急性肺栓塞大鼠肺血管内膜VEGF及其受体2的变化

目的:观察血管内皮生长因子及其受体2在急性肺栓塞大鼠肺血管内膜的变化.方法:采用免疫组化技术检测血管内皮生长因子(VEGF)及其受体2(receptor2,flk-1)在急性肺栓塞大鼠肺小血管内皮的表达情况.结果:VEGF及flk-1均与栓塞早期肺组织中的血管重构呈正相关(P＜0.05).结论:VEGF及flk-1参与了急性肺栓塞大鼠的血管重构过程并起着重要的作用.     

血管内皮生长因子对胚胎干细胞来源神经干细胞增殖的促进

目的:观察血管内皮生长因子对胚胎干细胞来源的神经干细胞增殖的促进作用,为临床治疗提供实验依据。方法:实验于2003-10/2005-05在北京大学医学部干细胞研究中心完成。小鼠胚胎干细胞在不含有白细胞抑制因子的条件下形成类胚体,经过7d选择性培养得到神经干细胞,利用免疫荧光的方法检测神经干细胞标志物nestin以及sox-2的表达情况;将神经干细胞与血管内皮生长因子共培养,通过氚标记的胸腺嘧啶核苷掺入的方法测定细胞的增殖速度;在外源性血管内皮生长因子存在的情况下,利用受体2中和抗体或者血管内皮生长因子受体2特异性抑制剂阻断血管内皮生长因子受体,观察外源性血管内皮生长因子对神经干细胞的增殖作用。结果:经鉴定胚胎干细胞来源的神经干细胞(95±3)%以上表达神经干细胞标志物nestin以及sox-2,该细胞在体外可以传代。与血管内皮生长因子共培养后,发现随着血管内皮生长因子浓度的升高神经干细胞增殖速度明显加快。通过中和抗体或者血管内皮生长因子受体2特异性抑制剂阻断血管内皮生长因子受体2可以阻断外源性血管内皮生长因子对神经干细胞的增殖作用。结论:实验中诱导小鼠胚胎干细胞得到了高纯度的神经干细胞,血管内皮生长因子能够通过血管内皮生长因子受体2促进神经干细胞增殖。     

血管内皮生长因子对佐剂性关节炎滑膜细胞基质金属蛋白酶3及基质金属蛋白酶9表达的影响

目的:观察血管内皮生长因子对佐剂性关节炎滑膜细胞质金属蛋白酶3及质金属蛋白酶9表达的影响,并探讨其意义。方法:实验于2006-02/12在桂林医学院实验中心完成。①实验材料:清洁级8周龄雄性Wistar大鼠6只,血管内皮生长因子为Peprotech EC LTD公司产品,基质金属蛋白酶3(扩增369bp)上游引物、下游引物,基质金属蛋白酶9(扩增405bp)上游引物、下游引物均购自晶美公司。②实验干预:先用弗氏完全佐剂造Wistar大鼠模型;造模20d后取Wistar大鼠右后足滑膜细胞进行原代培养。③实验分组:实验分为血管内皮生长因子组:取P2代细胞接种于6孔培养板,分别加入终浓度为5,25,50μg/L血管内皮生长因子;对照组:不加血管内皮生长因子。④实验评估:取病理切片观察滑膜细胞形态学改变;采用半定量反转录聚合酶链反应检测Wistar大鼠佐剂性关节炎滑膜细胞基质金属蛋白酶3及基质金属蛋白酶9的m-RNA表达。结果:①培养细胞的形态学观察:原代培养14d滑膜细胞从组织块边缘逸出,21d密集生长开始传代;传代细胞48h可明显分辨出树突样细胞、巨噬细胞样细胞和成纤维细胞样细胞;传至21代,细胞生长及特性稳定。②病理切片:滑膜组织有中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞浸润,滑膜细胞增生、排列紊乱,纤维素渗出,胶原纤维沉着,纤维素样坏死,呈滑膜炎表现。③基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9的mRNA表达:对照组基质金属蛋白酶3mRNA表达相对灰度值与血管内皮生长因子终浓度5,25,50μg/L组比较,差异有显著性意义(0.32±0.03,0.77±0.06,1.12±0.12,1.59±0.02,P<0.05);对照组基质金属蛋白酶9mRNA表达相对灰度值与血管内皮生长因子终浓度5,25,50μg/L组比较,差异有显著性意义(0.47±0.07,0.50±0.10,0.91±0.10,1.31±0.06,P<0.05);基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶9mRNA表达随血管内皮生长因子浓度的加大表达增加。结论:血管内皮生长因子以剂量递增的方式对体外培养的佐剂性关节炎滑膜细胞基质金属蛋白酶3及基质金属蛋白酶9的表达有促进作用。     

