体外扩增高纯度的人外周血来源的NK细胞的研究

本研究探讨从人外周血中分选及扩增高纯度NK细胞的优化技术。先用miniMACS及阴性免疫磁珠分选方法,从外周血单个核细胞(PBMNC)得到纯化的NK细胞,随后在干细胞培液基条件下,通过IL-2、IL-12和IL-15等细胞因子的不同组合将培养体系分为IL-2组、IL2+IL12组、IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组和对照组(不加任何细胞因子),分别培养15天,每3天半量换液并补充细胞因子;检测分选及扩增前后(CD3-CD56+)NK细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组在不同效靶比下的杀伤率。结果显示经:miniMACS阴性免疫磁珠分选后(CD3-CD56+)NK细胞含量由分选前的11.19±5.25%提高到94.23±3.50%。培养15天后除对照组(CD3-CD56+)NK细胞纯度略下降外,其余4组与扩增前无显著性差异(P>0.05)。在IL-2、IL2+IL12、IL2+IL15、IL2+IL15+IL12培养体系中,NK细胞扩增倍数分别为15.43±1.08,19.87±3.87,50.46±4.31和52.35±6.72,均显著高于对照组6.14±1.0(P<0.01),但IL2+IL15与IL2+IL15+IL12组间未见显著差异(P>0.05)。各组扩增的NK细胞对K562细胞的杀伤率均较扩增前增强,在不同效靶比下IL2+IL15、IL2+IL15+IL12组对K562细胞的杀伤率显著高于其他组,但两组间无显著性差异(P>0.05)。结论:经miniMACS免疫磁珠阴性分选得少量NK细胞后,应用IL2+IL15培养条件是获得高纯度NK细胞的简单有效方法。     

IL-2和IL-15刺激脐血NK细胞对K562/Jurkat细胞的杀伤活性研究

本研究旨在探讨脐血(cord blood,CB)NK细胞的杀伤功能及细胞因子IL-2和IL-15对NK细胞杀伤K562/Jurkat细胞活性的影响。采用autoMACS及CD3阴选后CD56阳选两步免疫磁珠分选法从脐血单个核细胞纯化NK细胞,分选后NK细胞用流式细胞仪测定纯度,通过IL-2及IL-2和IL-15两种细胞因子组合培养3天,用LDH释放法检测培养前后脐血NK细胞对白血病细胞株K562和Jurkat的细胞毒活性(效靶比10∶1),并记录不同细胞因子培养体系条件下NK细胞的生长状况。结果表明,CB-MNC中CD3-CD56+细胞含量为(14.88±9.2)%,分选后CD3-CD56+细胞含量为(92.39±0.8)%;培养3天后,IL-2组NK细胞形成集落数为148.60±13.0,IL-2复合IL-15组NK细胞形成集落数为831.80±23.0,两者比较,有显著性差异;以K562为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK的杀伤活性为(27.76±8.8)%,IL-2组杀伤活性为(61.9±9.1)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(87.62±3.7)%,差别有统计学意义;以Jurkat为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK细胞的杀伤活性为(29.32±2.5)%,IL-2组杀伤活性为(69.43±4.4)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(92.95±3.2)%,差别有统计学意义。结论:脐血新鲜纯化NK细胞对K562、Jurkat细胞有一定的杀伤作用,但自发细胞毒活性较低,IL-2/IL-15刺激后杀伤活性显著提高,IL-15复合IL-2对促进脐血NK细胞的生长和提高其细胞毒活性明显优于单用IL-2。     

不同透析膜对血清白介素-12、干扰素-γ和白介素-4水平影响的临床研究

目的　探讨不同透析膜对透析患者血清细胞因子水平的影响。方法用ELISA法检测 2 6例不同透析膜透析患者的透析前、后血清IL 1 2、IFN γ、IL 4的水平。结果铜仿膜透析后与透析前相比血清IL 1 2水平增高 ,INF γ水平降低 (P <0 .0 5 ) ;聚砜膜、血仿膜透析对血清IL 1 2和IFN γ无明显影响。 3种透析膜透析后对血清IL 4水平无明显影响 ,但各组相比以铜仿膜透析组血清IL 4水平最低 (P <0 .0 1 )。结论血清IL 1 2的变化可作为透析膜生物相容性的指标之一 ,铜仿膜透析可能损害患者的免疫功能     

