抗原冲击致敏的树突状细胞介导的特异性体外抗慢性粒细胞白血病细胞作用

为研究慢性粒细胞白血病 (CML)细胞冻融抗原 (CLA)致敏的树突状细胞 (DC)对特异性抗白血病的作用 ,将CML患者外周血单个核细胞来源的DC在体外用CLA致敏 ,再与CML患者的经细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共同培养。应用乳酸脱氢酶释放法观察其对自身CML细胞 ,K5 6 2细胞和Raji细胞的杀伤活性 (CIK +CLA DC组 ) ,与未致敏的DC +CIK(CIK +DC组 ) ,CIK组及CIK +CLA组进行比较。结果表明 ,效靶比为 2 5∶1时细胞杀伤活性最强 ,在该效靶比下 ,4组细胞对自身CML细胞的杀伤活性分别为 (6 8 8± 14 2 ) % ,(5 2 5± 9 4 ) % ,(2 0 7± 7 5 ) %和 (2 4 2± 8 7) %。CIK +CLA DC组杀伤活性最强 ,与其余 3组比较有显著性差异 (P <0 0 1) ;CIK +DC组比CIK组杀伤活性强 (P <0 0 1) ;CIK组与CIK +CLA组比较无显著性差异 (P >0 0 5 )。CIK +CLA DC组在效靶比为 2 5∶1时对自身CML细胞 ,K5 6 2细胞和Raji细胞的杀伤活性分别为 (6 8 8± 14 2 ) % ,(14 6± 6 2 ) %和 (12 7± 10 2 ) % ,与K5 6 2细胞和Raji细胞比较 ,具有显著性差异 (P <0 0 1)。结论 :CIK对CML患者自身细胞具有一定的杀伤活性 ;CIK与CML DC共培养组对自身CML细胞杀伤活性比CIK组强 ;CIK与CLA抗原致敏CML DC共培养组具有最强的杀伤活性。CLA抗原     

热休克胃癌细胞负载DC-CIK细胞杀伤癌细胞活性的研究

目的研究负载相关抗原的树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞对胃癌细胞的杀伤作用。方法取健康人外周血并分离出外周血单个核细胞(PBMC),经不同细胞因子分别诱导出DC和CIK细胞,热休克方法处理胃癌MKN-28细胞株并制备肿瘤抗原用于负载DC,与CIK细胞共培养,以流式细胞术检测DC、CIK细胞表型,MTS法检测CIK细胞对MKN-28细胞的杀伤作用。结果 CIK与DC共培养后,与单纯CIK细胞相比较,增殖活性明显提高,CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞数增多并且具有更强的杀瘤活性,效靶比为20.0∶1时,负载MKN-28抗原的DC-CIK(Ag-DC-CIK)组对MKN-28的杀伤活性为(57.96±2.23)%,远大于未负载MKN-28抗原的DC-CIK组[(38.02±2.06)%]和单纯CIK组[(29.78±1.84)%],差异具有统计学意义(P<0.05)。结论以热休克凋亡肿瘤细胞抗原负载的DC能促进CIK细胞增殖分化,并提高其对胃癌细胞的杀伤活性。     

树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对耐药K562细胞的体外杀伤作用

目的研究细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞与同源树突细胞(DC)共培养后CIK细胞的增殖活性及表型的变化,并观察其对K562、K562/ADM细胞毒作用的影响。方法采集健康供者外周血单个核细胞(MNC)用于诱导培养CIK细胞及成熟DC,将成熟DC和CIK细胞混合培养,用MTT法检测DCCIK共培养细胞杀伤K562细胞及其耐药株的活性。结果在2.5～20.0效靶比范围内,CIK细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤率分别为(20.0±1.2)%～(61.1±2.2)%和(17.5±2.1)%～(45.2±3.3)%;DCCIK共培养细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤率分别为(25.2±2.3)%～(70.9±4.1)%和(22.4±2.7)%～(62.3±5.0)%。CIK细胞对K562敏感株和耐药株杀伤率的差异无统计学意义,DCCIK细胞对敏感株和耐药株的杀伤作用差异亦无统计学意义;DCCIK细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤活性均高于单纯CIK细胞组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论DC与CIK共培养细胞的增殖活性和细胞毒活性高于CIK细胞。     