纳米微囊包裹血管内皮细胞生长因子对创伤组织中细胞因子表达的调控

背景:近年研究表明,生长因子作为一种分子信号调控细胞的增殖、分化、迁移与代谢,其表达与调控在慢性创面愈合中起着很重要的作用。目的:观察血管内皮生长因子对创伤组织血管内皮生长因子受体,碱性成纤维细胞生长因子和血小板源性生长因子mRNA表达的影响,分析其促进损伤组织修复的作用途径。设计:对照动物实验。单位:解放军第四军医大学西京医院整形科。材料:实验用新西兰白兔6只,兔龄48～60个月。纳米微囊包裹的重组质粒DNA真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisA-血管内皮生长因子165(VEGF165)由第四军医大学西京医院整形外科贾宁硕士惠赠。方法:实验于2004-10/2005-06在西京医院整形外科实验室完成。①以血管内皮生长因子165为目的基因,构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisA-VEGF165,利用纳米微囊包裹制成纳米微囊-血管内皮生长因子165复合体。兔经麻醉后,在其耳腹侧制成直径为6mm的3个圆形创面,暴露软骨。以明胶海棉薄片蘸取纳米微囊-血管内皮生长因子165复合体100μL覆于每只兔一侧耳创面,外层覆盖无菌密封薄膜,作为血管内皮生长因子组;对侧每一创面以明胶海棉薄片蘸取100μL纳米微囊-空载质粒覆于创面作为对照组;在环切部位近端的兔耳皮肤作为正常皮肤组。②利用反转录聚合酶链反应方法观察术后14d损伤组织血管内皮生长因子受体,碱性成纤维细胞生长因子和血小板源性生长因子mRNA的表达变化。③术后14d,以创面为中心,切取1cm×1cm正方形组织块(含兔耳全层),制成标本,苏木精-伊红染色,光镜下观察新生肉芽组织的生长情况。主要观察指标:创伤组织血管内皮生长因子受体、碱性成纤维细胞生长因子和血小板源性生长因子表达。结果:①苏木精-伊红染色显示,血管内皮生长因子组创面肉芽生长及上皮爬行速度明显快于对照组。②反转录聚合酶链反应显示,血管内皮生长因子组损伤组织内血管内皮生长因子受体,碱性成纤维细胞生长因子和血小板源性生长因子mRNA的表达水平明显高于对照组(P<0.05)及正常组(P<0.01)。结论:外源性血管内皮生长因子可以上调创伤组织中血管内皮生长因子受体,碱性成纤维细胞生长因子和血小板源性生长因子的表达,血管内皮生长因子可能作用于其受体,通过与其他细胞因子的协同作用来实现其对伤口愈合的促进作用。     

血管内皮生长因子及其受体在大鼠附睾内精子上的表达(英文)

背景:血管内皮生长因子及其受体在男性生殖领域中占有重要地位,但其在生殖系统中表达的意义和调节机制仍不十分清楚。目的:观察血管内皮生长因子及其受体类fms酪氨酸激酶在青春期大鼠附睾内精子上的表达定位情况。方法:取10只青春期雄性SD大鼠双侧附睾,分离得到浓度为(30～40)×109L-1的精子,涂片,免疫荧光法检测精子上血管内皮生长因子及其受体类fms酪氨酸激酶的表达定位情况。结果与结论:免疫荧光结果显示,血管内皮生长因子及其受体类fms酪氨酸激酶阳性蛋白均定位于大鼠附睾精子头部的顶体、尾部的颈段、中段和主段,尾部末段和精子核未见阳性染色。提示,血管内皮生长因子及其受体类fms酪氨酸激酶可能参与了精子的成熟过程,与精子的运动能力、获能和顶体反应有关。     

富含酸性成纤维细胞生长因子纤维蛋白凝胶预防失神经支配运动终板退行性变的免疫组织化学研究

背景:作者前期研究证实酸性成纤维细胞生长因子纤维蛋白凝胶植入大鼠失神经支配肌肉可以明显减轻运动终板退行性改变及肌萎缩.目的:采用免疫组织化学研究方法进一步探索酸性成纤维细胞生长因子纤维蛋白凝胶预防失神经支配运动终板退行性改变的作用.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-06/12在南方医科大学珠江医院完成.材料:选取清洁级SD大鼠24只,随机分为3组:酸性成纤维细胞生长因子+纤维蛋白凝胶组、单纯植入纤维蛋白凝胶组、空白对照组,每组8只.方法:各组大鼠全麻状态下切断右侧腓总神经(距神经入肌点约1 cm处).酸性成纤维细胞生长因子+纤维蛋白凝胶组缝合神经外膜,失神经支配胫前肌神经区周围肌间隙植入酸性成纤维细胞生长因子纤维蛋白凝胶;单纯植入纤维蛋白凝胶组修复神经肌肉植入纤维蛋白凝胶:空向对照组修复神经肌肉不给药.主要观察指标:6周后分离切取腓总神经胫前肌分支神经肌肉接头及其附近肌肉,采用SP法免疫组织化学进行酸性成纤维细胞生长因子受体染色,观察酸性成纤维细胞生长因子受体表达部位:酸性成纤维细胞生长因子受体阳性毛细血管计数,采用图像分析测定毛细血管壁酸性成纤维细胞生长因子受体灰度值.结果:①光镜下见酸性成纤维细胞生长因子受体主要定位存毛细血管壁:酸件成纤维细胞生长因子+纤维蛋白凝胶组毛细血管酸性成纤维细胞生长因子受体表达数量多,血管壁内酸性成纤维细胞生长因子受体表达广泛、密度高,毛细血管密集;单纯植入纤维蛋白凝胶组及空白对照组毛细血管酸性成纤维细胞生长因子受体表达数量少,血管壁内酸性成纤维细胞生长因子受体表达范围少、密度低,毛细血管稀少:酸性成纤维细胞生长因子+纤维蛋白凝胶组毛细血管酸性成纤维细胞生长因子受体表达阳性率高于单纯植入纤维蛋白凝胶组及空白对照组.③酸性成纤维细胞生长因子+纤维蛋白凝胶组酸性成纤维细胞生长因子受体表达量高于单纯植入纤维蛋白凝胶组及空白对照组.结论:酸性成纤维细胞生长因子作用于毛细血管,通过改善运动终板附近微循环而保护运动终板.     