联合使用干细胞因子、FLT3配基与白介素2,7,15体外扩增人脐血来源CIK/NK细胞

通过干细胞因子 (SCF)、FLT3配基 (FL)联合白介素 (IL) 2 ,7,15等的不同组合体系体外扩增人脐血来源的CIK NK细胞 (CB CIK NK) ,探讨不同培养方式对CB CIK NK细胞诱导、扩增产率的影响。按诱导扩增体系的不同分 3组 :A组 (SCF IL2 IL7 IL15 ) ,B组 (SCF FL IL2 IL7 IL15 )和C组 (IL2 IL7 IL15 ,对照组 ) ,培养 2 1天 ,检测CD3 CD5 6 CIK细胞、CD3- CD5 6 NK细胞比例和扩增倍数。结果表明 :经 2 1天培养 ,A ,B及C组CIK细胞比例分别为 (19.84± 2 .93) %、(2 6 .2 0± 4 .0 5 ) %及 (2 4 .0 3± 4 .99) % ;而NK细胞的比例A、B及C组比例分别为 (4 9.6 0± 1.4 0 ) %、(5 1.16± 6 .4 5 ) %及 (30 .85± 8.12 ) %。含SCF FL的B组扩增效率最高 ,其中CIK细胞的扩增倍数由对照组 (C组 )的 (5 75 81± 2 2 1.72 )倍增加至 (796 .0 9± 2 78.4 7)倍 (最高为 1313倍 ) ;NK细胞由对照组 (C组 )的 (30 .39± 14 .4 7)倍增加至 (6 5 .85± 30 .83)倍 (最高为 12 1.0 6倍 )。结论 :通过合适的细胞因子组合可以同时扩增CB来源的CIK NK细胞 ;联合诱导、扩增CB CIK NK细胞以采用含SCF FL IL2 IL7 IL15的培养体系为佳。     

细胞因子联合高效扩增高纯度人外周血来源NK细胞并观察其细胞功能的变化

目的 探索从人外周血中分选及扩增高纯度NK细胞的方法,并初步了解扩增后的NK细胞功能的变化.方法 采用免疫磁珠分选系统(miniMACS)阴性分选法,从外周血单个核细胞(PBMNC)中获得纯化的NK细胞,在干细胞培养基条件下,通过IL-2、IL-12和IL-15等细胞因子的不同组合,分别培养15 d,每3 d半量换液并补充细胞因子;检测分选及扩增前后NK细胞CD3-CD56+细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组NK细胞穿孔素、颗粒酶B mRNA的表达水平及IFN-γ的分泌水平.结果 经miniMACS阴性免疫磁珠分选后CD3-CD56+细胞含量由分选前的(11.2±5.2)%提高到(94.2±3.5)%.培养15 d后除对照组CD3-CD56+细胞纯度略下降外,其余组与扩增前无明显差异(P0.05).在IL-2、IL-2+IL-12、IL-2+IL-15、IL-2+IL-15+IL-12培养体系中,NK细胞扩增倍数分别为15.4±1.1,19.9±3.9,50.5±4.3和52.4±6.7,均显著高于对照组(6.1±1.0)(P<0.01),但IL-2+IL-15与IL-2+IL-15+IL-12组间比较,差异无统计学意义(P0.05).各组培养的NK细胞穿孔素、颗粒酶B基因的表达量均较扩增前明显增加(P<0.01),IL-2+IL-15组、IL-2+IL-12+IL-15组两种基因的表达量均显著高于其他组(P<0.01),但两组间比较差异无统计学意义(P0.05);各细胞因子组培养液中IFN-γ分泌水平均显著高于未加细胞因子的空白对照组(P<0.01),IFN-γ分泌水平IL-2+IL-12+IL-15组IL-2+IL-12组IL-2+IL-15组IL-2组(P<0.01).结论 经miniMACS免疫磁珠阴性分选法获得少量NK细胞后,应用IL-2+IL-15细胞因子联合培养是获得纯度高、细胞毒活性强、扩增效率高的NK细胞的简单有效方法.     

