全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记

背景：要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节。目的：采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法。方法：通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞。经传代扩增,细胞进一步纯化。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果。利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线。结果与结论：全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱。PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变。结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞的PKH26标记和示踪

背景：骨髓间充质干细胞标记是体内迁移分化研究的重要环节。目的：对大鼠骨髓间充质干细胞进行PKH26标记,探讨PKH26标记对骨髓间充质干细胞的生长特征、分化的影响及体内示踪情况。方法：培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞,第2代细胞按PKH26标记程序进行细胞标记,观察标记组和未标记组细胞的增殖、周期和凋亡情况,对标记组细胞行成骨成脂体外诱导分化。尾静脉移植PKH26标记细胞,6周后荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞在子宫内膜的分布情况。结果与结论：PKH26标记对细胞增殖、凋亡和周期无明显影响,不影响成骨成脂诱导分化。子宫内膜组织中PKH26标记阳性的细胞分布于腺上皮和间质细胞。PKH26标记技术可用于示踪骨髓间充质迁移转归和干细胞移植方面的实验研究。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养与CM-DiI荧光标记

背景：目前,对骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增还没有统一的、标准化的方法。CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。 目的：建立SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及标记的方法。 方法：取2只体质量50-100 g雄性SD大鼠,无菌条件下采集双侧股骨、胫骨骨髓,用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法培养出原代骨髓间充质干细胞,通过及时、反复传代对细胞进行扩增纯化,在体外用荧光活性染料CM-DiI标记第3代骨髓间充质干细胞后作为供体细胞来源。 结果与结论：用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法两种方法均能成功体外分离培养骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪分析,培养出的细胞CD34阳性率为17.5%,CD44阳性率为97.9%、CD90阳性率为91%,与骨髓间充质干细胞表面抗原一致。但培养出的细胞数量全骨髓贴壁分离法明显多于密度梯度离心法,两种方法培养骨髓间充质干细胞的细胞活力和增殖能力无明显差异。CM-DiI能够成功荧光标记骨髓间充质干细胞, CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大.体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要.目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化.结果与结论:大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上.生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃.第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达.成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性.全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义.     

BrdU体外示踪大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:目前还未找到一个理想的标记性分子用来鉴定骨髓间充质干细胞,因此也就不能保证骨髓间充质干细胞的同质性.目的:以BrdU体外示踪标记验证大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后的分化潜能.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/10在山西医科大学完成.材料:4周龄Wistar大鼠由山西医科大学实验动物中心提供.方法:密度梯度离心+贴壁培养法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,达80%融合时胰蛋白酶消化传代扩增.取5×1010L-1个骨髓间充质干细胞接种于25 mm培养皿,加入含地塞米松、β-磷酸甘油、维生素C和体积分数为10%胎生血清的L-DMDM培养基进行成骨诱导.取第3代骨髓间充质干细胞,加入终浓度为10 μmol/L BrdU进行体外示踪,200倍荧光显微镜下随机选取10个视野,通过计数阳性细胞与非阳性细胞数得到BrdU标记率.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面抗原,观察诱导后成骨分化潜能,体外BrdU标记率.结果:分离纯化的骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主,传至第3代争明显的同向性改变,漩涡状盘旋排列,细胞存活率均大于95%,至第7代仍末见细胞生长减缓现象;CD44,CD71,CD105均呈阳性表达,CD45呈阴性表达;成骨诱导后Von kossa染色可见骨髓间充质干细胞中有黑色颗粒沉积;BrdU标记率>90%.结论:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,可在体外长期培养,并具有成骨分化潜能;BndU可成功标记骨髓间充质干细胞,是安全、有效、便捷的体外示踪方法.     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

人骨髓间质干细胞PKH 26荧光标记技术

目的 建立一种PKH26体外荧光标记人骨髓间质干细胞（MSCs）的方法。方法 培养人骨髓间质干细胞，按PKH26标记程序进行标记后培养，采用激光共聚焦显微镜、流式细胞分析，观察标记后人MSCs生长状态、荧光强度变化和传代培养效果。应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）等方法观察标记细胞的生物学功能。结果 标记后MSCs呈红色荧光，标记率达100％，体外连续传代培养7代后，荧光标记细胞荧光强度逐渐减弱，荧光标记细胞百分比逐渐减低。PKH26标记MSCs的生长形态、生长活力、nucleostemin、三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因表达及体外诱导分化能力等生物学特性不发生改变。结论 PKH26荧光标记人MSCs是一种有效、实用的方法，该方法对MSCs转归、可塑性及MSCs移植治疗研究具有重要的价值。     