大鼠脊髓缺血再灌注损伤后转化生长因子β1的表达

目的:观察具有多种生物学功能的多肽生长因子转化生长因子β1及其mRNA在脊髓缺血再灌注损伤后的表达变化。方法:实验于2003-11/2004-04在兰州大学第二医院骨科研究所进行。健康Wistar大鼠42只,随机分成6组,正常组,伤后3,6,12,24和48h组,每组7只。正常组不做模型。其他5组大鼠建立脊髓缺血再灌注损伤模型,夹闭腹主动脉40min后放开。应用改良Tarlov评分对模型进行评估(共5分,0分为完全瘫痪;5分为正常)。观察正常大鼠脊髓及缺血再灌注损伤后各时间点大鼠脊髓转化生长因子β1及其mRNA的分布和含量变化(灰度值变化与正常组比较,其灰度值越低表示阳性细胞越多),检测方法采用免疫组织化学技术和原位杂交技术。结果:42只大鼠均进入结果分析。①正常大鼠脊髓不表达转化生长因子β1。②大鼠脊髓神经功能评分:于伤后3h显著下降,以后逐渐恢复。③大鼠脊髓转化生长因子β1蛋白表达结果:免疫组织化学染色显示,损伤后3h蛋白的表达开始增加(149.26±12.97),损伤后24h表达强度达高峰(104.95±9.40)。④大鼠脊髓转化生长因子β1mRNA表达结果:原位杂交图像分析显示,损伤24h表达阳性细胞达高峰,其灰度值明显低于正常组(79.08±10.42,140.40±10.85,P<0.01)。⑤大鼠脊髓转化生长因子β1结果:光镜观察脊髓缺血再灌注损伤后出现大量的转化生长因子β1阳性细胞;主要是小胶质细胞、星形胶质细胞、巨噬细胞和神经元。结论:大鼠脊髓缺血再灌注损伤后转化生长因子β1表达显著增加,脊髓的神经功能随时间延长逐渐恢复,说明大鼠脊髓损伤的同时,也启动了其内源性保护机制,转化生长因子β1的高表达可能与其保护作用有关。     

重组内皮抑制素抑制大鼠角膜移植术后的新生血管

目的:内皮抑制素是一种内源性血管内皮细胞的强效抑制剂,实验拟验证局部应用重组内皮抑制素滴眼液对大鼠角膜移植术后新生血管的抑制作用.方法:实验于2005-09/2006-03在重庆医科大学附属第一医院实验动物中心完成.①选用清洁级成年雌性SD大鼠(受体)60只,Wistar大鼠(供体)30只,建立大鼠同种异体穿透性角膜移植模型,供体提供双眼角膜,受体均选择右眼手术.移植术后按随机数字表法分成内皮抑制素组和对照组,分别用50mg/L的内皮抑制素眼液及赋形剂滴眼.②于术后1周、2周、3周、1个月及2个月5个时间点,麻醉后每组随机处死6只大鼠.观察角膜新生血管生长状况;比较各组角膜植片透明度、水肿、新生血管程度及移植排斥反应指数;检测角膜植片上内皮抑制素及血管内皮生长因子的表达情况.结果:60只受体大鼠全部进入结果分析.①内皮抑制素组大鼠角膜新生血管面积显著低于对照组(P＜0.05～0.01).②内皮抑制素组大鼠的排斥反应指数在术后1周、2周、3周、1个月及2个月均低于对照组(P＜0.05～0.01).③与对照组相比,内皮抑制素组角膜植片组织中内皮抑制素的表达明显增强(P＜0.05～0.01),血管内皮生长因子的表达明显降低(P＜0.05～0.01).结论:内皮抑制素滴眼液可以有效抑制大鼠角膜移植术后角膜新生血管的形成,下调角膜植片中血管内皮生长因子的表达,从而降低角膜移植术后免疫排斥反应的发生,为临床防治角膜移植术后新生血管提供了新的思路.     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子表达的影响