血清INF-γ、sIL-2R、IL-12在原发性肝癌中的表达及临床意义

目的探讨血清干扰素-γ(INF-γ)、可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)、白介素-12(IL-12)在原发性肝癌中的表达及临床意义。方法选择重庆市綦江区人民医院2017年4月至2018年10月收治的73例原发性肝癌患者作为原发性肝癌组,58例良性肝病患者作为良性肝病组及46例健康体检者作为健康对照组,比较各组血清INF-γ、sIL-2R、IL-12水平,并分析血清INF-γ、sIL-2R、IL-12水平对原发性肝癌预后的预测价值。结果原发性肝癌组血清INF-γ、IL-12水平低于良性肝病组及健康对照组,原发性肝癌组血清sIL-2R水平高于良性肝病组及健康对照组(P0.05)。原发性肝癌患者Ⅲ期组血清INF-γ、IL-12水平低于Ⅱ期组及Ⅰ期组,原发性肝癌患者Ⅲ期组sIL-2R水平高于Ⅱ期组及Ⅰ期组(P0.05)。原发性肝癌患者治疗后血清INF-γ、IL-12水平高于治疗前,sIL-2R水平低于治疗前(P0.05)。原发性肝癌存活组血清INF-γ、IL-12水平高于死亡组,sIL-2R水平低于死亡组(P0.05)。血清INF-γ预测原发性肝癌预后的受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积(AUC)为0.856,sIL-2R为0.880,IL-12为0.787,指标联合测定预测原发性肝癌预后的AUC为0.931。结论 INF-γ、sIL-2R、IL-12参与了原发性肝癌的发生发展,以上指标能够用于原发性肝癌的诊断,而且可作为预后评价的参考指标。     

IL-2和IL-15诱导扩增的脐带血NK细胞生物学特性研究

本研究探讨脐血CD3-CD56+NK细胞及其在IL-2、IL-15诱导扩增后的免疫表型、细胞毒活性等生物学特性的改变。分离脐血单个核细胞,在无血清培养条件下,分别加入IL-2或(和)IL-15,培养14 d,流式细胞术检测CD3-CD56+NK细胞亚群水平以及NK表面CD16、CD62L、NKG2D、NKG2A、NCR44、NCR46、颗粒酶B、穿孔蛋白的表达;用WST-1法检测NK细胞对K562细胞毒活性。结果表明,扩增14 d后IL-2、IL-15、IL-2/IL-15 3组NK细胞分别扩增了10.78±2.51、10.42±3.72、10.54±6.24倍,3组之间无显著差异;扩增后的NK细胞表达CD16的比例显著减低,IL-2和IL-15组之间差异显著;细胞因子扩增后CD62L表达无改变;IL-2有下调NKG2A、NCR46表达的作用,IL-15的作用则相反;两种细胞因子均有上调NKG2D、穿孔蛋白、NCR44表达的作用,且细胞因子之间也存在差异;IL-15有上调NK细胞颗粒酶B表达的作用;经细胞因子扩增的NK细胞毒活性显著增高,但细胞因子之间作用无显著差异。结论:在无血清培养条件下,IL-2和IL-15均能有效地扩增脐血中NK细胞。虽然2种细胞因子扩增后的CD3-CD56+NK细胞与功能相关的免疫表型呈现出不同的改变特征,但细胞毒活性均显著增加,且2种细胞因子之间作用无显著差别,协同作用不明显;NK细胞毒活性是各种活性分子共同作用的结果。     

尖锐湿疣患者外周血IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4因子水平检测及临床意义

目的探讨尖锐湿疣患者外周血白细胞介素-2(IL-2)、IL-12、γ-干扰素(IFN-γ)、IL-4因子水平的表达及临床意义。方法选取2017年8月至2018年8月该院收治的尖锐湿疣患者50例作为研究组,另选取同期在该院进行体检的健康者50例作为对照组。采用流式细胞仪对两组研究对象外周血IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4及CD3^+、CD4^+、CD8^+、CD4^+/CD8^+T细胞亚群水平进行检测。结果研究组IL-2、IL-12、IFN-γ、Th1/Th2水平均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);研究组IL-4水平与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);研究组CD3^+、CD4^+、CD4^+/CD8^+水平均高于对照组,CD8^+水平低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论尖锐湿疣患者外周血IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4因子水平存在明显异常。     

血液透析患者血浆PGE2含量与T细胞亚群和NK细胞活性的关系

目的 探讨血液透析患者外周血前列腺素E2(PGE2)含量与T细胞亚群和NK细胞活性的关系。方法 应用流式细胞仪和酶联免疫分析法检测透析、未透析和长期维持性透析(透析时间大于7年)患者外周血PGE2、T细胞表面CD3、及其亚群CD4及CD8抗原表达。结果 尿毒症未透析组(NHD组)的外周血NK细胞和T细胞的CD3^ 、CD4^ 、CD8^ 表达及CD4^ /CD8^ 比值均显著低于正常对照组(P＜0．05)；PGE2含量明显增高，并与CD4^ ／CD8^ 细胞比值和NK细胞活性间呈负相关。透析后，尿毒症患者PGE2水平降低，CD3^ 、CD4^ 和CD8^ 值及CD4/^ CD8^ 比值均显著上升(P＜0．05)，NK细胞活性接近于正常对照组。然而透析时间大于7年的尿毒症患者血浆PGE2水平又显著增高，外周血淋巴细胞数值、CD3^ 细胞浓度、CD4^ /CD8^ 细胞比值及NK细胞活性均显著低于正常组(P均＜0．05)。结论 PGE2异常增高与细胞免疫功能失衡有关，血液透析能够降低PGE2浓度，改善患者的免疫功能。但长期维持性透析患者免疫功能又呈现恶化状态。     