树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养联合化疗对肺腺癌体外杀伤作用

目的 通过恶性胸腔积液获取成熟树突状细胞(DC),探讨恶性胸腔积液来源的DC与细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)共培养对CIK细胞的作用及两者共培养后联合奥沙利铂(L-OHP)对肺腺癌的体外杀伤作用.方法 收集20例非小细胞肺癌(NSCLC)患者的胸腔积液,每例收集800～1 000 ml,双层聚蔗糖(Ficoll)密度梯度离心获得DC前体细胞,体外诱导培养收获成熟DC;分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),体外培养获得CIK细胞;DC与CIK细胞共培养;流式细胞仪鉴定表型;MTT法检测对肺腺癌的体外杀伤作用.结果 ①恶性胸腔积液中存在DC前体细胞,经体外细胞因子诱导培养后可获得成熟的DC,培养9天的DC表面标志物CD80、CD83、CD86及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR与第0天比较明显增高,分别为(56.61±7.01) % vs (14.38±5.16)%,(58.85±7.05)% vs (18.49±9.43)%、(60.27±13.94)% vs (20.39±6.67)%、(70.97±8.96)% vs (41.36±8.57)%(均P＜0.01).②培养14天后,DC与CIK细胞共培养较单独CIK培养中CD3+/CD56+、CD3+、CD4+、CD8+细胞明显增多(均P＜0.01);对肺腺癌细胞杀伤作用明显增强(P＜0.01).③DC与CIK细胞共培养联合L-OHP治疗对肺腺癌细胞的杀伤率明显高于单独治疗(P＜0.01).结论 胸腔积液来源的DC前体细胞在体外诱导培养可获得功能正常的成熟DC,与CIK细胞共培养后促进CIK细胞增殖、增强其杀伤作用;两者共培养后联合L-OHP具有协同作用,对肺腺癌在体外有明显的抑制作用,为肺癌综合治疗提供了一定的理论基础.     

细胞因子诱导的杀伤细胞与肿瘤浸润淋巴细胞体外细胞毒活性比较

目的比较用多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与癌性胸水中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细胞毒活性,为临床应用提供依据.方法用不同的细胞因子分别诱导培养CIK和癌性胸水TIL,按常规法计数细胞增殖量,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测其细胞毒活性.结果诱导培养14 d后,CIK细胞毒活性为(76.65±16.78)%,增殖倍数为520±102;TIL细胞毒活性为(55.31±11.02)%,增殖倍数为182±78.结论CIK细胞对K562细胞的细胞毒活性在14 d时达峰值,而TIL细胞在2l d时才达峰值,且CIK细胞毒活性明显高于TIL细胞,增殖细胞数量也比TIL细胞高.CIK可替代TIL细胞进行胸腔注射治疗癌性胸水.     

K562/MDR细胞与树突细胞融合诱导P170蛋白特异的细胞毒性T淋巴细胞应答

目的通过细胞融合方法将P170抗原负载树突细胞(DC),探讨能否有效诱导P170蛋白特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。方法通过贴壁黏附获得外周血单核细胞,用GM-CSF+ IL-4诱导培养DC,并以TNF-α促进DC成熟,于第7天收获DC,然后分3组:①DC与耐药细胞系K562/MDR细胞融合以负载P170抗原;②DC与K562／MDR细胞共培养;③单独DC培养。通过流式细胞术(FCM)检测PE-P170／FITC-HLA-ABC抗体双标细胞来评估融合率。将3组细胞分别与T细胞共同孵育5 d,通过MTT法比较各组T细胞对P170+靶细胞K562／MDR及HL-60／VCR的杀伤活性。结果采用PEG-DMSO诱导的DC与K562／MDR细胞的融合效率为(22．39±2．55)％,融合细胞同时表达DC表型和P170分子,HLA-ABC和P170双阳性表达率为(26．90±3．63)％,明显高于共培养组的(4．52±1．77)％,融合细胞能激活T淋巴细胞,显示出对P170+靶细胞产生抗原特异细胞毒作用,效靶比为25:1时,对K562／MDR细胞的杀伤率为(65．75±4．65)％,明显高于共培养组[(22．15±2．40)％]。结论K562／MDR与DC融合能够诱导P170蛋白特异的CTL应答,可用于多药耐药白血病的免疫治疗。     

