对于另1例22倒位、1倒位检测结果均为阴性但有产前诊断要求的孕妇,通过联合FⅧ基因内外的7个STR位点进行遗传连锁分析,发现胎儿是携带1条致病X染色体的男性,且胎儿脐带血的FⅧ活性为1%,故联合诊断胎儿为男性HA患者。结论:在无HA先证者情况下,通过FⅧ基因内含子22及1倒位筛检,联合FⅧ基因内、外多个位点的遗传连锁分析及胎儿脐带血FⅧ活性检测,可为家系女性携带者的诊断及产前诊断提供有用信息。