背景:骨髓间充质干细胞移植可以促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,但目前尚不能清楚阐述骨髓间充质干细胞移植促进神经功能恢复的相关机制.目的:观察骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-09/2007-04在中国医科大学神经生物学实验室完成.材料:健康Wistar大鼠75只,3只用于骨髓间充质干细胞的分离培养,72只随机分为3组:假手术组(n=18)、DMEM组(n=27)、骨髓间充质干细胞组(n=27).方法:以贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.参照Nystrom's压迫方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型.假手术组仅咬除T8-10棘突和椎板,不损伤脊髓.模型制作后DMEM组、骨髓间充质干细胞组分别进行DMEM与骨髓间充质干细胞损伤区周围局部4点注射.主要观察指标:应用RT-PCR法和应用免疫组织化学技术检测损伤脊髓组织内血管内皮生长因子的表达和分布变化.结果:假手术组脊髓组织中仅见微量血管内皮生长因子表达.骨髓间充质干细胞组在细胞移植后l,3,5d,血管内皮生长因子mRNA表达趋势与DMEM组相同,但表达水平均明显高于相应时间点的DMEM组(P<0.05),移植后7,14d血管内皮生长因子表达仍明显高于DMEM组(P<0.01).结论:骨髓间充质干细胞移植增加了脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白的表达,并延长其表达时间.     

血管内皮生长因子对胚胎干细胞来源神经干细胞增殖的促进

目的：观察血管内皮生长因子对胚胎干细胞来源的神经干细胞增殖的促进作用，为临床治疗提供实验依据。方法：实验于2003-10／2005-05在北京大学医学部干细胞研究中心完成。小鼠胚胎干细胞在不含有白细胞抑制因子的条件下形成类胚体，经过7d选择性培养得到神经干细胞，利用免疫荧光的方法检测神经干细胞标志物nestin以及sox-2的表达情况；将神经干细胞与血管内皮生长因子共培养，通过氚标记的胸腺嘧啶核苷掺入的方法测定细胞的增殖速度；在外源性血管内皮生长因子存在的情况下．利用受体2中和抗体或者血管内皮生长因子受体2特异性抑制剂阻断血管内皮生长因子受体，观察外源性血管内皮生长因子对神经干细胞的增殖作用。结果：经鉴定胚胎干细胞来源的神经干细胞（95&;#177;3）％以上表达神经干细胞标志物nestin以及sox-2，该细胞在体外可以传代。与血管内皮生长因子共培养后，发现随着血管内皮生长因子浓度的升高神经干细胞增殖速度明显加快。通过中和抗体或者血管内皮生长因子受体2特异性抑制剂阻断血管内皮生长因子受体2可以阻断外源性血管内皮生长因子对神经干细胞的增殖作用。结论：实验中诱导小鼠胚胎干细胞得到了高纯度的神经干细胞，血管内皮生长因子能够通过血管内皮生长因子受体2促进神经干细胞增殖。     

神经生长因子干预大鼠脊髓损伤模型白质轴突计数和运动功能恢复的变化

背景:有实验已证实多种神经营养因子具有促进损伤神经元存活、分化和轴突再生的作用,使损伤后的脊髓组织结构完整性能得到最大的保存。目的:观察神经生长因子对大鼠脊髓损伤后神经再生和运动功能的影响。设计:随机对照观察。单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科。材料:选用30只成年健康雄性Wistar大鼠(同济医学院动物实验中心)。方法:实验于2004-01/2005-01在华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科完成。采用随机抽签法将大鼠分为治疗组和对照组,每组15只。①造模:应用改良Allen’s打击法致伤脊髓。②干预措施:造模后,治疗组大鼠给予蛛网膜下腔注射含1μg神经生长因子的生理盐水0.05mL,1次/d,共3周;对照组大鼠注射等体积的生理盐水,1次/d,共3W。③斜板试验:在造模前和治疗后3d和1,2,3周分别应用改良Rivlin法(斜板试验)测定大鼠运动功能值。④形态学观察:造模后2天和3周,分别取7只治疗组大鼠和8只对照组大鼠进行NF200免疫组织化学检测与轴突计数。主要观察指标:大鼠造模前、治疗后3d及1,2,3周斜板试验结果以及大鼠造模后2d和3周白质区轴突计数。结果:①治疗组大鼠脊髓损伤后斜板试验结果在术后1,2,3周时分别为(45.2±3.2),(51.2±3.8),(53.4±4.6)°,明显高于对照组(37.2±2.8),(42.6±3.5),(44.5±5.6)°,差异有显著性(P<0.05)。②治疗后3周,对照组白质内可见少量、散在不均匀的NF200着色点。治疗组白质内可见大量均匀的NF200着色点。治疗组大鼠脊髓损伤后3W白质内轴突计数明显高于对照组(363.6±34.2,187.5±32.1,P<0.05)。结论:神经生长因子对脊髓损伤后的神经再生有一定的促进作用,并有助于功能恢复。     