CD—CIK细胞对急性白血病细胞体外杀伤作用的研究

目的 探讨树突状细胞(DC) 对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK) 增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平以及抗白血病细胞作用的影响.方法 健康人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照.用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA双抗体夹心法检测分泌干扰素γ(IFN-γ) 、白细胞介素12(IL-12) 的水平.结果 DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞(P<0.05);DC,CIK细胞共培养后,CD3+CD8+,CD3+CD56+双阳性细胞比率较同条件下CIK细胞组显著增多(P<0.05);共培养3 d,DC-CIK细胞上清液中IL-12,INF-γ分泌量均比CIK细胞单独培养的分泌量高(P<0.01,P<0.05);在5∶1～40∶1的效靶比范围内,DC-CIK细胞对白血病细胞的杀伤率显著高于CIK细胞(P<0.05),且杀伤率与效靶比呈正相关.结论 DC-CIK细胞增殖能力和抗白血病活性显著高于CIK细胞,DC-CIK细胞可作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗策略.     

急性髓系白血病细胞总RNA冲击的树突细胞诱导抗自身白血病的T细胞免疫

目的探讨白血病细胞RNA冲击的完全缓解期的急性髓系白血病(AML-CR)患者骨髓单个核细胞(BMMNC)衍生的树突细胞(mRNA-DC)体外刺激自体T细胞抗白血病免疫的可行性及有效性。方法应用联合细胞因子(GM-CSF、IL-4)培养法从AML-CR患者贴壁BMMNC诱导DC,在诱导的第5天用脂质体DOTAP介导法以自体白血病细胞的总RNA冲击DC,然后以含10 ng/m l的TNF-α的培养基继续培养24 h促进其成熟,培养7 d后收获细胞,作为mRNA-DC。以流式细胞术检测DC特征性表型的表达;以MTT法测定mRNA-DC对自体T细胞的促增殖活性;将mRNA-DC与T细胞按1∶3混合,共培养7 d,收获活化的T细胞,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)测定分泌γ干扰素(IFN-γ)阳性细胞数;乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定细胞毒活性。结果14例AML-CR患者BMMNC均可在体外分化为具有特征性形态和表型的成熟DC;当刺激细胞与反应细胞比例为1∶16时,mRNA-DC可刺激自体T细胞产生明显的增殖活性[(36.84±5.68)%],与未冲击DC组[(12.20±3.16)%]比较差异具有统计学意义(P<0.05,n=9);ELISPOT分析显示分泌IFN-γ的mRNA反应性的T细胞得到明显扩增;体外活化的T细胞在效靶比为20∶1时,对自体白血病细胞显示明显的杀伤活性[(45.46±6.34)%],与未冲击的DC组[(12.32±1.32)%]及单纯IL-2组[(13.26±2.28)%]比较,差异有统计学意义(P<0.05,n=5)。结论应用白血病细胞RNA冲击的DC疫苗免疫可以作为一种可行、有效的防治微量残留白血病的方法。     