肝细胞癌NKG2D表达及对NK细胞细胞毒的影响

【目的】分析肝细胞癌NKG2D表达及对NK细胞细胞毒的影响。【方法】应用免疫荧光技术和流式细胞术 (FCM )分选 2 5例肝细胞癌 (HCC)、10例健康对照的外周血NK细胞 ,定量分析NKG2D蛋白表达。用MTT比色法检测抗NKG2DpAb加入前后NK细胞的细胞毒效应。【结果】HCC患者NK细胞的NKG2D蛋白表达量均低于正常对照 ,差异有显著性 (P <0 .0 1)。抗NKG2DpAb能显著抑制NK细胞对K5 6 2、HepG2细胞的细胞毒效应 ,使NK细胞对两种靶细胞的细胞毒效应分别下降了 6 .7和 4 .1倍。【结论】NK细胞NKG2D表达异常与肝细胞癌的发生发展可能相关。     

树突状细胞对自体自然杀伤细胞体外扩增及功能的影响

本研究探讨树突状细胞（DC）对自体自然杀伤（NK）细胞体外扩增和功能的影响及其机制。用干细胞培养液（SCGM）在37℃、5％CO2、饱和湿度培养条件下以rhIL-2体外扩增NK细胞10天后，将自体DC与NK细胞以5：1（5：1组）和1：1（1：1组）的比例混合继续培养。14、21天时计算5：1组、1：1组和对照组的NK细胞扩增倍数，流式细胞术测定细胞表面CD3、CD56／16的表达，MTT法检测NK细胞的功能，ELISA法检测各培养组上清液中TNF-α和IL-12p70的含量。结果表明：14天时5：1、1：1组和对照组的扩增倍数分别为29．25±4．01、21．23±2．91和16．26±1．58，3组间比较差别有统计学意义（P〈0．05）。同组不同时间比较，14天时扩增倍数最高（P〈0．05）。14天时3组CD3^-、CD56／16^＋表达率分别为（64.6±7.8）％、（50．6±8.7）％和（34．8±5．1）％，5：1组表达率最高（P〈0．05）。14天时3组对K562细胞的杀伤率分别为（87.4±6．8）％、（75.4±6．3）％和（63．7±3.8）％，5：1组杀伤活性明显高于其它2组（P〈0．05）。5：1组上清液中TNF—α和IL-12p70的含量均分别高于其它各组（P均〈0．05）。结论：DC与NK细胞混合培养，能以比例依赖的方式增加NK细胞的扩增倍数，增强NK细胞的功能。DC增加NK细胞的扩增倍数与DC分泌的IL-12有关，NK细胞功能增强与NK细胞分泌的TNF—α增高有关。     

IL-21单独或联合IL-15／IL-2对G-CSF动员人外周血单个核细胞体外增殖和抗肿瘤活性作用研究

本研究探讨IL-21单独或联合IL-15／IL-2对G—CSF动员的人外周血单个核细胞（G-PBMNC）体外增殖和抗瘤活性的影响，评价IL-21及相关细胞因子组合在肿瘤免疫治疗方面的可行性。应用IL-21单独或联合IL-15／IL-2体外培养G—PBMNC，用CCK-8法进行细胞增殖分析；以白血病细胞株K562为靶细胞。用CFSE／PI流式双染法检测其对肿瘤的杀伤作用；用流式细胞术分析免疫细胞表型。结果显示：培养72小时后单独IL-21因子组对靶细胞杀伤活性与IL-2结果相近；当效靶比为25：1时IL21＋IL15／IL21＋IL15＋IL2组与IL21＋IL2组相比杀伤能力有显著增强（P〈0．05）；效靶比50：1时，细胞因子联合应用组均显著高于细胞因子单独应用组（P〈0．05），以IL21＋IL15＋IL2诱导效果最佳。复苏冻存的G-PBMNC处理结果与新鲜的G—PBMNC结果基本-致。细胞因子组和对照组相比CD3、CD4和CD8抗原表达有所增加，以IL21＋IL15组的CD4、CD3^- 56^＋和CD3^＋56^＋抗原表达增加最为显著（P〈0．05）。结论：IL-21可增强G—PBMNC的体外杀伤活性，联合IL-15可更显著提高G—PBMNC的抗瘤活性。     