大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达及意义继发性脊髓损伤适宜干预时间窗的选择

背景半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族被认为是细胞凋亡的执行因子,脊髓损伤后可发生神经细胞凋亡.目的观察大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达变化,探讨其与神经细胞凋亡发生的关系,为判定减轻继发性脊髓损伤的适宜干预时间窗提供依据.设计自身对照、相互对照动物实验.单位华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科、骨科.材料实验于2001-09/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成.54只SD大鼠,雌雄不限,体质量220～250g,由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供.方法①动物模型建立及分组将大鼠分为对照组和损伤组,对照组仅做Ts,T9椎板切除术,损伤组于4、8 h和1,2,3,7,14和21 d取材共9组,每组6只.以30 g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉后,按Nystrom法暴露T8,T9节段胸髓,将50 g重物通过2.2 mm×5.0 mm弧型光滑金属垫片压迫该段脊髓后正中部5 min,损伤后每天1000,1600和2200 3次人工膀胱排尿,直至建立反射性膀胱排空.②取材及切片准备在脊髓损伤后各时间点完整取出脊髓全长,将每组4只损伤段脊髓组织块,长约8 mm,石蜡包埋,连续切片,分别行苏木素伊红染色、免疫组化及原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick endlabeling,TUNEL)标记;每组2只在冰上处死,将损伤脊髓中心组织置入液氮罐中保存备用.③检测指标以免疫组化法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达,以逆转录-聚合酶链反应半定量测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 mRNA的表达变化,以TUNEL法检测神经细胞的凋亡水平,并以直线相关分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达和神经细胞凋亡的相关性.主要观察指标①光镜下各组大鼠脊髓损伤观察.②免疫组化结果.③各组大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达变化.④各组大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡情况及与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达的相关性.结果纳入结果分析的各组动物数均为6只.①光镜下各组大鼠脊髓损伤观察结果损伤段1 h有广泛出血;4～8 h脊髓结构开始破坏,大量的神经元死亡;24 h脊髓破坏严重;7～21 d损伤范围确定,脊髓内有空洞形成.②免疫组化检测的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果正常大鼠脊髓神经细胞中很少有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达(2.1±0.5);脊髓损伤后8 h,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达阳性的神经细胞明显增加(89.2±10.5),3 d达到高峰(189.6±12.7);半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的阳性细胞与凋亡细胞出现的时限相似,呈正相关(r=0.941).③逆转录-聚合酶链反应检测的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 mRNA 4 h开始增高(0.442±0.024),48 h达到高峰(0.634±0.028),7 d后恢复正常(0.351±0.013),早于凋亡出现的时期,与神经细胞凋亡水平呈正相关(~0.622).4④rUNEL标记及计数的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果对照组及4 h组仅见偶染细胞,8 h后开始出现阳性细胞,主要位于灰质中;此后阳性细胞逐渐增多,3 d达到高峰,7 d灰质中凋亡染色的阳性细胞逐渐减少,主要在周围白质中,14和21 d可见少量的阳性细胞.结论在正常的脊髓组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3是以活性很低的酶原形式存在;大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达增强,8 h开始大量表达,24～48 h达到高峰,与TUNEL所检测的阳性凋亡细胞在时间上相重叠,从半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞先后出现的区域上看,与脊髓损伤阳性凋亡细胞一致,可见半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3参与了脊髓损伤细胞凋亡的调节.从本实验可以看出,从脊髓损伤后到半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化这段时间是脊髓损伤干预细胞凋亡、减轻继发性脊髓损伤治疗时间窗,应用基因干预或特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂宜在48 h内应用.     

胚胎源脊髓组织诱导骨髓间质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:研究发现骨髓间质干细胞在体外专门的诱导体系中能产生类似神经元烯醇化酶克隆球样神经球结构,故骨髓间质干细胞成为中枢神经损伤修复种子细胞的热门候选。目的:观察体外分化体系诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的情况。设计:观察性实验。单位:深圳市第二人民医院脊柱外科。材料:选用孕16d及2月龄的SD大鼠,由华中科大同济医学院动物中心提供。神经元烯醇化酶单抗、胶质纤维酸性蛋白多抗、神经中丝蛋白单抗均购自武汉博士德公司。方法:实验于2006-09在华中科技大学同济医学院基础医学部免疫室开放实验室及本院中心实验室完成。取大鼠下肢骨,离心分离鼠骨髓间质干细胞。提取孕16d大鼠胚胎脊髓组织匀浆,制备诱导液,诱导骨髓间质干细胞的分化。另取胚胎肌组织同法制备肌组织匀浆作对照。主要观察指标:对诱导后骨髓间质干细胞进行形态学观察及用抗神经元烯醇化酶、NF200、抗胶质纤维酸性蛋白分别标记神经元,星形胶质细胞。反应阳性诱导细胞免疫组化染色后光镜下随机数取10个非重叠视野进行观察,计算神经元烯醇化酶和神经中丝蛋白阳性细胞占总细胞数的比例。结果:①大鼠骨髓间质干细胞在诱导后细胞形态变化:诱导早期光镜下即见部分细胞胞体回缩,突起变长,变细;逐渐出现分化细胞突起生长,并相互交织,类似神经细胞,有的分支类似树突状分枝,对照组细胞形态变化不大。②诱导1周后,骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化相关抗原表达情况:脊髓匀浆组多数细胞表现为神经元烯醇化酶和神经中丝蛋白阳性;少数细胞表达胶质纤维酸性蛋白,对照组无神经细胞抗体阳性染色出现。而对照组未见神经细胞抗原反应阳性。免疫组化发现分化细胞神经元烯醇化酶、神经中丝蛋白表达阳性率分别为(68±1.7)%,(76.2±2.9)%。结论:胚胎脊髓组织匀浆可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