转染反义VEGF cDNA抑制K562细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成

目的　探讨转染反义血管内皮细胞生长因子 (VEGF)cDNA对慢性髓系白血病 (CML)急变细胞株K5 6 2裸鼠体内生长的影响。方法　利用转染反义 (AS)、正义 (S)VEGF1 2 1 cDNA及空载体 (V ,pcDNA3质粒 )的K5 6 2细胞株 ,观察转染细胞在裸鼠体内成瘤及生长情况 ;免疫组化法比较其裸鼠移植瘤微血管密度 (MVD) ;MTT法观察其对骨髓内皮细胞体外增殖的影响。结果　转染反义VEGF1 2 1 cDNA的K5 6 2 AS细胞组的瘤块体积小、生长慢于K5 6 2 V组 [(2 0 7.5± 192 .9)mm3 vs (4 45 .0± 15 0 .9)mm3 ,P <0 0 5 ],而K5 6 2 S组瘤块体积大于K5 6 2 V组 [(1174.6± 5 0 8.7)mm3 vs (4 45 .0± 15 0 .9)mm3 ,P <0 .0 1]。K5 6 2 AS组裸鼠体内肿瘤MVD低于K5 6 2 V组 [(11.0± 7.6 ) 0 .72mm2 vs (18.9± 7.0 ) 0 .72mm2 ,P <0 0 5 ],而K5 6 2 S组则高于K5 6 2 V组 [(5 0 .8± 11.7) 0 .72mm2 vs (18.9± 7.0 ) 0 .72mm2 ,P <0 .0 1]。K5 6 2 AS细胞的培养上清刺激骨髓内皮细胞增殖能力弱于K5 6 2 V ,而K5 6 2 S细胞的结果相反。结论　转染反义VEGF1 2 1 cDNA抑制K5 6 2细胞裸鼠体内肿瘤生长 ,降低裸鼠瘤块内MVD ,对骨髓内皮细胞的刺激增殖作用减弱     

树突细胞融合瘤苗对脐血源性CIK/NK细胞杀伤作用的影响

目的研究K562、Raji肿瘤细胞树突细胞(DC)融合瘤苗对脐血来源细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞/自然杀伤(NK)细胞杀伤作用的影响。方法诱导脐血单个核细胞成为DC、CIK/NK细胞,通过聚乙二醇将灭活K562和Raji肿瘤细胞株与DC融合形成K562-DC和RajiDC融合瘤苗。实验分为3组:DC融合瘤苗组、灭活肿瘤细胞加DC组、单纯DC组。以MTT法评价各组不同共孵育刺激对CIK/NK细胞杀伤活性的影响。结果使用不同抗原刺激的各组脐血来源CIK/NK细胞对特定肿瘤的杀伤有促进作用,但不具有特异性。在20∶1效靶比时,K562-DC和RajiDC融合瘤苗组对Raji细胞的杀伤率分别为(75.44±4.19)%和(81.33±4.18)%,RajiDC融合瘤苗组对Raji细胞的杀伤率显著高于K562-DC融合瘤苗组(P<0.05);灭活K562+DC和灭活Raji+DC组对Raji细胞的杀伤率分别为(73.12±4.22)%和(80.49±4.27)%,灭活Raji+DC组对Raji细胞的杀伤率显著高于灭活K562+DC组(P<0.01),各组对K562细胞的杀伤率比较差异无统计学意义(P>0.05)。不同效靶比CIK/NK细胞对不同种属的肿瘤细胞株的杀伤率比较,Raji细胞刺激的效果更强些。相同的肿瘤抗原刺激的或经灭活肿瘤细胞加DC刺激的CIK/NK细胞对不同种属的肿瘤细胞杀伤率差异无统计学意义。结论脐血来源的CIK/NK细胞对肿瘤细胞的杀伤为非特异性的     

柔红霉素、阿糖胞苷作用于NB4细胞的体外实验研究

目的探讨柔红霉素（DNR）联合阿糖胞苷（Ara-C）和单用DNR对急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞株NB4与另一急性髓系白血病（M2）细胞株HL-60生长抑制率、凋亡率的比较。方法用MTT法和流式细胞术分别检测NB4与HL-60细胞的生长抑制率和细胞凋亡率；采用瑞特染色法观察细胞形态。结果两组药物（DNR单药组和双药组）对NB4细胞的生长抑制率[单药组为（35．73±6.82）％，双药组为（36.75±3．82）％]、凋亡率[单药组为（22.55±3．62）％，双药组为（21.24±5．82）％]差异均无统计学意义（P〉0．05）；而对HL-60细胞的抑制率[单药组为（62．31±1.80）％，双药组为（67．17±2.07）％]、凋亡率[单药组为（41.51±0.89）％，双药组为（48.05±0．92）％]的差异均有统计学意义（P值分别〈0.01和〈0．05）；形态学检测显示，各组细胞形态学上均出现凋亡特征性改变。结论从细胞水平说明，DNR联合Ara—C与单用DNR对APL的疗效差异无统计学意义，且后者的临床不良反应明显轻于前者，因此支持单用DNR的治疗方案。     