NK细胞活化受体及配体在急性白血病患者外周血中的表达和脱离

本研究旨在从NK细胞活化性受体NKG2D及其相应配体——MICA/B、ULBP-1、2、3的表达和血清中脱离情况来探讨急性白血病患者NK细胞免疫防御功能损伤的可能机制。选择30例初发未治疗的急性白血病患者作为观察对象,10例健康者作为对照,应用流式细胞术检测白血病细胞表面MICA/B,ULBP-1、2、3表达水平,用ELISA法检测血清可溶性MICA、MICB(sMICA,sMICB)及可溶性ULBP1-3(sULBP1-3)水平。结果表明,急性白血病患者NK细胞NKG2D的表达低于正常对照组;急性白血病患者白血病细胞表面不表达或弱表达MICA/B、ULBP1-3;急性白血病患者血清中游离的sMICA和sMICB水平均高于对照组,差异有统计学意义(p0.01),血清sULBP1-3水平与对照组无明显差异。结论:急性白血病细胞表面MICA和MICB的脱离及ULBP表达缺乏可能是急性白血病细胞发生免疫逃逸的机制之一。     

Ag85B/IL-2融合蛋白在体外对PBMC增殖及Th1型细胞因子分泌的影响

[目的]研究Ag85B/IL-2融合蛋白对人外周血单个核细胞（PBMC）增殖及Th1型细胞因子分泌的影响.[方法]MTT法测定不同浓度的Ag85B/IL-2融合蛋白在不同时相对人PBMC的增殖活性,ELISA法检测Ag85B/IL-2融合蛋白作用人PBMC不同时间后IL-12和IFN-γ的分泌水平,并与Ag85B和BCG作对比.[结果]以0.8 μg/ml Ag85B/IL-2融合蛋白刺激组的人PBMC增殖活性为最强,此组在各时段均显著高于空白对照组（P〈0.01,P〈0.05）;各浓度Ag85B/IL-2融合蛋白刺激48 h后的IL-12水平均显著高于空白对照组（P〈0.01,P〈0.05）,以0.8 μg/ml的浓度刺激PBMC 72 h时,IL-12的分泌达最高;0.8 μg/ml和1.6 μg/ml刺激组的IFN-γ浓度在各个时相点均显著高于空白对照组（P〈0.01,P〈0.05）.Ag85B/IL-2融合蛋白刺激PBMC 分泌IL-12和IFN-γ的作用,均显著强于Ag85B和BCG（P〈0.01）.[结论]Ag85B/IL-2融合蛋白具有促人PBMC增殖和Th1型细胞因子分泌的作用.     

IL-2/IL-15刺激后脐血NK细胞穿孔蛋白表达及其与细胞毒活性的关系

本研究旨在探讨脐血NK细胞的穿孔蛋白表达水平以及IL-2、IL-15作用下穿孔蛋白表达与NK细胞细胞毒活性的关系。采用CD3阴选后CD56阳选两步免疫磁珠分选法纯化脐血NK细胞,流式细胞术测定NK细胞纯度,通过IL-2、IL-2+IL-15两种细胞因子培养体系培养3天,流式细胞术测定培养前后穿孔蛋白表达水平;LDH释放法检测培养前后脐血NK细胞对白血病细胞株K562的细胞毒活性(效靶比10∶1)。结果表明,纯化后CD3-CD56+细胞含量为(92.39±0.8)%。,以K562为靶细胞,新鲜纯化CB-NK的杀伤活性为(27.76±8.8)%,IL-2组杀伤活性为(61.9±9.1)%,IL-2+IL-15组杀伤活性为(87.62±3.7)%,新鲜纯化CB-NK穿孔蛋白表达率为(67.21±6.14)%,IL-2组CB-NK细胞穿孔蛋白表达率(84.55±3.8)%,IL2-+IL-15组CB-NK细胞穿孔蛋白表达率(87.22±2.2)%。穿孔蛋白表达率与NK细胞毒活性呈正相关(r=88.6,p<0.05)。IL-2组穿孔蛋白表达率与新鲜组差别有统计学意义,IL-2组与IL-2+IL-15组穿孔蛋白表达率差别无统计学意义。结论:促进穿孔蛋白表达是IL-2提高脐血NK细胞细胞毒活性的途径之一。