体外骨髓基质干细胞中腺病毒介导的胶质细胞源性神经营养因子基因的表达及其生物学活性

背景骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是外源性目的基因的良好靶细胞,在脊髓损伤的修复中具有良好的应用前景.目的观察重组腺病毒介导的胶质细胞源性神经营养因子(glial cellline-derived neurotrophic factor,GDNF)基因在体外培养的骨髓基质干细胞中的表达,并探讨其生物学活性.设计以细胞为研究对象,对照观察性研究.单位一所大学医院骨科实验室.材料实验于2004-03/06在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成.SD大鼠24只,雌雄不限,体质量(180±20)g.干预用重组腺病毒载体Adv-GDNF感染体外培养的BMSCs,并与脊髓背根神经节共培养.免疫荧光化学的方法检测BMSCs中的GDNF的表达,提取细胞总RNA进行RT-PCR扩增GDNF基因,应用ELISA方法检测其培养上清中的GDNF含量,并通过与脊髓背根神经节共培养观测GDNF的活性.主要观察指标主要结局①RT-PCR.②免疫荧光结果.③GDNF的体外活性.次要结局①BMSCs的培养与鉴定.②ELISA检测蛋白表达与时间的关系.结果免疫荧光显示Adv-GDNF感染BMSCs 48 h后即有GDNF的表达,体外培养的BMSCs经Adv-GDNF转染后有GDNF的转录,其培养上清应用ELISA方法分析,在感染24 h后即有GDNF的表达,并可持续5～7 d的高峰.Adv-GDNF感染的BMSCs的培养液上清可以促进脊髓背根神经节大量轴突的生长.结论Adv-GDNF基因可以在BMSCs中稳定、高效表达,其表达的GDNF具有促进轴突生长的活性,为GDNF基因治疗脊髓损伤的研究奠定了基础.     

重组人红细胞生成素对大鼠脊髓损伤后神经细胞及其因子凋亡的影响

背景在脊髓损伤中,除了创伤造成的直接损伤外,脊髓局部还将发生一系列的继发性病理改变.有研究显示重组人红细胞生成素能抑制细胞凋亡和炎症反应,具有神经保护作用.目的通过观察大鼠脊髓损伤段神经细胞凋亡及相关因子的表达,探讨重组人红细胞生成素对脊髓损伤的保护作用.设计随机对照实验.单位华中科技大学同济医学院附属协和医院骨外科实验室和同济医学院病理科.对象实验于2003-09/2004-05在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨外科实验室和同济医学院病理科进行.雌性成年SD大鼠30只,随机分成4组,①空白组6只,只暴露脊髓,不损伤.②损伤组8只,脊髓损伤,不用药物.③治疗A组8只,脊髓损伤,仅用重组人红细胞生成素.④治疗B组8只,脊髓损伤,联合应用重组入红细胞生成素和β-七叶皂甙钠.方法①动物模型制作24只大鼠应用改良的Allen方法致脊髓中度损伤.②给药治疗A组于术后1,3,5,8,11d应用重组人红细胞生成素300 U/(kg·d).治疗B组应用重组人红细胞生成素剂量时间同治疗A组,β-七叶皂甙钠0.1 mg/kg,1次/d,连用11d.空白组及损伤组尾静脉推注等容量生理盐水.③神经功能判断在造模后1和12 d分别由同一个实验者进行功能评分记录.行为观察参照改良的Gale神经功能行为分析法评估,0分为严重障碍,6分为正常.斜板试验观察大鼠抓握能力决定斜板角度的大小,反映神经功能恢复情况.④组织学检查大鼠术后12 d处死.取损伤段脊髓标本切片做苏木精-伊红染色.⑤神经细胞凋亡因子bcl-2,bax,fas检测取标本做免疫组织化学染色,计数显微镜高倍视野内染色呈棕色的阳性细胞,计算阳性率.⑥凋亡神经细胞检测采用原位末端标记法计算凋亡指数(凋亡细胞核数/总细胞核数).各指标检测结果进行组内和组间比较.主要观察指标①神经功能行为学评分及斜板实验结果.②损伤段脊髓组织学观察结果.③神经细胞凋亡因子检测结果.④凋亡神经细胞检测结果.结果①神经功能行为学评分及斜板实验结果1和12 d空白组无显著差异.损伤组12 d斜板角度显著大于1 d时(P＜0.05).治疗A和B组12 d行为评分及斜板角度值均显著大于1 d时(P＜0.05),且显著大于损伤组P＜0.05).②损伤段脊髓组织学观察结果损伤组损伤段变细,脊髓内有大部分坏死和大量胶质细胞增生;治疗A,B组大多数神经组织正常,治疗B组组织结构优于A组.③神经细胞凋亡因子检测结果损伤组bax,fas凋亡阳性细胞明显多于治疗A,B组[损伤组(25.75±3.37)%和(41.37±2.83)%,治疗A组(19.87±3.56)和(26.00±3.29)%,治疗B组(12.00±2.97)和(17.50±2.20)%,P＜0.05];bcl-2显著低于治疗A,B组[(9.75±1.83)%,(14.63±2.83)%,(21.63±5.34)%,P＜0.05].④凋亡神经细胞检测结果损伤组细胞凋亡指数明显高于治疗A,B组(50.75±5.39,34.75±3.01,24.00±3.46,P＜0.05).结论细胞凋亡是脊髓损伤后神经元死亡的一种重要方式.重组人红细胞生成素能抑制脊髓神经细胞凋亡,对损伤脊髓的神经功能具有保护作用.     