血管内皮生长因子C对NB4细胞裸鼠种植瘤生长及血管生成的影响

目的 建立裸鼠体内NB4/VEGF-C细胞种植瘤模型,探索VEGF-C及其受体对白血病细胞生物学性状影响.方法 每组9只4～5周龄的BALB/c裸鼠,经4 Gy60Co照射后腋窝皮下分别接种1×107个NB4/VEGF-C、NB4/pcDNA3.1细胞(对照组),观察成瘤性,3周后处死裸鼠.免疫组化法检测NB4/VEGF-C细胞组种植瘤组织切片微血管密度及BCL-2蛋白表达水平.结果 NB4/VEGF-C及对照细胞在裸鼠腋下均成瘤,NB4/VEGF-C细胞组肿瘤生长速度快于对照组,NB4/VEGF-C细胞组与对照组瘤体体积分别为(631.44±114.42)mm3和(491.22±70.05)mm3,差异有统计学意义(P=0.006);NB4/VEGF-C细胞与对照组瘤块质量分别为(321.78±27.84)mg和(288.57±40.12)mg,差异有统计学意义(P=0.031).免疫组化检测显示NB4/VEGF-C细胞组种植瘤组织切片微血管密度及BCL-2蛋白表达水平高于对照组.结论 VEGF-C不仅诱发NB4细胞种植瘤体的血管新生,而且可能通过VEGFR-3信号途径促进白血病细胞增殖及上调抗凋亡蛋白BCL-2抑制细胞凋亡.

Abstract：

Objective To establish NB4/VEGF-C cells xenograft in nude mice model, and explore the effect of VEGF-C on hematological malignancies Methods NB4/VEGF-C or NB4/pcDNA3.1 cell lines were established by transfecting the recombinant pcDNA3. 1-VEGF-C plasmid and the vacant pcDNA3. 1 vector into NB4 cells. The recombinant VEGF-C was identified by RT-PCR and Western blotting. Eighteen male BALB/c nude mice aged 4-5 weeks were equally divided into two groups. Mice irradiated by 4 Gy 60Co were subcutaneously injected with 1 × 107 NB4/VEGF-C or NB4/pcDNA3. 1 cells into one side of axilla. The volumes of xenograft tumor was evaluated according to L × t2 × 0.52. Microvessel density(MVD) on the xenograft tumor section was detected by IHC with VWF antibody. Results NB4 cell xenograft tumors were developed in all mice of both the two groups. The growth of NB4/VEGF-C cells in nude mice was faster than in controls. There were statistically significant differences in the volume and weight of xenograft tumor between NB4/VEGF-C and NB4/pcDNA3. 1 cell groups [ (631.44 ± 114.42) mm3 vs (491.22 ± 70.05) mm3 ](P=0.006) and [(321.78 ±27.84) mg vs (288.57 ±40.12) mg] (P=0.031), respectively. MVD in xenograft tumor of NB4/VEGF-C cells [ (50.8 ± 11.7)/mm2 ] was higher than that in controls [ ( 18.9 ±7.0)/mm2] (P =0.021 ). The Bcl-2 protein level in NB4/VEGF-C cells xenografts was higher than that in controls. Conclusion VEGF-C could promote proliferation of NB4 cells by inducing angiogenesis and inhibit cells apoptosis by upregulating antiapoptotic Bcl-2 protein expression in NB4 cells xenograft tumor.     

