血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞☆

背景:血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义.目的:克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建 pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性.方法:采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和 DNA 测序的方法对提取和重组 DNA 进行鉴定.pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定.结果与结论:构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段.提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性.     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

靶向血管内皮生长因子基因的微小RNA真核表达载体的构建

背景:有研究表明微小RNA及潜在靶基因在肝癌中起重要作用,但具体机制仍不清楚。目的:构建靶向血管内皮生长因子基因微小RNA真核表达载体,评估其转染人肝癌细胞株HepG2后血管内皮生长因子基因的干扰效果。方法:根据血管内皮生长因子序列设计合成4对微小RNA不同干扰片段,克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-微小RNA真核表达载体上,测序分析鉴定插入序列的完整性;并将其转染至HepG-2细胞株中。采用实时荧光定量聚合酶链式反应分析血管内皮生长因子微小RNA干扰效果,蛋白印迹技术测定重组体对血管内皮生长因子基因蛋白表达情况。结果与结论:构建的4组重组体插入片段的碱基序列完全正确,重组体能干扰肝癌细胞HepG2细胞血管内皮因子基因的表达,4组重组体基因的mRNA的表达水平和蛋白表达水平与阴性对照组相比明显降低(P<0.05),其中血管内皮生长因子微小RNA-3表达水平最低,抑制率87%。结果证实,实验成功构建血管内皮生长因子微小RNA表达载体,在体外能有效抑制HepG2细胞血管内皮生长因子基因表达。     

人可溶性血管内皮生长因子受体1基因克隆及真核表达载体的构建

背景;血管内皮生长因子在肿痛新生血管的形成中发挥着关键的作用,可溶性血管内皮生长因子受体1能竞争性地抑制血管内皮生长因子诱导新生血管形成的生物学功能.目的:克降人可溶性血管内皮生长因子受体基因1,尝试构建可溶性血管内皮牛长因子受体1基因的真核表达载体.设计、时间及地点:基因表达载体构建实验,于2006-1012007-11在中山大学附属第一医院外科实验室完成.材料:人脐静脉内皮细胞、pMD-18T载体及pcDNA3载体.方法:提取人脐静脉内皮细胞总RNA,使用反转录一聚合酶链反应的方法扩增获得到可溶性血管内皮生长因子受体1基因cDNA,并将其克隆至pMD-18T载体中,经酶切及测序证实.然后应用聚合酶链反应的方法从pMD-18T可溶性血管内皮生长因子受体1重组载体中克隆可溶性血管内皮生长因子受体1基因,再将其定向亚克降至真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1,提取质粒进行双酶切、聚合酶链反应及测序鉴定.主要观察指标:可溶性血管内皮生长因子受体1基因反转录一聚合酶链反应情况及pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1真核重组体的构建与鉴定结果.结果:构建的真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮牛长因子受体1经过双酶切及聚合酶链反应鉴定,证实其中含有目的可溶性血管内皮生长因子受体1基因;测序结果经比对分析,证实与预期设计的编码区cDNA一致.结论:应用反转录-聚合酶链反应方法成功从人脐静脉内皮细胞中克隆出可溶性血管内皮生长凼子受体1基因,成功构建出了可溶性血管内皮生长因子受体1基因真核表达载体.     

人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒的构建及体外表达

目的:构建人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒。方法:实验于2005-03/2005-10在华中科技大学同济医学院公共实验平台完成。①通过聚合酶链反应对pcDNA3.1-BMP2及pUC-CAGGS-VEGF165的目的基因片段亚克隆并引入新的酶切位点,将其分别定向连入真核双表达载体pIRES,构建同时表达两个目的基因的双顺反子,通过聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定鉴定重组质粒。②重组质粒经脂质体介导体外转染小鼠骨髓基质细胞,通过反转录-聚合酶链反应检测骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA的表达。结果:①pIRES-BMP2-VEGF165双基因表达质粒的构建和鉴定:将重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165分别作XhoI/MluI和XbaI/NotI双酶切,经10g/L琼脂糖凝胶电泳可见1.2kbp的人骨形成蛋白2条带和592bp的血管内皮生长因子165条带,酶切条带与聚合酶链反应产物电泳带处于相同位置。经聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定证实,目的基因插入片段方向正确,DNA序列无突变。②骨形成蛋白2、血管内皮生长因子165mRNA的表达:以转染pIRES空质粒为阴性对照,48h后提取转染细胞的RNA分别用P1,P2和P3,P4作为引物进行反转录-聚合酶链反应。结果表明转染pIRES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质细胞扩增出1.2kbp及592bp两条带。证实该重组质粒能在体外同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA。结论:成功构建了可同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165的双基因真核表达质粒,为进行联合基因治疗骨缺损的实验研究奠定了基础。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景:已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达.尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究.目的:创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒.设计、时间及地点:基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成.材料:人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所.方法:设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段.构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1-4)并行酶切鉴定分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率.主要观察指标:重组质粒酶切鉴定结果.转染效率.采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达.结果:成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒.重组质粒经酶切鉴定证实构建成功.质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%.短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%.结论:成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用.短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显.     