神经营养素3基因转染神经干细胞及其表达

背景:应用包括神经营养素3的神经营养因子促进周围神经再生是当今周围神经再生研究的热点之一,但是临床应用上缺乏安全、有效的给药途径.基因转染技术为神经营养因子的临床应用提供了新的思路和途径.目的:用神经营养素3基因修饰神经干细胞,并观察在转染后的神经干细胞内的表达情况.设计:完全随机试验.单位:广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科和华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科.材料:实验选用健康SD大鼠3只,鼠龄4个月,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院动物房提供.用于转染神经干细胞的重组腺病毒表达载体由华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室构建,浓度为0.15 g/L.方法:实验于2002-12/2004-03在华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成.采用阳离子脂质体介入法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的组组质粒pAd-神经营养素3转染原代培养的神经干细胞,转染72 h后采用荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白在神经干细胞上的表达,测定转染率.采用免疫细胞化学染色法和反转录-聚合酶链反应检测转染72 h,1,5周后神经营养素3基因在神经干细胞中的表达和转录情况.主要观察指标:神经营养素3基因在转染后的神经干细胞内的表达情况.结果:①重组质粒pAd-神经营养素3转染神经干细胞:转染72h绿色荧光蛋白在部分神经干细胞上有表达,转染率为40%.5周后仍可见绿色荧光蛋白的表达.②神经营养素3基因在神经干细胞中的转录与表达:转染72 h,1,5周后神经干细胞中均有神经营养素3 mRNA的转录,转染5周后仍有神经营养素3 mRNA的表达.结论:神经营养素3基因以阳离子脂质体为载体,通过腺病毒的介导,可有效的转染培养的神经干细胞并长期表达.     

二甲胺四环素对大鼠脊髓损伤后Bcl-2及Bax和Bcl-xl表达的影响

背景:中枢神经系统损伤后,神经细胞的凋亡在继发性损伤中发挥重要作用。近年来有研究表明二甲胺四环素抑制凋亡对脑组织缺血有明显的神经保护功能。目的:探讨二甲胺四环素对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡和相关因子表达的影响及对损伤脊髓神经功能的保护作用。设计:随机对照动物实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院。材料:实验于2003-11/2004-12在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。成年雄性SD大鼠36只,随机分成4组:①空白组6只。②损伤组10只。③二甲胺四环素治疗组10只。④甲基强的松龙治疗组10只。方法:建立脊髓损伤模型,空白组只暴露脊髓,不损伤;损伤组损伤脊髓,不治疗;二甲胺四环素治疗组大鼠伤后1h给予腹腔内注射二甲胺四环素(50mg/kg),24h后再次给予50mg/kg剂量注射,然后再给予5d的25mg/kg的剂量治疗。甲基强的松龙治疗组大鼠伤后1h予腹腔内注射甲基强的松龙(100mg/kg)。空白组和损伤组予生理盐水注射,给药方法同二甲胺四环素治疗组。主要观察指标:①各组大鼠神经功能评估结果。②免疫组化法检测损伤脊髓神经细胞凋亡因子(Bcl-2,Bcl-xl,Bax)的表达。③各组大鼠脊髓组织细胞凋亡指数。结果:36只大鼠均进入结果分析。①二甲胺四环素治疗组的神经功能较损伤组提高(P<0.05),与甲基强的松龙组差异无显著性意义(P>0.05)。②二甲胺四环素治疗组Bcl-2阳性表达细胞多于损伤组,差异有显著性(62.53±7.76)%,(35.14±3.70)%,P<0.05,Bcl-xl,Bax表达与损伤组差异无显著性(P>0.05)。③损伤组的凋亡阳性细胞多于二甲胺四环素治疗组和甲基强的松龙治疗组(44.63±5.90)%,(32.71±5.26)%,(34.31±6.84)%,P<0.05。结论:二甲胺四环素能上调Bcl-2的表达,改变Bcl-2/Bax的比值,从而抑制脊髓神经细胞凋亡,对损伤脊髓的神经功能有保护作用。     