全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨髓间充质干细胞

背景：体外分离培养出生长状态好、高纯度、增殖能力强和数量充足的大鼠骨髓间充质干细胞,是将其作为种子细胞用于组织和细胞移植的重要前提。 目的：建立简便、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养方法,并观察其生物学特性。 方法：采用全骨髓法将 SD 大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外分离培养,贴壁接种法进行细胞纯化、传代。观察细胞生长形态及特征,绘制细胞生长曲线,检测细胞表面标记物,采用体外诱导剂诱导细胞分别向成骨、成软骨、成脂方向分化。 结果与结论：全骨髓贴壁接种法分离培养的骨髓间充质干细胞生长旺盛、纯度高,细胞生长形态呈长梭形,极性排列,细胞生长呈S形生长曲线,群体倍增时间为29 h,细胞在连续传10代后仍具有较强的增殖能力。第3代骨髓间充质干细胞的表面标记物CD44、CD29、CD90均呈阳性表达,CD45、CD34、CD11b则呈阴性表达。第3代骨髓间充质干细胞分别经成骨、成软骨、成脂诱导剂诱导后,茜素红染色、碱性磷酸酶染色、von-kossa矿化结节染色、甲苯胺蓝染色和油红O染色均呈阳性。结果验证全骨髓贴壁接种法是一种简便可靠的体外分离培养方法,能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,经实验鉴定第3代骨髓间充质干细胞生物活性最佳,且具有多向诱导分化能力,适合作为后续实验的种子细胞。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景:培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提.目的:寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统.第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性.提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验.     

纳米生物探针双标大鼠骨髓间充质干细胞的成活及生长

背景：超顺磁性氧化铁标记可以活体示踪干细胞在动物体内迁徙情况,荧光活性染料DiI对细胞活力和增殖分化影响较小,适合标记和示踪细胞。
　　目的：观察超顺磁性氧化铁及DiI双标骨髓间充质干细胞的效果和安全性。
　　方法：无菌条件下分离大鼠双下肢,低糖DMEM培养液冲出骨髓,运用全骨髓贴壁法体外分离骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。对分离纯化并传代培养的大鼠骨髓间充质干细胞标记超顺磁性氧化铁,细胞移植前进行DiI标记。
　　结果与结论：原代培养8-10 d后可分离得到骨髓间质干细胞,传代周期为三四天,超顺磁性氧化铁-DiI标记率近100%,普鲁士蓝染色显示蓝色铁颗粒位于骨髓间质干细胞胞质内,荧光显微镜下胞浆内示红色荧光,锥虫蓝拒染法检测标记和未标记活细胞数目均在95%左右,说明在含超顺磁性氧化铁-DiI的培养基中骨髓间充质干细胞可继续增殖,细胞形态无明显变化。以上结果显示超顺磁性氧化铁-DiI 可安全有效地标记骨髓间质干细胞。     

Bone marrow

This article describes the composition of bone marrow and the normal progression of bone marrow changes as they occur throughout the aging process, and provides examples of pitfalls and variants that may simulate disease.     

Bone marrow engraftment analysis after allogeneic bone marrow transplantation

BME analysis of allo-BMT patients is used to confirm engraftment and detect MC after transplant. With frequent monitoring, the detection of MC by BME analysis may alert clinicians to a high risk of relapse and allow early intervention with a rapid taper of immunosuppression or DLI therapy. In pancytopenic patients BME analysis can help differentiate relapse from drug toxicity or infection. Although many methods have been used for BME analysis, PCR amplification of STR loci is the choice of many clinical laboratories because it is informative, quantitative, relatively rapid, and sensitive. The sensitivity of BME analysis is dependent upon many factors that need to be optimized by the laboratory performing the analysis. Although BME analysis is complex, the clinical significance for allo-BMT patients warrants the effort to develop, validate, and perform BME analysis in support of the allo-BMT service.