自体外周血单个核细胞制备CIK细胞治疗恶性实体肿瘤应用价值研究

目的探讨自体外周血单个核细胞(PBMC)应用于恶性实体瘤过继性免疫治疗的有效性。方法选取恶性实体瘤患者100名,粒细胞动员后,单采PMBC并计数,分析相关因素;流式检测CIK细胞中NKG2D受体率及CIK细胞治疗前后外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD16+CD56+、CD3+CD56+百分率;采用LDH释放法检测PMBC及CIK细胞的杀伤活性;利用Kaplan-Meier生存曲线对比分析CIK治疗组与非治疗组的生存期差异。结果 PMBC数与采血前外周血象的WBC及MNC总数相呈正相关,相关系数r分别为0.62、0.72(P<0.05),而与采集时间及血液流速无关。对照组、实验组各组CIK的杀伤活性与PMBC杀伤活性呈正相关(r分别为0.523、0.627,P<0.05)。培养前、培养至d 7、培养至d 14时CIK细胞杀伤活性都与NKG2D受体表达率成正相关r,分别为0.413、0.5460、.657(P<0.01)。CIK回输治疗前、后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD16+CD56+、CD3+CD56数量分别为38.66±8.34及62.15±12.36(P<0.05)、30.16±10.26及38.15±9.46(P<0.05)、37.42±11.12及25.74±10.35(P<0.05)1、.15±0.12及1.89±0.12(P>0.05)、17.63±4.25及25.89±8.96(P<0.05)、0.93±0.31及5.67±1.84(P<0.05)。对照组及CIK治疗组的3年生存率平均为86.5%及79%(P<0.05)。结论实体瘤患者的自体PMBC可以用于CIK细胞的制备及治疗。     

血管内皮生长因子对CD34+干/祖细胞来源的树突细胞分化及功能的影响

目的　探讨血管内皮生长因子 (VEGF)对人脐血CD34 干 /祖细胞来源的树突细胞(dendriticcell,DC)分化和功能的影响。方法　利用免疫磁珠分离法 (MACS)分离纯化脐血CD34 造血干 /祖细胞 ,并在体外将其诱导扩增为DC ,观察VEGF在培养早期和晚期对DC分化和功能的影响。观察培养过程中细胞增殖方式 ,用流式细胞术检测DC表面分化相关抗原CD1α、CD83、CD80、CD5 4、HLA DR等的表达 ,混合淋巴细胞反应法测定DC体外刺激同种异体T细胞增殖的能力 ,ELISA法检测DC培养上清中IL 12的含量。结果　在细胞增殖方面 ,培养第 1天加入VEGF(2 5ng/ml)可显著促进细胞增殖 ,第 14天收获的总细胞数量较对照组增高 (1.5 1± 0 .2 3)倍 (P =0 .0 0 1) ,而培养第 9天加入VEGF则未出现明显的促细胞增殖效应 (P >0 .0 5 ) ;在细胞分化和功能方面 ,培养第 1天加入VEGF明显抑制DC的分化和功能 ,第 1天加VEGF组和对照组DC分化抗原的表达CD1a分别为(33.0 0± 2 .12 ) %和 (81.2 0± 6 .93) % ,CD83分别为 (42 .2 3± 1.15 ) %和 (87.98± 9.79) % ,CD80分别为 (42 .93± 1.32 ) %和 (94 .5 3± 0 .87) % ,HLA DR分别为 (37.93± 5 .30 ) %和 (74 .15± 3.74 ) % (P值均 <0 .0 0 1) ,同时CD14的表达较对照组明显升高 ;刺激同种异体T淋巴     

两步法从脐血CD34+细胞获得大量树突细胞的初步研究

目的　探索利用先扩增后诱导的“两步法”从脐血 (CB)CD34 细胞高效大量地获得树突细胞 (DC)。方法　免疫磁珠法从CB分选获得CD34 细胞 ,以干细胞因子 (SCF)、IL 3、Flt 3配体 (FL)、Tpo组合刺激 ,扩增 7d、10d和 14d(依次为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组 )后以GM CSF IL 4 TNF α诱导 8d或 5d获得DC ,通过相差显微镜、电镜观察形态 ,流式细胞仪检测表型 ,混合淋巴细胞培养、ELISA法检测培养液上清IL 12含量评价其功能。结果　CBCD34 细胞经SCF IL 3 FL Tpo刺激扩增 7d、10d和 14d后细胞总数分别扩增了 (5 3.39± 2 0 .5 9)倍、(30 7.17± 119.5 9)倍和 (1117.2 5± 335 .4 9)倍。经GM CSF IL 4 TNF α诱导 8d后所得CD1a 细胞是扩增前细胞数的 (2 1.4 0± 16 .70 )倍、(14 3.2 0± 6 0 .35 )倍和(15 0 .80± 4 2 .16 )倍 ,Ⅱ、Ⅲ组明显多于Ⅰ组 (P <0 .0 5 ) ,但Ⅱ、Ⅲ组间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。所得DC的形态、表型及刺激异基因T细胞增殖能力、IL 12分泌量 ,三组无显著性差异 (P >0 .0 5 )。当诱导时间缩短至 5d时 ,各组DC功能均显著下降 (P <0 .0 5 )。结论　CBCD34 细胞扩增 7～ 10d再诱导 8d可以高效大量获得具有正常功能的DC ,而扩增时间超过 10d并不能显著增加DC产量 ,诱导时间少于8d将降低所得DC     