工频电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1 mRNA表达的刺激

背景:研究证实电磁场刺激能够促进多种骨生长因子的合成与分泌,而某些生长因子具有诱导骨髓间充质干细胞定向分化成骨的作用。目的:分析工频电磁场对体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1mRNA表达的影响。设计:单一样本、区组设计,观察对比动物实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科。材料:实验于2005-02/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科实验室完成。①选取清洁级昆明种小鼠20只,作为实验用骨髓间充质干细胞的来源。②电磁场发生器由武汉市海军工程大学研制,能生成场强为0～100mT的连续可调的50Hz正弦波电磁场。③引物均由北京赛百胜生物工程公司合成。方法:①小鼠以颈椎脱臼法处死,取双侧股骨和胫骨,体外分离培养骨髓间充质干细胞,取第2代细胞用于实验。②不同强度电磁场刺激实验:设立阴性对照组、阳性对照组、电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组,每组均取5瓶第2代细胞。阴性对照组、阳性对照组均不给予电磁场刺激,但阳性对照组于传代时加入含成骨性诱导剂(含10-8mol/L地塞米松,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,50mg/LVitaminC)的培养基;电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组在细胞贴壁后分别于0.4,0.8,1.6mT场强中进行电磁场刺激,每天均连续刺激1h,5d后进行指标检测。③相同场强不同作用时间电磁场刺激实验:设立阴性对照组、电磁场1.6mT刺激15,30,60min组,每组均取5瓶第2代细胞。阴性对照组不进行电磁场刺激;电磁场1.6mT刺激15,30,60min组在1.6mT场强条件下每天分别给予15,30,60min的连续电磁场刺激,5d后进行指标检测。④RT-PCR技术检测各组细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达。主要观察指标:①不同强度电磁场刺激对小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA表达的影响。②相同场强不同作用时间电磁场刺激小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA表达的影响。结果:①电磁场刺激5d后,与阴性对照组比较,阳性对照组及电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1mRNA的表达均明显增强(P均<0.01);且电磁场1.6mT刺激组骨形态发生蛋白2mRNA的表达达到最大值(57.74±0.23)%,电磁场0.4mT刺激组转化生长因子β1mRNA的表达达到最大值(126.20±0.21)%。②电磁场刺激5d后,与阴性对照组比较,电磁场1.6mT刺激15,30,60min组骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达均明显增强(P均<0.01);且电磁场1.6mT刺激60min组两种因子mRNA的表达分别达到最大值(28.06±0.11)%和(75.20±0.16)%。结论:适当强度及作用时间的工频电磁场刺激,能够明显促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达。     

腹部和大腿皮下脂肪组织抵抗素蛋白的表达

背景:抵抗素是脂肪细胞分泌的一种多肽激素。而中心性肥胖时可引起胰岛素抵抗和导致2型糖尿病。目的:比较正常人腹部和大腿皮下脂肪组织抵抗素蛋白表达的情况,探讨抵抗素在中心性肥胖引起胰岛素抵抗中的作用。设计:对照观察实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院内分泌科。对象:选择2003-01/04华中科技大学同济医学院附属同济医院外科住院患者20例,根据留取脂肪组织的部位分腹部皮下脂肪组织组12例和大腿皮下脂肪组织组8例。方法:①所有患者测量血压、身高、体质量,计算体质量指数,体内脂肪百分比(按白种人数据推导的公式):男性=1.2×体质量(kg) 身高-2(m-2) 0.23×年龄-16.2;女性=1.2×体质量(kg) 身高-2(m-2) 0.23×年龄-5.4。②葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖。③留取的脂肪组织标本用单去污裂解液提取脂肪组织中的蛋白质,考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,Western-blot测量脂肪组织抵抗素蛋白的表达水平。主要观察指标:两组患者的血压、体质量指数,体内脂肪百分比,空腹血糖,抵抗素蛋白的表达水平。结果:纳入患者20例,均进入结果分析。①两组的空腹血糖、收缩压、舒张压、体质量指数、体内脂肪百分比差异无显著性(P>0.05)。②腹部皮下脂肪组织抵抗素蛋白表达(A)为14942±6076,明显高于大腿皮下脂肪组织组39421±6087,二者比较差异显著(P<0.01)。结论:抵抗素蛋白在腹部皮下脂肪组织的表达高于腿部皮下脂肪组织,此结果对中心性肥胖并引起胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生具有参考价值。