小干扰RNA靶向血管内皮生长因子基因抑制胆囊癌细胞的增殖体内外实验

背景:已有研究发现RNA干扰可通过抑制血管内皮生长因子基因表达抑制肿瘤细胞增殖,但目前关于应用RNA干扰胆囊癌血管内皮生长表达的研究国内外尚无相关报道.目的:构建并筛选靶向血管内皮生长因子的shRNA,观察RNA干扰血管内皮生长因子的效果及对胆囊癌细胞增殖的影响.方法:设计VEGF-shRNA片段,连接到pCYU6/GFPINeo-shRNA质粒载体上.shRNA转染胆囊癌细胞.建立裸鼠胆囊癌模型,随机分成空白组、阴性对照组、实验组(干扰pShRNA-VEGF2),每组6只.瘤内注射shRNA.荧光显微镜观察细胞生长状态,半定量反转录-聚合酶链反应法与实时荧光定量聚合酶链反应检测RNA干扰效果,观察胆囊癌裸鼠模型肿瘤体积变化. 结果与结论:RNA干扰血管内皮生长因子后,胆囊癌细胞细胞变圆,皱缩,部分细胞死亡脱落.ShRNA片段血管内皮生长因子2、血管内皮生长因子1均可抑制VEGF mRNA表达,抑制率可达86%,82%.裸鼠肿瘤模型中实验组肿瘤与对照组、阴性组相比明显变小,且生长缓慢(P<0.05),而对照组和阴性组在肿瘤大小及生长趋势上没有明显的差别.实验构建的hVEGF-shRNA质粒表达载体通过抑制血管内皮生长因子的表达,抑制胆囊癌细胞增殖,从而达到间接治疗肿瘤的目的.     

内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性

目的:应用内部核糖体进入位点构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体,研究外源性基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞ECV304中的转染表达,探讨内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性。方法:实验于2003-12/2004-12在南京鼓楼医院科研部完成。将Phcmvsp1a-enos中内皮型一氧化氮合酶基因和PcDNA-vegf中血管内皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体PcDNA-ires中,构建重组质粒PcDNA-enos-ires-vegf,经酶切,聚合酶链反应扩增和部分DNA测序分析证实后,转染人脐静脉内皮细胞,硝酸还原酶法检测转染后细胞中一氧化氮和一氧化氮合酶活性,免疫组化和荧光双标记及westernblotting检测转染后细胞蛋白水平的表达,Trizol提取总RNA,反转录-聚合酶链反应测定转染后细胞mRNA水平的表达。结果:成功构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体PcDNA-enos-ires-vegf,双基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞基因组中获得整合及表达。重组基因PcDNA-enos-ires-vegf组与对照组PcDNA-enos在一氧化氮含量和一氧化氮合成酶活性的表达差异无显著性意义。PcDNA-enos-ires-vegf转染细胞后转染效率为30%～40%。结论:双基因表达载体PcD     

人反义血管内皮生长因子基因载体构建及对肾细胞癌血管内皮生长因子表达的影响

目的:构建反义血管内皮生长因子基因表达载体,观察其对肾癌细胞血管内皮生长因子表达的影响.方法:实验于2006-07/2007-03在郑州大学第三附属医院实验中心完成.①实验材料:质粒pcDNA3.1(-),宿主菌DH5α,肾癌细胞株786-0.②实验过程:克隆人血管内皮生长因子基因,将反义血管内皮生长因子基因定向克隆于质粒pcDNA3.1(-)表达载体,酶切鉴定;转染人肾癌细胞,并分别命名为反义血管内皮生长因子组和空载体组,未转染细胞命名为对照组;G418筛选阳性克隆.③实验评估:反转录-聚合酶链反应方法检测血管内皮生长因子mRNA的表达,免疫组织化学法检测血管内皮生长因子基因的蛋白表达,流式细胞术检测细胞周期,四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长情况.结果:①成功构建反义血管内皮生长因子基因表达载体.②反义血管内皮生长因子组血管内皮生长因子mRNA的表达受到抑制,明显低于空载体组和对照组血管内皮生长因子mRNA的表达(P＜0.01),空载体组血管内皮生长因子mRNA的表达没有受到影响.③反义血管内皮生长因子组的血管内皮生长因子蛋白表达明显降低,明显低于空载体组和对照组(P＜0.01),空载体组和对照组血管内皮生长因子蛋白的表达差异无显著性.④反义血管内皮生长因子组细胞生长减慢,G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少,反义血管内皮生长因子组细胞生长明显减慢.结论:成功构建血管内皮生长因子的pcDNA3.1(-)反义基因表达载体,人反义血管内皮生长因子基因可明显降低肾癌细胞血管内皮生长因子基因在转录和翻译水平的表达,抑制肾癌细胞生长,为肾癌基因治疗提供一定的实验依据.     

携带人血管内皮生长因子165慢病毒表达载体的构建与表达

背景:已有研究证实血管内皮生长因子在正常肝脏肝部分切除后余肝的再生过程中发挥着重要的作用,但关于其对肝硬化肝脏是否也有相同作用国内外鲜有报道。目的:构建携带人血管内皮生长因子165基因的慢病毒载体,体外转染BLR3A大鼠肝细胞并观察该细胞中人血管内皮生长因子165基因的表达。方法:采用DNA重组技术将人血管内皮生长因子165基因克隆入pLenti6/V5-D-TOPO慢病毒表达载体中,筛选出阳性克隆与慢病毒包装系统ViraPowerTM Packaging Mix共转染293T细胞产生病毒颗粒,通过实时定量-聚合酶链反应法测定病毒滴度;携带人血管内皮生长因子165基因的慢病毒载体体外转染BLR3A大鼠肝细胞72h后,利用反转录-聚合酶链反应及Western blot法检测细胞中人VEGF165mRNA及蛋白的表达。结果与结论:成功构建了表达人VEGF165基因的慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO-VEGF165,测得病毒滴度为1.18×107VP/mL。重组慢病毒载体转染BLR3A大鼠肝细胞72h后,荧光蛋白表达率超过80%,反转录-聚合酶链反应及Western blot法测得转染组人血管内皮生长因子165mRNA及血管内皮生长因子165蛋白表达阳性。提示构建的携带人血管内皮生长因子165的慢病毒载体可有效转染BLR3A大鼠肝细胞,并促使该细胞表达人血管内皮生长因子165mRNA及蛋白。