白细胞介素2激活骨髓抗骨髓瘤活性的研究

目的　探讨重组白细胞介素2(rIL 2)激活的骨髓(ABM)抗骨髓瘤活性的免疫学机制。方法　应用rIL 2体外分别激活多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓及正常对照骨髓,同时设未激活骨髓(NBM)为对照。用MTT比色分析法测定正常对照组的ABM对U266细胞的杀伤活性,应用流式细胞仪检测培养72h后MM组骨髓瘤残余病变标志(CD45-CD38+CD138+细胞百分率)的变化,ELISA法检测MM组及正常对照组不同时间段ABM、NBM培养液中TNF α、IFN γ的水平,并进行比较和相关性分析。结果　正常对照组NBM 72h对U266细胞的杀伤率为( 43. 20±12. 39 )%, 24h杀伤率为(26. 53±5. 48)%,ABM 72h对U266细胞的杀伤率为( 69. 70±26. 57 )%, 24h杀伤率为( 34. 25±11. 93)%, 24h及72h的ABM细胞杀伤活性均较NBM增高,其中72hABM与NBM对U266细胞杀伤率的差异有统计学意义(P<0. 05);MM患者骨髓经rIL 2激活72h后CD45-CD38+CD138+细胞的百分率明显下降[激活前为(8. 46±3. 66)%,激活后为(4. 79±1. 56)%, P<0. 05];正常骨髓及MM患者骨髓经rIL 2激活后,随着培养时间的延长,培养液中TNF α、IFN γ的含量增加,无论24h或72h,两组ABM中TNF α、IFN γ的水平均较NBM明显增高(P<0. 05);正常对照组ABM 24h及72h培养液中TNF α、IFN γ的水平分别与本组同时相的细胞杀伤     

单用A23187快速诱导K562细胞分化成树突细胞的研究

目的探索一种快速、简便、廉价而高效获取树突细胞(DC)的方法。方法通过单用A23187、A23187+GMCSF或联合细胞因子(GMCSF、IL4及TNFα)将K562细胞诱导分化为DC(K562DC),倒置显微镜下观察细胞形态并摄相,流式细胞术检测K562DC表面分子表达情况。用MTT法检测K562DC刺激异基因淋巴细胞增殖及介导T细胞杀伤靶细胞的能力。结果上述3种细胞因子组合均能诱导K562细胞向成熟DC分化,均高表达CD1a、CD80、HLADR、CD83和CD86;含A23187的两组诱导72h获得DC数量分别为(69.5±17.2)%、(73.1±13.9)%,均高于细胞因子组的诱导率[(28.5±12.3)%],也高于细胞因子组诱导7d后的诱导率[(51.2±10.7)%](P值均<0.05);诱导7d后,含A23187的两组诱导的DC低表达CD1a,分别为(8.2±2.3)%和(10.3±5.1)%,而CD83表达分别高达(85.6±8.8)%和(82.4±9.1)%,而细胞因子组CD1a和CD83表达率分别为(17.2±1.6)%和(77.4±12.9)%;3组所获得的DC在对异基因淋巴细胞的刺激增殖能力及其致敏T细胞对靶细胞的杀伤作用差异无统计学意义(P值均>0.05)。结论单用A23187可快速(72h以内)诱导K562细胞向成熟DC转化,与联合细胞因子相比,该方法所获得的DC更趋成熟从而更适用于临床免疫治疗。单用A23187快速诱导白血病细胞生成DC是一种快速、简便、廉价而高效获取DC的方法。